Approccio di citometria a flusso per caratterizzare le proprietà fagocitiche della microglia adulta acutamente isolata e dei macrofagi cerebrali in vitro

Riepilogo

La valutazione delle proprietà fagocitiche della microglia e dei macrofagi cerebrali può fornire una preziosa dimensione funzionale agli studi di profilazione molecolare. Descriviamo un protocollo convalidato che utilizza la citometria a flusso per quantificare in modo rapido e affidabile la fagocitosi di microsfere fluorescenti e fibrille di amiloide-beta da parte di microglia e macrofagi cerebrali isolati acutamente da modelli murini.

Abstract

Le microglia e i macrofagi infiltranti il sistema nervoso centrale (SNC), chiamati collettivamente fagociti mononucleati del SNC (CNS-MP), svolgono un ruolo centrale nelle malattie neurologiche, tra cui la neurodegenerazione e l'ictus. Le CNS-MP sono coinvolte nella clearance fagocitaria di proteine patologiche, detriti e sinapsi neuronali, ciascuna con percorsi molecolari sottostanti distinti. La caratterizzazione di queste proprietà fagocitiche può fornire una lettura funzionale che completa la profilazione molecolare della microglia utilizzando i tradizionali approcci di citometria a flusso, trascrittomica e proteomica. La profilazione fagocitaria della microglia si è basata sulla visualizzazione microscopica e su colture in vitro di microglia neonatale di topo. Il primo approccio soffre di un campionamento limitato, mentre il secondo approccio è intrinsecamente scarsamente riflettente del vero stato in vivo delle SNC-MP adulte. Questo articolo descrive protocolli ottimizzati per fenotipizzare le proprietà fagocitiche di CNS-MP di topo isolato acutamente mediante citometria a flusso. Le CNS-MP sono isolate in modo acuto dal cervello di topo adulto mediante dissociazione meccanica seguita da centrifugazione in gradiente di densità, incubate con microsfere fluorescenti o fibrille fluorescenti Aβ, lavate e quindi marcate con pannelli di anticorpi contro marcatori di superficie (CD11b, CD45). Utilizzando questo approccio, è possibile confrontare le proprietà fagocitiche delle microglia residenti nel cervello con i macrofagi infiltranti il SNC e quindi valutare l'effetto dell'invecchiamento e della patologia della malattia su questi fenotipi fagocitici. Questo metodo rapido ha anche il potenziale per fenotipizzare funzionalmente le SNC-MP umane isolate in modo acuto da campioni cerebrali post-mortem o chirurgici. Inoltre, i meccanismi specifici della fagocitosi da parte di sottogruppi di CNS-MP possono essere studiati inibendo vie fagocitiche selezionate.

Introduzione

Le cellule immunitarie innate del sistema nervoso centrale (SNC) sono prevalentemente costituite da microglia e monociti/macrofagi infiltranti, chiamati insieme fagociti mononucleati del SNC (SNC-MP)¹. Le SNC-MP sono implicate in malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD), i disturbi neuroinfiammatori e l'ictus ^2,3,4. Le SNC-MP, insieme agli astrociti, ai periciti e alle cellule ependimali, hanno funzioni fagocitiche ^5,6. Nel loro stato omeostatico, le SNC-MP sono coinvolte nella sorveglianza costante del microambiente locale, insieme alla clearance fagocitaria di detriti cellulari apoptotici e proteine e alla potatura sinaptica per rimodellare le connessioni neuronali 7,8,9,10. Nelle condizioni neurodegenerative come l'AD, le SNC-MP adottano fenotipi molecolari e funzionali distinti associati alla malattia che possono svolgere ruoli patologici tra cui la clearance dell'amiloide-beta aggregata (Aβ) e degli elementi neuronali, nonché il rilascio di citochine e fattori infiammatori, con conseguente complesso ruolo pro-infiammatorio, dannoso e antinfiammatorio, protettivo 11,12,13,14. La fagocitosi di macroparticelle, detriti cellulari, proteine e altre particelle infettive da parte dei CNS-MP è mediata da recettori distinti espressi sulla loro superficie⁹. L'interruzione di queste vie fagocitiche può portare a una clearance difettosa e all'accumulo progressivo di Aβ, portando infine a un danno neuronale progressivo in AD ^4,9. Mentre i progressi nella profilazione molecolare delle SNC-MP utilizzando approcci trascrittomici e proteomici hanno fornito preziose informazioni sull'eterogeneità molecolare all'interno delle SNC-MP nelle malattie neurologiche^15,16, la caratterizzazione funzionale delle proprietà fagocitiche delle SNC-MP e dei loro sottogruppi è attualmente carente. La caratterizzazione funzionale delle proprietà fagocitiche delle SNC-MP può integrare le strategie di profilazione molecolare, facilitare una migliore fenotipizzazione funzionale e aiutare a valutare l'efficacia delle terapie in grado di correggere la fagocitosi difettosa nei modelli di malattia¹⁷.

I saggi tradizionali di fagocitosi per le MP del SNC includono l'incubazione della microglia primaria insieme a substrati fluorescenti come Aβ o particelle di lattice/polistirene. La fagocitosi viene quindi studiata in funzione dell'assorbimento del substrato fluorescente mediante microscopia a immunofluorescenza 18,19,20. È ben noto che le SNC-MP, se mantenute in colture lunghe, possono modificare drasticamente la loro morfologia e i profili trascrizionali^21,22. Ciò ostacola lo studio delle proprietà fagocitiche dei SNC-MP nel loro stato rappresentativo nel SNC. Un test di citometria a flusso funzionale per profilare CNS-MP vive isolate in modo acuto può fornire una rapida valutazione delle proprietà fagocitiche e può campionare un pool molto più ampio di CNS-MP rispetto agli approcci microscopici ^9,23. Inoltre, la citometria a flusso elimina la necessità di mantenere le SNC-MP in coltura e fornisce una piattaforma per studiare le proprietà fagocitotiche in diverse sottopopolazioni di SNC-MP. Questo manoscritto descrive protocolli ottimizzati per fenotipizzare le proprietà fagocitiche di CNS-MP di topo isolato acutamente mediante citometria a flusso. L'adattamento dei saggi di fagocitosi mediante citometria a flusso consente un rapido multiplexing del fenotipo fagocitario delle SNC-MP abbinato alla fenotipizzazione immunitaria, fornendo così informazioni sull'eterogeneità delle proprietà fagocitiche all'interno delle SNC-MP alla risoluzione di una singola cellula.

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Protocollo

Tutti gli studi sui topi sono stati condotti dopo aver ottenuto l'approvazione dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) della Emory University e in stretta conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del National Institutes of Health.

1. Preparazione il giorno dell'isolamento

1. Preparare un secchiello del ghiaccio per mantenere freddi tutti i reagenti, i tamponi e le sospensioni cellulari durante la procedura di isolamento.
2. Porre il flacone di soluzione salina tamponata con fosfato all'1× (PBS) (almeno 1 L) a 4 °C per 30-1 ora prima della perfusione e mantenere 1× PBS sul ghiaccio durante la procedura di perfusione e isolamento.
3. Preparare la concentrazione di lavoro del mezzo del gradiente di densità (indicato come 35% SIP, vedere la tabella dei materiali).
4. Etichettare tutte le provette coniche e per citometria a flusso utilizzate nell'esperimento prima dell'isolamento cellulare per evitare ritardi nei tempi di elaborazione. Inoltre, raccogliere tutte le altre forniture necessarie per l'isolamento prima della perfusione, come filtri cellulari da 40 μm, siringhe e aghi.

2. Isolamento acuto di microglia adulta di topo

1. Anestetizzare un topo adulto posizionandolo in una camera di induzione di vetro con isoflurano (5 ml) fino a quando il topo smette di respirare e non risponde al pizzicamento della zampa posteriore.
2. Utilizzare un ago da 26 G e una siringa da 10 ml per eseguire la perfusione cardiaca con 30 ml di PBS 1× ghiacciato fino a quando non vi è sangue visibile.
3. Decapita il topo con le forbici chirurgiche. Usa piccole forbici per tagliare la pelle, esponendo il cranio. Rimuovere il cranio senza danneggiare il tessuto cerebrale come descritto²⁴. Rimuovere immediatamente il cervello e trasferirlo in un colino cellulare sterile da 40 μm posizionato sopra una provetta conica da 50 mL.
4. Utilizzare la parte posteriore dello stantuffo di una siringa da 3 ml per spingere il cervello attraverso il filtro e dissociare meccanicamente l'intero tessuto cerebrale. Lavare il filtro cellulare e lo stantuffo in modo intermittente durante la dissociazione con 2 ml di PBS ghiacciato all'1× ogni volta per garantire che tutto il tessuto passi attraverso il filtro.
5. Raschiare il fondo del filtro a celle con lo stantuffo per raccogliere eventuali residui di sospensione nella conica. Sciacquare accuratamente il filtro cellulare con 1× PBS ghiacciato e versare la sospensione nella provetta conica da 50 mL.
   NOTA: Quando si lavorano più animali in serie, posizionare le sospensioni cellulari sul ghiaccio fino a un'ulteriore lavorazione.
6. Aggiungere 1× PBS ghiacciato per portare il volume della sospensione cellulare a 30 mL e centrifugare a 800 × g per 5 minuti a 4 °C.
7. Versare il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 6 mL di SIP al 35% con una pipetta sierologica da 10 mL. Trasferire la sospensione cellulare + miscela SIP al 35% in una nuova provetta conica da 15 mL e centrifugare a 800 × g per 25 min a 15 °C senza freni.
   ATTENZIONE: Prestare particolare attenzione per evitare l'introduzione di bolle durante la risospensione. Bolle eccessive possono essere dannose per la resa cellulare.
8. Rimuovere con cautela la provetta conica da 15 mL dalla centrifuga senza disturbare gli strati e aspirare lo strato di mielina galleggiante superiore.
9. Trasferire la sospensione cellulare + miscela SIP al 35% utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL in una nuova provetta conica da 50 mL contenente 30 mL di PBS 1× ghiacciato e centrifugare a 800 × g per 5 minuti a 4 °C. Versare con cura il surnatante, lasciando dietro di sé il pellet cellulare insieme a 500\u2012800 μl di 1× PBS.
10. Risospendere il pellet cellulare pipettandolo delicatamente su e giù con una pipetta p1000 e trasferirlo in una provetta a fondo tondo da 5 mL. Aggiungere 2 mL di 1× PBS ghiacciato alla provetta a fondo tondo e centrifugare a 1.400 × g per 2 minuti a 4 °C. Versare rapidamente il surnatante, lasciando il pellet cellulare contenente CNS-MP in circa 100 μl di 1× PBS (Figura 1).

3. Impostazione della fagocitosi e colorazione citofluorimetrica

1. Trasferire 20 μl (≈200.000 cellule) di CNS-MP ri-suspended in una provetta inferiore rotonda da 5 mL e aggiungere 80 μl di PBS 1× ghiacciato. Non aggiungere substrati fluorescenti o anticorpi per citometria a flusso a questa provetta. Queste cellule fungono da controllo negativo per determinare la fluorescenza di fondo delle SNC-MP per le analisi di citometria a flusso.
2. Per stabilire la vitalità delle SNC-MP isolate, utilizzare coloranti vivi/morti a base di ammine (ad esempio, Fixable Blue UV).
   1. Risospendere il resto del pellet cellulare in 500 μl di 1× PBS e aggiungere 1 μl del colorante ricostituito a ciascuna provetta del campione, ad eccezione del controllo negativo.
   2. Agitare delicatamente, coprire le provette con un foglio di alluminio e incubarle a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, aggiungere 1 mL di PBS 1× a ciascuna provetta e agitare delicatamente.
   3. Centrifugare le celle a 1.400 × g per 2 minuti a 4 °C. Versare rapidamente il surnatante e risospendere il pellet di cella in 100 μl di 1× PBS.
      NOTA: I coloranti a base di ammine si legano alle fibrille Aβ extracellulari confondendo i risultati della fagocitosi. Altri indicatori vivi/morti potrebbero interferire con la fluorescenza di fibrille/microsfere Aβ. Pertanto si consiglia di utilizzare l'indicatore vivo/morto solo in esperimenti preliminari per stabilire la vitalità dei CNS-MP isolati.
3. Agitare accuratamente la provetta contenente microsfere di polistirene PE e aggiungere 2 μl (≈200 microsfere/cella) a 100 μl di sospensione cellulare in provette di flusso, ad eccezione del controllo negativo. Agitare delicatamente ogni provetta per garantire una distribuzione uniforme del substrato con le cellule e posizionare le provette a fondo tondo in un incubatore sterile umidificato per 30 minuti a 37 °C con il 5% di CO₂.
   1. Agitare delicatamente e incubare la provetta di controllo negativo per garantire condizioni sperimentali simili tra campioni positivi e negativi.
      NOTA: Se si utilizzano fibrille Aβ invece di microsfere PE, preparare fibrille fluorescenti HiLyte488 Aβ come descritto in precedenza⁹. La concentrazione finale di fibrille Aβ è di 200 μM, che viene poi diluita per preparare un nuovo stock da 20 μM in PBS di monomeri Aβ fluorescenti. Aggiungere 12,5 μl dei 20 μM di monomeri Aβ stock a ciascuna provetta contenente cellule isolate.
4. Rimuovere le cellule dall'incubatore e aggiungere 1 mL di PBS all'1× a ciascuna provetta e agitare delicatamente. Centrifugare le celle a 1.400 × g per 2 minuti a 4 °C e versare rapidamente il surnatante. Ripetere il lavaggio con 1 mL di 1× PBS, centrifugare a 1.400 × g per 2 minuti, versare il surnatante e risospendere il pellet di cella in 100 μL di 1× PBS.
   NOTA: Dopo ogni centrifuga, è importante mantenere le cellule sul ghiaccio per inibire l'assorbimento fagocitario in corso.
5. Agitare gli anticorpi per citometria a flusso e centrifugarli in una microcentrifuga per 10 s. A ciascuna provetta di sospensione cellulare aggiungere 1 μL di CD11b-APC/Cy7 e CD45-PE/Cy7 per il test di fagocitosi Aβ o CD45-FITC per la fagocitosi PE-microsfera. Agitare delicatamente ogni provetta e incubare al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
   NOTA: Gli utenti possono anche includere una provetta separata contenente potenti cellule fagocitiche come la microglia BV2 in coltura o i macrofagi peritoneali come controllo positivo e trattarle con microsfere PE e anticorpi citometrici a flusso come descritto sopra. I dati di questo campione possono essere utilizzati per definire il controllo positivo che denota la vera fagocitosi negli esperimenti preliminari.
6. Mentre le cellule sono in incubazione, impostare le provette di compensazione utilizzando quattro provette di flusso da 5 mL a fondo tondo. Agitare accuratamente le perline di compensazione e aggiungere 1 goccia a ciascun tubo. Aggiungere 1 μL di CD11b-APC/Cy7 alla prima provetta e CD45-FITC alla seconda provetta. Aggiungere 1 μL di polistirene PE alla terza provetta e mantenere le perle di compensazione non macchiate nella quarta provetta. Utilizzare questa quarta provetta come controllo negativo per impostare un pannello di compensazione sul citometro a flusso.
   NOTA: Quando le fibrille Aβ vengono utilizzate per studiare la fagocitosi, aggiungere CD45-PECy7 alla seconda provetta invece di CD45-FITC. Aggiungere 1 μl di anticorpo separato per citometria a flusso marcato FITC o anticorpo secondario FITC (qualsiasi specie) alla terza provetta di compensazione. Questo è importante poiché le perle non possono legarsi alle fibrille Aβ e verranno lavate via dopo il lavaggio dei tubi di compensazione.
7. Lasciare incubare le perle di compensazione con i rispettivi anticorpi per almeno 10 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL di PBS all'1× in ciascuna provetta, centrifugare a 1.400 x g per 2 minuti a 4 °C e versare rapidamente il surnatante. Posizionare le provette di compensazione sul ghiaccio e coprirle con la pellicola fino alla citometria a flusso.
8. Dopo l'incubazione con anticorpi per citometria a flusso, lavare le cellule colorate con 1 mL di PBS all'1×. Agitare delicatamente le celle e centrifugarle a 1.400 × g per 2 minuti a 4 °C. Versare rapidamente il surnatante e ripetere il lavaggio con 1 mL di PBS al 1×. Dopo la centrifugazione, versare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 100 μl di 1× PBS.
9. Posizionare le provette del campione sul ghiaccio e coprirle con un foglio di alluminio fino alla citometria a flusso.
   NOTA: Utilizzare 1× PBS (pH 7,0) senza Ca²⁺/Mg²⁺ come tampone di flusso durante l'esperimento. Assicurarsi di escludere il siero fetale bovino (FBS) nel tampone di flusso per evitare una possibile attivazione microgliale.

4. Citometria a flusso e analisi

1. Impostazione e compensazione dello strumento
   NOTA: Gli esperimenti in questo manoscritto sono stati eseguiti su un citometro a flusso con laser ultravioletti, viola, blu, giallo-verdi e rossi. Questo esperimento può essere adattato anche a citometri a flusso a tre laser con solo laser blu, giallo-verde e rosso. Gli utenti devono seguire una formazione formale prima di maneggiare lo strumento.
   1. Riempire il serbatoio tampone della guaina di flusso e accendere il citometro. "Adescare" il citometro con una provetta rotonda da 5 mL contenente ddH₂O. Accedere al software di analisi sul computer collegato al citometro a flusso. Crea un "esperimento" e seleziona FSC, SSC, FITC, PECy7 e APC-Cy7 come parametri. Se si utilizzano microsfere PE, selezionare PE invece di PECy7 nel pannello dei parametri.
   2. Creare un pannello di compensazione appropriato.
      NOTA: Nei nostri esperimenti, tipicamente le tensioni FSC/SSC per le perle di compensazione sono di circa 350/280, mentre le tensioni FSC/SSC per CNS-MP sono di circa 320/260. Questi valori possono variare tra due citometri diversi e devono essere calibrati prima dell'esperimento vero e proprio.
   3. Ricostituire ogni provetta di compensazione e sospensione cellulare con 500 μl di PBS 1×, agitare brevemente e posizionare su ghiaccio. Far funzionare il tubo di controllo negativo/il tubo del cordone non colorato per impostare le tensioni appropriate in modo che il picco su ciascun istogramma del fluoroforo sia inferiore a 10². Eseguire le altre provette di compensazione monocolore per identificare i loro picchi positivi distinti.
      NOTA: Dovrebbe esserci almeno la metà del log (base 10) di differenza tra i picchi positivi e negativi di ciascun fluoroforo.
   4. Registra 5000 eventi da ciascun tubo di compensazione per consentire al computer di calcolare automaticamente la configurazione della compensazione. Collegare l'impostazione della compensazione all'esperimento corrente²⁵.
   5. Crea un nuovo "tubo" nella scheda del campione. Agitare delicatamente e far scorrere il tubo di controllo negativo contenente CNS-MP non colorato. Regolare le tensioni di dispersione diretta e laterale per catturare la popolazione di interesse. Registra gli eventi e il sottocancello sui CNS-MP in diretta come indicato di seguito.
   6. Cattura e registra gli eventi da tutte le valvole successive come file separati mantenendo coerenti i parametri e le tensioni. Agitare delicatamente ogni provetta prima di farla scorrere sul citometro a flusso.
2. Strategia di gating e misurazione della fagocitosi
   1. Disegna un cancello mononucleare iniziale per catturare tutti i CNS-MP. Queste cellule mononucleate vive devono essere gated nel grafico seguente per includere solo singole cellule, esclusi distici e triplette.
   2. Proietta la popolazione di CNS-MP vive su un grafico successivo che mostra i fluorofori CD11b e CD45.
      NOTA: Le microglia residenti nel cervello sono tipicamente CD11b⁺CD45^intermedie, mentre i macrofagi infiltranti sono CD11b⁺CD45^alti. Ulteriori marcatori come Ly6c possono essere inclusi nel pannello per separare ulteriormente con sicurezza i monociti infiammatori (Ly6c^alto e CD45^alto) dalle microglia (Ly6c^{basso CD45 intermedio}).
   3. Applicare i cancelli appropriati per studiare ulteriormente la fagocitosi nelle rispettive popolazioni, come mostrato nella Figura 2F.
      NOTA: La fagocitosi nelle MP del SNC viene misurata in funzione dell'assorbimento di fluorescenza di Hilyte488/Alexa488 (Aβ) o PE (microsfera). Picchi positivi distinti sui rispettivi istogrammi indicano che le MP del SNC hanno fagocitato il substrato. La quantità di materiale fagocitato è direttamente proporzionale all'intensità della fluorescenza. Pertanto, la presenza di picchi multipli deve essere interpretata come una fagocitosi superiore. Questi possono essere successivamente confermati dall'immunoistochimica.
   4. Dopo aver registrato tutte le provette del campione sul citometro a flusso, esportare i file di dati in formato .fcs per ulteriori analisi.
3. Analisi statistica dei dati
   1. Utilizza qualsiasi software di analisi della citometria a flusso insieme a fogli di calcolo e software di analisi statistica per tutte le analisi dei dati.
   2. Aggiungere i file .fcs al software di analisi e fare doppio clic sul primo file. Un grafico che mostra tutti i dati registrati
      Appariranno gli eventi. Seguire una strategia di gating simile a quella mostrata nella Figura 2 per successivamente eseguire il gate di singole cellule mononucleate vive e studiare la fagocitosi su una popolazione specifica, ad esempio le cellule microgliali^intermedie CD11b⁺CD45 (Figura 2H).
      NOTA: L'indice fagocitico viene valutato in base alla percentuale di cellule che internalizzano fibrille Aβ fluorescenti o microsfere ≥1. Come definito in precedenza, la fagocitosi a basso livello è l'assorbimento di almeno 1 microsfera e la fagocitosi ad alto livello è^{l'assorbimento di 8,9} perle di >1. Sulla base di esperimenti precedenti, l'inibizione dei processi dipendenti dall'actina da parte della citocalasi D inibisce completamente l'assorbimento della perlina >1 e inibisce parzialmente l'assorbimento della perlina^{1 9}, oltre a inibire completamente l'assorbimento dell'Aβ, confermando l'assorbimento fagocitario dipendente dall'actina piuttosto che il legame passivo alla superficie cellulare. L'immunocitochimica conferma inoltre che ogni picco sequenziale nel saggio della microsfera è rappresentativo di un aumento unitario del numero di perle fagocitate ^8,9.

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Risultati

Per esemplificare i risultati tipici dell'assorbimento fagocitario delle microsfere e delle fibrille Aβ42 da parte delle CNS-MP acutamente isolate, le CNS-MP acutamente isolate sono state ottenute dall'emisfero omolaterale dopo occlusione arteriosa cerebrale media transitoria (MCAO)⁸. Per i dettagli sulle proprietà fagocitiche delle CNS-MP nel modello MCAO, fare riferimento alle pubblicazioni precedenti⁸. In breve, dopo un recupero di 72 ...

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Discussione

La citometria a flusso è una tecnica in grado di rilevare l'espressione di proteine o marcatori di interesse sulla superficie cellulare o nei compartimenti intracellulari utilizzando sonde marcate in fluorescenza (tipicamente anticorpi) per marcare questi marcatori di interesse. Gli anticorpi sulla superficie cellulare o intracellulari sono tipicamente coniugati con fluorocromi eccitabili al laser che hanno spettri di emissione unici. Le cellule incubate con questi anticorpi possono ess...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.