גישת זרימה ציטומטרית לאפיון תכונות פגוציטיות של מיקרוגליה בוגרת מבודדת חריפה ומקרופאגים במוח במבחנה

Summary

הערכת התכונות הפגוציטיות של מיקרוגליה ומקרופאגים במוח יכולה לספק ממד תפקודי רב ערך למחקרי פרופיל מולקולרי. אנו מתארים פרוטוקול מאומת המשתמש בזרימה ציטומטרית כדי לכמת במהירות ובאמינות פגוציטוזיס של מיקרוספירות פלואורסצנטיות וסיבי בטא עמילואיד על ידי מיקרוגליה מבודדת באופן חריף ומקרופאגים במוח ממודלים של עכברים.

Abstract

מיקרוגליה ומקרופאגים חודרים למערכת העצבים המרכזית (CNS), הנקראים ביחד פגוציטים חד-גרעיניים של מערכת העצבים המרכזית (CNS-MPs), ממלאים תפקידים מרכזיים במחלות נוירולוגיות כולל ניוון עצבי ושבץ מוחי. CNS-MPs מעורבים בפינוי פגוציטי של חלבונים פתולוגיים, פסולת וסינפסות עצביות, כל אחד עם מסלולים מולקולריים בסיסיים מובחנים. אפיון תכונות פגוציטיות אלה יכול לספק קריאה פונקציונלית המחמיאה לפרופיל מולקולרי של מיקרוגליה באמצעות גישות ציטומטריית זרימה מסורתיות, טרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה. פרופיל פגוציטי של מיקרוגליה הסתמך על הדמיה מיקרוסקופית ותרביות מבחנה של מיקרוגליה יילודים של עכברים. הגישה הראשונה סובלת מדגימה מוגבלת בעוד שהגישה השנייה משקפת באופן גרוע מטבעה את המצב האמיתי in vivo של חברי פרלמנט בוגרים במערכת העצבים המרכזית. מאמר זה מתאר פרוטוקולים אופטימליים לתכונות פגוציטיות פנוטיפיות של CNS-MPs של עכברים מבודדים באופן חריף על ידי ציטומטריית זרימה. CNS-MPs מבודדים באופן חריף ממוח עכבר בוגר באמצעות דיסוציאציה מכנית ואחריה צנטריפוגה של שיפוע צפיפות, מודגרים עם מיקרוספירות פלואורסצנטיות או סיבי Aβ פלואורסצנטיים, נשטפים ולאחר מכן מסומנים בלוחות של נוגדנים כנגד סמני פני השטח (CD11b, CD45). באמצעות גישה זו, ניתן להשוות תכונות פגוציטיות של מיקרוגליה השוכנת במוח עם מקרופאגים חודרים למערכת העצבים המרכזית ולאחר מכן להעריך את השפעת ההזדקנות ופתולוגיה של מחלות על פנוטיפים פגוציטים אלה. שיטה מהירה זו טומנת בחובה גם פוטנציאל לפנוטיפ מבודד תפקודי של CNS-MPs אנושיים מדגימות מוח לאחר המוות או כירורגיות. בנוסף, ניתן לחקור מנגנונים ספציפיים של פגוציטוזיס על ידי תת-קבוצות CNS-MP על ידי עיכוב מסלולים פגוציטים נבחרים.

Introduction

תאי החיסון המולדים של מערכת העצבים המרכזית (CNS) מורכבים בעיקר ממיקרוגליה ומונוציטים/מקרופאגים חודרים, הנקראים יחד פגוציטים חד-גרעיניים של מערכת העצבים המרכזית (CNS-MPs)¹. CNS-MPs מעורבים במחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר (AD), הפרעות נוירו-דלקתיות ושבץ מוחי ^2,3,4. ל-CNS-MPs, יחד עם אסטרוציטים, פריציטים ותאים אפנדימליים, יש פונקציות פגוציטיות ^5,6. במצבם ההומאוסטטי, CNS-MPs מעורבים במעקב מתמיד אחר המיקרו-סביבה המקומית, יחד עם פינוי פגוציטי של פסולת תאים אפופטוטית וחלבונים, וגיזום סינפטי לעיצוב מחדש של קשרים עצביים 7,8,9,10. במצבים ניווניים כמו אלצהיימר, CNS-MPs מאמצים פנוטיפים מולקולריים ותפקודיים מובהקים הקשורים למחלה שיכולים למלא תפקידים פתולוגיים כולל פינוי של עמילואיד-בטא מצטבר (Aβ) ואלמנטים עצביים, כמו גם ציטוקינים דלקתיים ושחרור גורמים, וכתוצאה מכך תפקידי הגנה פרו-דלקתיים, מזיקים כמו גם אנטי דלקתיים 11,12,13,14. פגוציטוזיס של חלקיקי מאקרו, פסולת תאית, חלבונים וחלקיקים זיהומיים אחרים על ידי CNS-MPs מתווכים על ידי קולטנים נפרדים המתבטאים על פני השטח שלהם⁹. שיבוש במסלולים פגוציטים אלה יכול להוביל לפינוי פגום ולהצטברות מתקדמת של Aβ מה שמוביל בסופו של דבר לנזק עצבי מתקדם ב-AD ^4,9. בעוד שהתקדמות בפרופיל מולקולרי של CNS-MPs באמצעות גישות טרנסקריפטומיות ופרוטאומיות סיפקה תובנות יקרות ערך לגבי ההטרוגניות המולקולרית בתוך CNS-MPs במחלות נוירולוגיות^15,16, אפיון פונקציונלי של התכונות הפגוציטיות של CNS-MPs ותת-הקבוצות שלהם לוקה בחסר כיום. אפיון פונקציונלי של התכונות הפגוציטיות של CNS-MPs יכול להשלים אסטרטגיות פרופיל מולקולרי, להקל על פנוטיפ תפקודי טוב יותר ולסייע בהערכת היעילות של טיפולים שיכולים לתקן פגוציטוזיס פגום במודלים של מחלות¹⁷.

מבחני פגוציטוזיס מסורתיים עבור CNS-MPs כוללים דגירה של מיקרוגליה ראשונית יחד עם מצעים פלואורסצנטיים כגון Aβ או חלקיקי לטקס/פוליסטירן. לאחר מכן נחקרת פגוציטוזיס כפונקציה של ספיגת המצע הפלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית 18,19,20. זה מבוסס היטב ש-CNS-MPs, כאשר הם נשמרים בתרביות ארוכות, יכולים לשנות באופן דרמטי את המורפולוגיה ואת פרופילי השעתוק שלהם^21,22. זה מפריע לחקר התכונות הפגוציטיות של חברי הפרלמנט של מערכת העצבים המרכזית במצבם הייצוגי במערכת העצבים המרכזית. בדיקת ציטומטריית זרימה פונקציונלית לפרופיל CNS-MPs חיים מבודדים באופן חריף יכולה לספק הערכה מהירה של תכונות פגוציטיות ויכולה לדגום מאגר גדול בהרבה של CNS-MPs מאשר מיקרוסקופיה מתקרבת ^9,23. יתר על כן, זרימה ציטומטרית מבטלת את הצורך בשמירה על ה-CNS-MPs בתרבית וכן מספקת פלטפורמה לחקר תכונות פגוציטוטיות בתת-אוכלוסיות שונות של CNS-MPs. כתב יד זה מתאר פרוטוקולים אופטימליים לתכונות פגוציטיות פנוטיפיות של CNS-MPs עכברים מבודדים באופן חריף על ידי ציטומטריית זרימה. התאמת מבחני פגוציטוזיס באמצעות זרימה ציטומטרית מאפשרת ריבוב מהיר של הפנוטיפ הפגוציטי של CNS-MPs יחד עם פנוטיפ חיסוני, ובכך מספקת תובנות לגבי הטרוגניות של תכונות פגוציטיות בתוך CNS-MPs ברזולוציית התא הבודד.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל המחקרים בעכברים נערכו לאחר קבלת אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של אוניברסיטת אמורי, ובהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות.

1. היערכות ביום הבידוד

1. הכן דלי קרח כדי לשמור על כל הריאגנטים, המאגרים ומתלי התאים קרים לאורך כל הליך הבידוד.
2. הנח את הבקבוק של 1× מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) (לפחות 1 ליטר) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עד שעה לפני הזלוף ושמור 1× PBS על קרח במהלך הליך הזלוף והבידוד.
3. הכן את ריכוז העבודה של מדיום שיפוע הצפיפות (המכונה 35% SIP, ראה טבלת חומרים).
4. סמן את כל הצינורות החרוטיים והזרימה ששימשו בניסוי לפני בידוד התאים כדי למנוע עיכובים בזמני העיבוד. בנוסף, אסוף את כל האספקה האחרת הדרושה לבידוד לפני הזלוף, כגון מסנני תאים של 40 מיקרומטר, מזרקים ומחטים.

2. בידוד חריף של מיקרוגליה של עכבר בוגר

1. הרדמה של עכבר בוגר על ידי הנחת העכבר בתא אינדוקציה מזכוכית עם איזופלורן (5 מ"ל) עד שהעכבר מפסיק לנשום ואינו מגיב לצביטה בכף האחורית.
2. השתמש במחט של 26 גרם ובמזרק של 10 מ"ל כדי לבצע זלוף לב עם 30 מ"ל של 1× PBS קר כקרח עד שאין דם חזותי.
3. ערפו את ראשו של העכבר במספריים כירורגיים. השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור ולחשוף את הגולגולת. הסר את הגולגולת מבלי לפגוע ברקמת המוח כמתואר²⁴. הסר את המוח מיד והעביר למסננת תאים סטרילית של 40 מיקרומטר המונחת על גבי צינור חרוטי של 50 מ"ל.
4. השתמש בחלק האחורי של הבוכנה של מזרק 3 מ"ל כדי לדחוף את המוח דרך המסננת ולנתק מכנית את כל רקמת המוח. שטפו את מסננת התאים והבוכנה לסירוגין במהלך הדיסוציאציה עם 2 מ"ל של 1× PBS קר כקרח בכל פעם כדי להבטיח שכל הרקמה עוברת דרך המסננת.
5. מגרדים את החלק התחתון של מסננת התאים בעזרת הבוכנה כדי לאסוף כל מתלה שנותר לתוך החרוט. יש לשטוף היטב את מסננת התאים עם 1× PBS קר כקרח ולשפוך את המתלה לתוך הצינור החרוטי של 50 מ"ל.
   הערה: בעת עיבוד מספר בעלי חיים בסדרה, הנח את מתלי התאים על קרח עד לעיבוד נוסף.
6. הוסף 1× PBS קר כקרח כדי להביא את נפח מתלה התאים ל-30 מ"ל וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. שפכו את הסופרנטנט מבלי להפריע לגלולה ותלו מחדש את הגלולה ב-6 מ"ל של 35% SIP עם פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל. העבירו את מתלה התא + תערובת SIP 35% לצינור חרוטי חדש של 15 מ"ל וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 25 דקות ב-15 מעלות צלזיוס ללא בלם.
   זהירות: היזהר במיוחד כדי להימנע מהכנסת בועות במהלך ההשעיה מחדש. בועות מוגזמות עלולות להזיק לתפוקת התאים.
8. הסר בזהירות את הצינור החרוטי בנפח 15 מ"ל מהצנטריפוגה מבלי להפריע לשכבות ושאף את שכבת המיאלין הצפה העליונה.
9. העבירו את תרחיף התאים + תערובת SIP 35% באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מ"ל לצינור חרוטי חדש של 50 מ"ל המכיל 30 מ"ל של 1× PBS קר כקרח וצנטריפוגה ב-800 × גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שפכו בזהירות את הסופרנטנט, והשאירו מאחור את כדור התא יחד עם 500-800 מיקרוליטר של 1× PBS.
10. השעו מחדש את כדור התא על ידי פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם פיפטה p1000 והעבירו לצינור תחתון עגול של 5 מ"ל. הוסף 2 מ"ל של 1× PBS קר כקרח לצינור התחתון העגול ולצנטריפוגה ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט, והשאירו את גלולת התא המכילה CNS-MPs בכ-100 מיקרוליטר של 1× PBS (איור 1).

3. הגדרת פגוציטוזיס וצביעה ציטומטרית זרימה

1. העבירו 20 מיקרוליטר (≈200,000 תאים) של ה-CNS-MPs התלויים מחדש לצינור תחתון עגול טרי של 5 מ"ל והוסיפו 80 מיקרוליטר של 1× PBS קר כקרח. אל תוסיף לצינור זה מצעים פלואורסצנטיים או נוגדנים לזרימה ציטומטרית. תאים אלה משמשים כבקרה שלילית לקביעת פלואורסצנטיות רקע של CNS-MPs לניתוחי זרימה ציטומטרית.
2. כדי לבסס את הכדאיות של ה-CNS-MPS המבודדים, השתמש בצבעים חיים/מתים מבוססי אמין (למשל, UV כחול ניתן לתיקון).
   1. השעו מחדש את שאר גלולת התא ב-500 מיקרוליטר של 1× PBS והוסיפו 1 מיקרוליטר של הצבע המחודש לכל צינור דגימה למעט הבקרה השלילית.
   2. מערבולת בעדינות, מכסים את הצינורות בנייר כסף ודוגרים אותם בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, הוסף 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות.
   3. צנטריפוגה של התאים בטמפרטורה של 1,400 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט והשעו מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
      הערה: צבעים מבוססי אמין ייקשרו לסיבי Aβ החוץ-תאיים ויבלבלו את תוצאות הפגוציטוזיס. אינדיקטורים חיים/מתים אחרים עשויים להפריע לפלואורסצנטיות של סיבי Aβ/מיקרוספרות. לפיכך מומלץ להשתמש במחוון חי/מת רק בניסויים ראשוניים כדי לקבוע את הכדאיות של CNS-MPS המבודדים.
3. מערבל היטב את הצינור המכיל מיקרוספירות PE-פוליסטירן והוסף 2 מיקרוליטר (≈200 מיקרוספירות לתא) ל-100 מיקרוליטר של תרחיף תאים בצינורות זרימה למעט הבקרה השלילית. מערבל בעדינות כל צינור כדי להבטיח פיזור שווה של המצע עם התאים והנח את הצינורות התחתונים העגולים בחממה סטרילית לחה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   1. מערבל בעדינות ודגר את צינור הבקרה השלילי כדי להבטיח תנאי ניסוי דומים בין דגימות חיוביות ושליליות.
      הערה: אם משתמשים בסיבי Aβ במקום במיקרוספירות PE, הכינו סיבי HiLyte488 Aβ פלואורסצנטיים כמתואר קודם לכן⁹. הריכוז הסופי של סיבי Aβ הוא 200 מיקרומטר אשר מדולל לאחר מכן להכנת מלאי טרי של 20 מיקרומטר ב-PBS של מונומרים Aβ פלואורסצנטיים. הוסף 12.5 מיקרוליטר ממונומרי Aβ של 20 מיקרומטר לכל צינור המכיל תאים מבודדים.
4. הסר את התאים מהחממה והוסף 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור ומערבולת בעדינות. צנטריפוגה של התאים ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ושפכו במהירות את הסופרנטנט. חזור על הכביסה עם 1 מ"ל 1× PBS, צנטריפוגה ב-1,400 × גרם למשך 2 דקות, שפך את הסופרנטנט והשהה מחדש את גלולת התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
   הערה: לאחר כל סיבוב, חשוב לשמור על התאים על הקרח כדי לעכב ספיגה פגוציטית מתמשכת.
5. מערבל את נוגדני הזרימה-ציטומטריה וצנטריפוגה אותם במיקרו-צנטריפוגה למשך 10 שניות. לכל צינור תרחיף תאים הוסף 1 מיקרוליטר כל אחד מ-CD11b-APC/Cy7 ו-CD45-PE/Cy7 לבדיקת פגוציטוזיס Aβ, או CD45-FITC לפגוציטוזיס PE-microsphere. מערבלים בעדינות כל צינור ודוגרים בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
   הערה: משתמשים יכולים גם לכלול צינור נפרד המכיל תאים פגוציטים חזקים כגון BV2 microglia מתורבת או מקרופאגים צפקיים כבקרה חיובית ולטפל בהם במיקרוספירות PE, ונוגדנים ציטומטריים זורמים כמתואר לעיל. ניתן להשתמש בנתונים ממדגם זה כדי להגדיר את הבקרה החיובית המציינת פגוציטוזיס אמיתית בניסויים ראשוניים.
6. בזמן שהתאים נמצאים בדגירה, הגדר צינורות פיצוי באמצעות ארבעה צינורות זרימה תחתונים עגולים של 5 מ"ל. מערבל היטב את חרוזי הפיצוי והוסף טיפה אחת לכל צינור. הוסף 1 מיקרוליטר של CD11b-APC/Cy7 לצינור הראשון ו-CD45-FITC לשנייה לצינור. הוסף 1 מיקרוליטר של פוליסטירן PE לצינור השלישי ושמור חרוזי פיצוי לא מוכתמים בצינור הרביעי. השתמש בצינור הרביעי הזה כבקרה שלילית כדי להגדיר לוח פיצוי על ציטומטר הזרימה.
   הערה: כאשר משתמשים בסיבי Aβ לחקר פגוציטוזיס, הוסף CD45-PECy7 לצינור השני במקום CD45-FITC. הוסף 1 מיקרוליטר של נוגדן ציטומטריית זרימה מתויג FITC נפרד או נוגדן משני FITC (כל מין) לצינור הפיצוי השלישי. זה חשוב מכיוון שהחרוזים אינם יכולים להיקשר לסיבי Aβ והם יישטפו עם שטיפת צינורות הפיצוי.
7. אפשר לחרוזי הפיצוי לדגור עם הנוגדנים שלהם למשך 10 דקות לפחות. לאחר הדגירה, הוסיפו 1 מ"ל של 1× PBS לכל צינור, צנטריפוגה ב-1,400 x גרם למשך 2 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, ושפכו במהירות את הסופרנטנט. הניחו את צינורות הפיצוי על קרח וכסו אותם בנייר כסף עד לזרימה ציטומטרית.
8. לאחר הדגירה עם נוגדנים לזרימה-ציטומטריה, יש לשטוף את התאים המוכתמים ב-1 מ"ל של 1× PBS. מערבולת וצנטריפוגה בעדינות של התאים בטמפרטורה של 1,400 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. שפכו במהירות את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה עם 1 מ"ל 1× PBS. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-100 מיקרוליטר של 1× PBS.
9. מניחים את צינורות הדגימה על קרח ומכסים אותם בנייר אלומיניום עד לזרימה ציטומטרית.
   הערה: השתמש ב-1× PBS (pH 7.0) ללא Ca²⁺/Mg²⁺ כמאגר זרימה לאורך כל הניסוי. הקפד לא לכלול סרום בקר עוברי (FBS) במאגר הזרימה כדי למנוע הפעלה אפשרית של מיקרוגליה.

4. ציטומטריית זרימה ואנליזה

1. הגדרת מכשירים ופיצוי
   הערה: הניסויים בכתב יד זה בוצעו על ציטומטר זרימה עם לייזרים אולטרה סגולים, סגולים, כחולים, צהובים-ירוקים ואדומים. ניתן להתאים ניסוי זה גם לציטומטר זרימה תלת-לייזרי עם לייזרים כחולים, צהובים-ירוקים ואדומים בלבד. המשתמשים צריכים לעבור הכשרה רשמית לפני הטיפול במכשיר.
   1. מלא מחדש את מיכל חיץ נדן הזרימה והפעל את הציטומטר. "פריים" את הציטומטר עם צינור זרימה תחתון עגול של 5 מ"ל המכיל ddH₂O. היכנס לתוכנת הניתוח במחשב המחובר לציטומטר הזרימה. צור "ניסוי" ובחר FSC, SSC, FITC, PECy7 ו-APC-Cy7 כפרמטרים. אם אתה משתמש במיקרוספירות PE, בחר PE במקום PECy7 בלוח הפרמטרים.
   2. צור לוח תגמול מתאים.
      הערה: בניסויים שלנו, בדרך כלל מתחי FSC/SSC עבור חרוזי פיצוי הם בסביבות 350/280, בעוד שמתחי FSC/SSC עבור CNS-MPs הם בסביבות 320/260. ערכים אלה יכולים להשתנות בין כל שני ציטומטרים שונים ויש לכייל אותם לפני הניסוי בפועל.
   3. הרכיבו מחדש כל צינור פיצוי ותרחיף תאים עם 500 מיקרוליטר של 1× PBS, מערבולת קצרה והניחו על קרח. הפעל את צינור החרוז השלילי/לא מוכתם כדי להגדיר מתחים מתאימים כך שהשיא בכל היסטוגרמה של פלואורופור יהיה מתחת ל-10². הפעל את צינורות הפיצוי האחרים בצבע יחיד כדי לזהות את הפסגות החיוביות המובהקות שלהם.
      הערה: צריך להיות לפחות חצי לוג הבדל (בסיס 10) בין הפסגות החיוביות והשליליות של כל פלואורופור.
   4. רשום 5000 אירועים מכל שפופרת פיצוי כדי לאפשר למחשב לחשב אוטומטית את הגדרת הפיצוי. קשר את מערך הפיצוי לניסוי הנוכחי²⁵.
   5. צור "צינור" חדש תחת הכרטיסייה לדוגמה. מערבל בעדינות והפעל את צינור הבקרה השלילי המכיל CNS-MPs לא מוכתמים. כוונן את מתח הפיזור קדימה והצד כדי ללכוד את אוכלוסיית העניין. הקלט את האירועים ושער המשנה בשידור חי של חברי הפרלמנט של CNS כמפורט להלן.
   6. לכוד ורשום אירועים מכל הצינורות הבאים כקבצים נפרדים תוך שמירה על עקביות הפרמטרים והמתחים. מערבל בעדינות כל צינור לפני הפעלתם על ציטומטר הזרימה.
2. אסטרטגיית שער ומדידת פגוציטוזיס
   1. צייר שער חד-גרעיני ראשוני כדי ללכוד את כל חברי הפרלמנט של מערכת העצבים המרכזית. תאים חד-גרעיניים חיים אלה חייבים להיות מגודרים בגרף הבא כדי לכלול רק תאים בודדים, למעט צמדים ושלישיות.
   2. הקרן את אוכלוסיית ה-CNS-MPs הבודדת והחיה על גרף עוקב המציג פלואורופורים CD11b ו-CD45.
      הערה: מיקרוגליה השוכנת במוח היא בדרך כלל CD11b⁺CD45^{בינונית}, בעוד שמקרופאגים חודרים הם CD11b⁺CD45^גבוהים. סמנים נוספים כגון Ly6c עשויים להיכלל בפאנל כדי להפריד בביטחון נוסף מונוציטים דלקתיים (Ly6c^גבוה ו-CD45^גבוה) ממיקרוגליה (Ly6c^נמוך CD45^ביניים).
   3. החל שערים מתאימים להמשך מחקר פגוציטוזיס באוכלוסיות המתאימות כפי שמוצג באיור 2F.
      הערה: פגוציטוזיס ב-CNS-MPs נמדד כפונקציה של ספיגת הקרינה Hilyte488/Alexa488 (Aβ) או PE (מיקרוספרה). שיא חיובי מובהק בהיסטוגרמות שלהם מצביע על כך ש-CNS-MPs ביצעו פגוציטוזציה של המצע. כמות החומר פגוציטוז עומדת ביחס ישר לעוצמת הקרינה. לפיכך, יש לפרש נוכחות של פסגות מרובות כפגוציטוזיס גבוה יותר. ניתן לאשש אותם לאחר מכן על ידי אימונוהיסטוכימיה.
   4. לאחר הקלטת כל צינורות הדגימה על ציטומטר הזרימה, ייצא את קבצי הנתונים בפורמט .fcs להמשך ניתוח.
3. ניתוח נתונים סטטיסטיים
   1. השתמש בכל תוכנה לניתוח זרימה-ציטומטריה יחד עם גיליונות אלקטרוניים ותוכנת ניתוח סטטיסטי עבור כל ניתוחי הנתונים.
   2. הוסף את קבצי ה-.fcs לתוכנת הניתוח ולחץ פעמיים על הקובץ הראשון. גרף המציג את כל ההקלטות
      יופיעו. עקוב אחר אסטרטגיית שער דומה כפי שמוצג באיור 2 כדי לשער לאחר מכן תאים חד-גרעיניים בודדים חיים ולחקור פגוציטוזיס על אוכלוסייה ספציפית, למשל תאי מיקרוגליה^ביניים CD11b⁺CD45 (איור 2H).
      הערה: האינדקס הפגוציטי מוערך על סמך שיעור התאים המפנימים סיבי Aβ פלואורסצנטיים או מיקרוספרה ≥1. כפי שהוגדר קודם לכן, פגוציטוזיס ברמה נמוכה היא ספיגה של מיקרוספירה אחת לפחות ופגוציטוזיס ברמה גבוהה היא ספיגת חרוזים >1 ^8,9. בהתבסס על ניסויים קודמים, עיכוב תהליכים תלויי אקטין על ידי ציטוכלזין D מעכב לחלוטין את ספיגת החרוז >1 ומעכב חלקית ספיגת חרוז אחת⁹ וכן מעכב לחלוטין את ספיגת Aβ, ומאשר ספיגה פגוציטית תלויה באקטין במקום קשירה פסיבית לפני השטח של התא. אימונוציטוכימיה גם מאשרת שכל שיא עוקב בבדיקת המיקרוספירה מייצג עלייה יחידה במספר החרוזים שעברו פגוציטוז ^8,9.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי להדגים תוצאות אופייניות של קליטה פגוציטית של מיקרוספירות וסיבי Aβ42 על ידי CNS-MPs מבודדים באופן חריף, CNS-MPs מבודדים באופן חריף התקבלו מחצי הכדור המקביל לאחר חסימת עורקי מוח אמצעיים חולפת (MCAO)⁸. לפרטים לגבי תכונות פגוציטיות של CNS-MPS במודל MCAO, עיין בפרסומים קודמי...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

זרימה-ציטומטריה היא טכניקה שיכולה לזהות ביטוי של חלבונים או סמנים מעניינים על פני התא או בתאים תוך-תאיים באמצעות בדיקות המסומנות פלואורסצנטיות (בדרך כלל נוגדנים) כדי לסמן את הסמנים המעניינים הללו. נוגדנים על פני התא או תוך-תאיים מצומדים בדרך כלל עם פלואורוכרומים הניתני?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.