In vitro에서 급성 고립된 성인 미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성을 특성화하기 위한 유세포 분석 접근법

요약

미세아교세포와 뇌 대식세포의 식세포 특성 평가는 분자 프로파일링 연구에 중요한 기능적 차원을 제공할 수 있습니다. 우리는 유세포 분석을 사용하여 마우스 모델에서 급성 분리된 미세아교세포와 뇌 대식세포에 의한 형광 미세구 및 아밀로이드 베타 피브릴의 식세포작용을 빠르고 안정적으로 정량화하는 검증된 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

총칭하여 CNS 단핵 식세포(CNS-MP)라고 하는 미세아교세포와 중추신경계(CNS) 침투 대식세포는 신경변성 및 뇌졸중을 포함한 신경 질환에서 중심적인 역할을 합니다. CNS-MP는 병리학적 단백질, 파편 및 신경 세포 시냅스의 식세포 제거에 관여하며, 각각 고유한 기본 분자 경로를 가지고 있습니다. 이러한 식세포 특성을 특성화하면 기존의 유세포 분석, 전사체학 및 단백질체학 접근법을 사용하여 미세아교세포의 분자 프로파일링을 보완하는 기능적 판독값을 제공할 수 있습니다. 미세아교세포의 식세포 프로파일링은 마우스 신생아 미세아교세포의 현미경 시각화와 체외 배양에 의존해 왔습니다. 전자의 접근법은 제한된 샘플링으로 어려움을 겪는 반면, 후자의 접근법은 본질적으로 성인 CNS-MP의 실제 생체 내 상태를 제대로 반영하지 못합니다. 이 논문은 유세포 분석을 통해 급성 분리된 마우스 CNS-MP의 식세포 특성을 표현형하기 위한 최적화된 프로토콜에 대해 설명합니다. CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배 원심분리를 사용하여 성체 쥐의 뇌에서 급성으로 분리하고, 형광 미세구 또는 형광 Aβ 원섬유로 배양하고, 세척한 다음, 표면 마커(CD11b, CD45)에 대한 항체 패널로 표지합니다. 이 접근법을 사용하면 뇌 상주 미세아교세포와 CNS 침투 대식세포의 식세포 특성을 비교한 다음 이러한 식세포 표현형에 대한 노화 및 질병 병리의 영향을 평가할 수 있습니다. 이 신속한 방법은 또한 사후 검시 또는 수술 뇌 표본에서 급성으로 분리된 인간 CNS-MP를 기능적으로 표현형화할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 또한, CNS-MP subset에 의한 식세포작용의 특정 메커니즘은 선택적 식세포 경로를 억제하여 조사할 수 있습니다.

서문

중추신경계(CNS)의 선천성 면역 세포는 주로 미세아교세포와 침윤 단핵구/대식세포로 구성되며, 이를 통틀어 CNS-단핵 식세포(CNS-MPs)라고 합니다¹. CNS-MP는 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 신경염증성 질환, 뇌졸중과 같은 신경퇴행성 질환과 관련이 있다 ^2,3,4. CNS-MP는 성상세포(astrocyte), 주위세포(pericyte) 및 뇌실막세포(ependymal cell)와 함께 식세포 기능을 가지고 있습니다 ^5,6. 항상성 상태에서 CNS-MP는 자가사멸 세포 파편 및 단백질의 식세포 제거, 뉴런 연결을 리모델링하기 위한 시냅스 가지치기와 함께 국소 미세환경에 대한 지속적인 감시에 관여합니다 7,8,9,10. 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환에서 CNS-MP는 응집된 아밀로이드-베타(Aβ) 및 신경 요소의 제거, 염증성 사이토카인 및 인자 방출을 포함한 병리학적 역할을 할 수 있는 뚜렷한 질병 관련 분자 및 기능적 표현형을 채택하여 복잡한 전염증, 해로운 및 항염증, 보호 역할을 수행할 수 있습니다 11,12,13,14. CNS-MP에 의한 거대 입자, 세포 파편, 단백질 및 기타 감염 입자의 식세포작용은 표면에 발현되는 별개의 수용체에 의해 매개됩니다⁹. 이러한 식세포 경로의 붕괴는 결함 제거와 Aβ의 점진적인 축적으로 이어질 수 있으며, 궁극적으로 AD ^4,9에서 진행성 신경 세포 손상으로 이어질 수 있습니다. 전사체(transcriptomic) 및 단백질체학(proteomic) 접근법을 사용한 CNS-MP의 분자 프로파일링의 발전은 신경 질환에서 CNS-MP 내의 분자 이질성에 대한 귀중한 통찰력을 제공했지만(^15,16), CNS-MP와 그 하위 집합의 식세포 특성에 대한 기능적 특성화는 현재 부족합니다. CNS-MP의 식세포 특성의 기능적 특성화는 분자 프로파일링 전략을 보완하고, 더 나은 기능적 표현형을 촉진하며, 질병 모델에서 결함 있는 식세포작용을 교정할 수 있는 치료제의 효능을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다¹⁷.

CNS-MP에 대한 전통적인 식세포작용 분석법에는 Aβ 또는 라텍스/폴리스티렌 입자와 같은 형광 기질과 함께 1차 미세아교세포를 배양하는 것이 포함됩니다. 그런 다음 식세포작용(phagocytosis)을 면역형광 현미경 검사법을 사용하여 형광 기질의 흡수 함수로 연구합니다 18,19,20. CNS-MP가 긴 배양에서 유지될 때 형태와 전사 프로파일을 극적으로 변화시킬 수 있다는 것은 잘 알려진 사실입니다^21,22. 이는 CNS-MP의 대리 상태에서 CNS-MP의 식세포 특성을 연구하는 데 방해가 됩니다. 급성 분리된 살아있는 CNS-MP를 프로파일링하기 위한 기능적 유세포 분석 분석은 식세포 특성을 신속하게 평가할 수 있으며 현미경 접근 방식보다 훨씬 더 큰 CNS-MP 풀을 샘플링할 수 있습니다 ^9,23. 또한, 유세포 분석은 배양에서 CNS-MP를 유지할 필요성을 없앨 뿐만 아니라 CNS-MP의 다양한 하위 집단에서 식세포 특성을 연구할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 이 원고는 유세포 분석을 통해 급성으로 분리된 마우스 CNS-MP의 식세포 특성을 표현형하기 위한 최적화된 프로토콜을 설명합니다. 유세포 분석을 사용하여 phagocytosis assay를 조정하면 면역 표현형과 결합된 CNS-MP의 phagocytic 표현형을 신속하게 multiplexing할 수 있으므로 단일 세포 분해능에서 CNS-MP 내 phagocytic 특성의 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

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프로토콜

모든 마우스 연구는 Emory University의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받은 후 수행되었으며 National Institutes of Health의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 격리 당일의 준비

1. 분리 절차 전반에 걸쳐 모든 시약, 완충액 및 세포 현탁액을 차갑게 유지하기 위해 얼음 양동이를 준비합니다.
2. 관류 전 30분에서 1시간 동안 4°C에서 1× 인산염 완충 식염수(PBS) 병(최소 1L)을 놓고 관류 및 분리 절차 동안 1× PBS를 얼음 위에 보관합니다.
3. 밀도 구배 매체의 작업 농도를 준비합니다(35% SIP라고 함, 재료 표 참조).
4. 세포 분리 전에 실험에 사용된 모든 원뿔형 및 유세포 분석 튜브에 라벨을 부착하여 처리 시간 지연을 방지합니다. 또한 관류 전에 분리에 필요한 다른 모든 공급품(예: 40μm 세포 여과기, 주사기 및 바늘)을 수집합니다.

2. 성체 마우스 미세아교세포의 급성 격리

1. 성체 쥐가 호흡을 멈추고 뒷다리 발 꼬집음에 반응하지 않을 때까지 이소플루란(5mL)이 함유된 유리 유도 챔버에 마우스를 넣어 마취합니다.
2. 26G 바늘과 10mL 주사기를 사용하여 30mL의 얼음처럼 차가운 1× PBS로 시각적 혈액이 없을 때까지 심장 관류를 수행합니다.
3. 수술 용 가위로 마우스의 목을 베십시오. 작은 가위를 사용하여 피부를 잘라 두개골을 노출시킵니다. 설명된 대로 뇌 조직을 손상시키지 않고 두개골을 제거합니다²⁴. 즉시 뇌를 제거하고 50mL 원뿔형 튜브 위에 놓인 멸균 40μm 세포 여과기로 옮깁니다.
4. 3mL 주사기의 플런저 뒷면을 사용하여 스트레이너를 통해 뇌를 밀어 넣고 전체 뇌 조직을 기계적으로 해리합니다. 해리 중에 세포 스트레이너와 플런저를 간헐적으로 세척할 때마다 얼음처럼 차가운 1×PBS 2mL를 사용하여 모든 조직이 스트레이너를 통과하도록 합니다.
5. 플런저로 셀 스트레이너의 바닥을 긁어 잔류 현탁액을 원뿔형으로 수집합니다. 얼음처럼 차가운 1× PBS로 셀 스트레이너를 완전히 세척하고 현탁액을 50mL 원뿔형 튜브에 붓습니다.
   참고: 여러 동물을 직렬로 처리할 때는 추가 처리가 있을 때까지 세포 현탁액을 얼음 위에 놓으십시오.
6. 얼음처럼 차가운 1× PBS를 추가하여 세포 현탁액을 30mL로 늘리고 800×g에서 4°C에서 5 분 동안 원 심분리합니다.
7. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 붓고 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 35% SIP 6mL에 펠릿을 다시 현탁합니다. 셀 현탁액 + 35% SIP 혼합물을 새로운 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 800× g 의 원심분리기를 브레이크 없이 15°C에서 25분 동안 가열합니다.
   주의 : 재서스펜션 중에 기포가 유입되지 않도록 특히 주의하십시오. 과도한 기포는 세포 수율에 해로울 수 있습니다.
8. 층을 방해하지 않고 원심분리기에서 15mL 원뿔형 튜브를 조심스럽게 제거하고 상단 부동 미엘린 층을 흡인합니다.
9. 10mL 혈청 피펫을 사용하여 세포 현탁액 + 35% SIP 혼합물을 30mL의 얼음처럼 차가운 1× PBS와 800×g의 원심분리가 포함된 새로운 50mL 코니컬 튜브로 4°C에서 5 분 동안 옮 깁니다. 상층액을 조심스럽게 붓고 500\u2012800 μL의 1× PBS와 함께 세포 펠릿을 남깁니다.
10. p1000 피펫으로 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포 펠릿을 다시 현탁시키고 5mL 원형 바닥 튜브로 옮깁니다. 둥근 바닥 튜브에 얼음처럼 차가운 1× PBS 2mL를 넣고 1,400×g의 4°C에서 2 분 동안 원 심분리합니다. CNS-MP가 포함된 세포 펠릿을 약 100μL의 1× PBS에 남겨두고 상등액을 빠르게 붓습니다(그림 1).

3. 식세포작용(Phagocytosis) 설정 및 유세포 분석 염색(flow cytometric staining)

1. 재현탁된 CNS-MP 20μL(≈200,000개 세포)를 새로운 5mL 원형 바닥 튜브로 옮기고 80μL의 얼음처럼 차가운 1× PBS를 추가합니다. 이 튜브에 형광 기질 또는 유세포 분석 항체를 추가하지 마십시오. 이 세포는 유세포 분석을 위한 CNS-MP의 배경 형광을 측정하기 위한 음성 대조군 역할을 합니다.
2. 분리된 CNS-MP의 생존력을 확립하려면 아민 기반 생/사체 염료(예: Fixable Blue UV)를 사용하십시오.
   1. 나머지 세포 펠릿을 500μL의 1×PBS에 재현탁시키고 음성 대조군을 제외한 각 샘플 튜브에 1μL의 재구성된 염료를 추가합니다.
   2. 부드럽게 소용돌이치고 튜브를 호일로 덮고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 그런 다음 각 튜브에 1× PBS 1mL를 넣고 부드럽게 와류를 칩니다.
   3. 1,400 × g 에서 4°C에서 2분 동안 셀을 원심분리합니다. 상층액을 빠르게 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1× PBS에 다시 현탁시킵니다.
      참고: 아민 기반 염료는 세포외 Aβ 원섬유에 결합하여 식세포작용의 결과를 혼동합니다. 다른 live/dead 지표는 Aβ 원섬유/미세구의 형광을 방해할 수 있습니다. 따라서 분리된 CNS-MP의 생존 가능성을 확립하기 위해 예비 실험에서만 Live/dead 지표를 사용하는 것이 좋습니다.
3. PE-폴리스티렌 미세구가 포함된 튜브를 철저히 와류로 처리하고, 네거티브 대조군을 제외한 플로우 튜브의 100μL의 세포 현탁액에 2 μL(≈200 마이크로스피어/셀)를 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치게 하여 기질과 세포가 균등하게 분포되도록 하고 둥근 바닥 튜브를 30°C에서 37% CO₂로 3분 동안 멸균 가습 인큐베이터에 넣습니다.
   1. 음성 제어 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 배양하여 양성 샘플과 음성 샘플 간에 유사한 실험 조건을 보장합니다.
      참고: PE 미세구 대신 Aβ 원섬유를 사용하는 경우 앞서 설명한 대로 형광 HiLyte488 Aβ 원섬유를 준비합니다⁹. Aβ 피브릴의 최종 농도는 200μM이며, 이를 희석하여 형광 Aβ 단량체의 PBS에 새로운 20μM 스톡을 준비합니다. 분리된 세포를 포함하는 각 튜브에 20μM 스톡 Aβ 단량체 12.5μL를 추가합니다.
4. 인큐베이터에서 세포를 제거하고 각 튜브에 1× PBS 1mL를 추가하고 부드럽게 와류를 칩니다. 1,400 × g의 세포를 4 °C에서 2 분 동안 원심 분리하고 상층액을 빠르게 붓습니다. 1mL 1× PBS로 세척을 반복하고 1,400 × g 에서 2분 동안 원심분리한 후 상층액을 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1×PBS에 다시 현탁시킵니다.
   참고: 각 회전 후에는 지속적인 식세포 흡수를 억제하기 위해 세포를 얼음 위에 유지하는 것이 중요합니다.
5. 유세포 분석 항체를 소용돌이치고 마이크로 원심분리기에서 10초 동안 원심분리합니다. 각 세포 부유 튜브에 Aβ 식작용 분석을 위해 CD11b-APC/Cy7 및 CD45-PE/Cy7을 각각 1μL씩 첨가하거나 PE-마이크로스피어 식작용작용의 경우 CD45-FITC를 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치고 실온에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
   참고: 사용자는 배양된 BV2 미세아교세포 또는 복막 대식세포와 같은 강력한 식세포 세포를 포함하는 별도의 튜브를 양성 대조군으로 포함하고 위에서 설명한 대로 PE 마이크로스피어 및 유세포 분석 항체로 처리할 수도 있습니다. 이 샘플의 데이터는 예비 실험에서 진정한 식세포작용(phagocytosis)을 나타내는 양성 대조군을 정의하는 데 사용할 수 있습니다.
6. 세포가 배양되는 동안 4개의 둥근 바닥 5mL 유류 튜브를 사용하여 보상 튜브를 설정합니다. 보상 비드를 완전히 와류로 만들고 각 튜브에 1방울을 추가합니다. 첫 번째 튜브에 1μL의 CD11b-APC/Cy7을 추가하고 두 번째 튜브에 CD45-FITC를 추가합니다. 세 번째 튜브에 1μL의 PE-폴리스티렌을 추가하고 네 번째 튜브에 염색되지 않은 보상 비드를 유지합니다. 이 네 번째 튜브를 negative control로 사용하여 유세포 분석기에 compensation panel을 설정합니다.
   참고: Aβ 피브릴을 사용하여 식세포작용을 연구하는 경우 CD45-FITC 대신 CD45-PECy7을 두 번째 튜브에 추가합니다. 세 번째 보상 튜브에 1 μL의 별도 FITC 태그 유세포 분석 항체 또는 FITC-2차 항체(모든 종)를 추가합니다. 이는 비드가 Aβ 피브릴에 결합할 수 없고 보상 튜브를 세척할 때 씻겨 나가기 때문에 중요합니다.
7. 보상 비드가 최소 10분 동안 각각의 항체와 함께 배양하도록 합니다. 배양 후 각 튜브에 1× PBS 1mL를 첨가하고 4°C에서 2분 동안 1,400 x g 에서 원심분리한 후 상등액을 빠르게 붓습니다. 보상 튜브를 얼음 위에 놓고 유세포 분석이 나올 때까지 호일로 덮습니다.
8. 유세포 분석 항체를 배양한 후 염색된 세포를 1× PBS 1mL로 세척합니다. 1,400 × g 의 세포를 4 °C에서 2 분 동안 부드럽게 와류시키고 원심 분리합니다. 상층액을 빠르게 붓고 1mL 1×PBS로 세척을 반복합니다. 원심분리 후 상층액을 붓고 세포 펠릿을 100μL의 1× PBS에 다시 현탁시킵니다.
9. 샘플 튜브를 얼음 위에 놓고 유세포 분석이 이루어질 때까지 알루미늄 호일로 덮습니다.
   참고: 실험 전반에 걸쳐 흐름 버퍼로 Ca²⁺/Mg²⁺ 없이 1× PBS(pH 7.0)를 사용합니다. 미세아교세포(microglial) 활성화 가능성을 피하기 위해 흐름 완충액에서 소 태아 혈청(FBS)을 제외해야 합니다.

4. 유세포 분석 및 분석

1. 기기 설정 및 보정
   참고: 이 원고의 실험은 자외선, 보라색, 청색, 황록색 및 적색 레이저를 사용하여 유세포 분석기에서 수행되었습니다. 이 실험은 청색, 황록색 및 적색 레이저만 있는 3 레이저 유세포 분석기에도 적용할 수 있습니다. 사용자는 기기를 다루기 전에 공식 교육을 받아야 합니다.
   1. 유동 덮개 버퍼 탱크를 다시 채우고 세포 분석기를 켭니다. ddH₂O가 들어있는 5mL 둥근 바닥 유동 튜브로 유세포 분석기를 "프라임"합니다. 유세포 분석기에 연결된 컴퓨터의 분석 소프트웨어에 로그인합니다. "실험"을 만들고 FSC, SSC, FITC, PECy7 및 APC-Cy7을 매개변수로 선택합니다. PE 마이크로스피어를 사용하는 경우 매개변수 패널에서 PECy7 대신 PE를 선택합니다.
   2. 적절한 보정 패널을 만듭니다.
      참고: 실험에서 일반적으로 보상 비드의 FSC/SSC 전압은 약 350/280인 반면 CNS-MP의 FSC/SSC 전압은 약 320/260입니다. 이 값은 두 개의 서로 다른 세포 분석기 간에 다를 수 있으며 실제 실험 전에 보정해야 합니다.
   3. 각 보상 튜브와 세포 현탁 튜브를 500μL의 1× PBS로 재구성하고 잠시 와류를 일으킨 다음 얼음 위에 놓습니다. negative control/unstained bead tube를 실행하여 각 형광단 히스토그램의 피크가 10² 미만이 되도록 적절한 전압을 설정합니다. 다른 단색 compensation tube를 실행하여 뚜렷한 positive peak를 식별합니다.
      참고: 각 형광단의 positive peak와 negative peaks 사이에는 최소한 절반 log(base 10) 차이가 있어야 합니다.
   4. 컴퓨터가 보상 설정을 자동으로 계산할 수 있도록 각 보상 튜브에서 5000개의 이벤트를 기록합니다. 보상 설정을 현재 실험(²⁵)에 연결한다.
   5. 샘플 탭 아래에 새 "튜브"를 만듭니다. 염색되지 않은 CNS-MP가 들어 있는 음의 제어 튜브를 부드럽게 와류로 돌리고 실행합니다. 순방향 및 측면 산란 전압을 조정하여 관심 모집단을 캡처합니다. 아래에 언급된 대로 라이브 CNS-MP에서 이벤트와 서브 게이트를 기록합니다.
   6. 모든 후속 튜브의 이벤트를 별도의 파일로 캡처하고 기록하여 매개변수와 전압을 일관되게 유지합니다. 유세포 분석기에서 실행하기 전에 각 튜브를 부드럽게 소용돌이치십시오.
2. 게이팅 전략과 phagocytosis의 측정
   1. 모든 CNS-MP를 포획하기 위해 초기 단핵 게이트를 그립니다. 이러한 살아있는 단핵 세포는 커플렛과 트리플렛을 제외한 단일 세포만 포함하도록 다음 그래프에서 게이트되어야 합니다.
   2. 게이트된 단일 라이브 CNS-MP 집단을 CD11b 및 CD45 형광단을 표시하는 후속 그래프에 투영합니다.
      참고: 뇌에 상주하는 미세아교세포는 일반적으로 CD11b⁺CD45^중간체인 반면, 침투 대식세포는 CD11b⁺CD45^높음입니다. Ly6c와 같은 추가 마커를 패널에 포함하여 염증성 단핵구(Ly6c^높음 및 CD45^높음)와 미세아교세포(Ly6c^낮음 CD45^중간)를 더욱 확실하게 분리할 수 있습니다.
   3. 그림 2F와 같이 각 집단에서 식세포작용(phagocytosis)을 추가로 연구하기 위해 적절한 게이트를 적용합니다.
      참고: CNS-MP의 식세포작용은 Hilyte488/Alexa488(Aβ) 또는 PE(마이크로스피어) 형광 흡수의 함수로 측정됩니다. 각각의 히스토그램에서 뚜렷한 positive peak는 CNS-MP가 기질을 식세포화했음을 나타냅니다. phagocytosed 물자의 양은 형광의 강렬에 정비례합니다. 따라서 여러 피크의 존재는 더 높은 식세포작용으로 해석되어야 합니다. 이는 이후에 면역조직화학에 의해 확인될 수 있습니다.
   4. 유세포 분석기에 모든 샘플 튜브를 기록한 후 추가 분석을 위해 데이터 파일을 .fcs 형식으로 내보냅니다.
3. 통계 데이터 분석
   1. 모든 데이터 분석을 위해 스프레드시트 및 통계 분석 소프트웨어와 함께 유세포 분석 소프트웨어를 사용하십시오.
   2. .fcs 파일을 해석 소프트웨어에 추가하고 첫 번째 파일을 두 번 클릭합니다. 기록된 모든 항목을 표시하는 그래프
      이벤트가 나타납니다. 그림 2 에 표시된 것과 유사한 게이팅 전략을 따라 살아있는 단핵 세포를 게이트하고 특정 집단(예: CD11b⁺CD45^중간 미세아교세포)에 대한 식세포작용을 연구합니다(그림 2H).
      참고: 식세포 지수는 형광 Aβ 원섬유(fibril) 또는 ≥1 마이크로스피어(microsphere)를 내재화하는 세포의 비율을 기준으로 평가됩니다. 앞서 정의한 바와 같이, lowlevel phagocytosis는 최소 1 microsphere의 흡수이고 high-level phagocytosis는 >1 bead uptake ^8,9입니다. 선행 실험에 의하면, cytochalasin D에 의한 actin-dependent process의 억제는 >1 bead upup을 완전히 억제하고 1 bead uptake⁹를 부분적으로 억제할 뿐만 아니라 Aβ uptake를 완전히 억제하여 세포 표면에 대한 passive binding이 아닌 actin-dependent phagocytic upup을 확인하였다. Immunocytochemistry는 또한 마이크로스피어 분석의 각 순차적 피크가 ^8,9 식^{세포화된 비드} 수의 단일 증가를 나타낸다는 것을 확인합니다.

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결과

급성 고립된 CNS-MP에 의한 미세구 및 Aβ42 피브릴의 식세포 흡수의 전형적인 결과를 예시하기 위해, 과도성 중대뇌동맥 폐색(MCAO^{) 8} 후 동측 반구에서 급성 고립된 CNS-MP를 얻었습니다. MCAO 모델에서 CNS-MP의 식세포 특성에 대한 자세한 내용은 이전 간행물⁸을 참조하십시오. 간단히 말해서, 72시간의 회복 후 CNS-MP는 기계적 해리 후 밀도 구배...

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토론

유세포 분석(Flow-cytometry)은 형광 표지 프로브(일반적으로 항체)를 사용하여 세포 표면 또는 세포 내 구획에서 관심 있는 단백질 또는 마커의 발현을 검출하여 이러한 관심 마커를 라벨링할 수 있는 기술입니다. 세포 표면 또는 세포 내 항체는 일반적으로 고유한 방출 스펙트럼을 가진 레이저 여기성 형광 색소와 결합됩니다. 이러한 항체로 배양된 세포는 이러한 마커의 발...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.