In vitroで急性単離された成体ミクログリアおよび脳マクロファージの食作用特性を特徴付けるためのフローサイトメトリーアプローチ

要約

ミクログリアと脳マクロファージの食作用特性の評価は、分子プロファイリング研究に貴重な機能的側面を提供することができます。フローサイトメトリーを使用して、マウスモデルから急性に分離されたミクログリアと脳マクロファージによる蛍光ミクロスフェアとアミロイドベータフィブリルの食作用を迅速かつ確実に定量する検証済みのプロトコルについて説明します。

要約

ミクログリアと中枢神経系(CNS)浸潤マクロファージは、総称してCNS単核食細胞(CNS-MPs)と呼ばれ、神経変性や脳卒中などの神経疾患において中心的な役割を果たしています。CNS-MPは、病理学的タンパク質、破片、およびニューロンシナプスの食作用クリアランスに関与しており、それぞれが異なる分子経路を基盤としています。これらの食作用特性を特徴付けることで、従来のフローサイトメトリー、トランスクリプトミクス、プロテオミクスのアプローチを使用して、ミクログリアの分子プロファイリングを補完する機能的な読み出しを得ることができます。ミクログリアの食作用プロファイリングは、マウス新生児ミクログリアの顕微鏡的可視化とin vitro培養に依存してきました。前者のアプローチはサンプリングが限られているという問題がありますが、後者のアプローチは、成体のCNS-MPの真のin vivo状態を本質的に十分に反映していません。この論文では、フローサイトメトリーによる急性単離マウスCNS-MPの表現型食作用特性に対する最適化されたプロトコルについて説明します。CNS-MPは、機械的解離とそれに続く密度勾配遠心分離を使用して成体マウス脳から急性に単離され、蛍光ミクロスフェアまたは蛍光Aβ線維とインキュベートされ、洗浄された後、表面マーカー(CD11b、CD45)に対する抗体のパネルで標識されます。このアプローチを用いることで、脳内に存在するミクログリアと中枢神経系に浸潤するマクロファージの食作用特性を比較し、これらの食作用表現型に対する老化や疾患の病理性の影響を評価することが可能です。この迅速な方法は、死後または外科的脳標本から急性に分離されたヒトCNS-MPを機能的に表現型化する可能性も秘めています。さらに、CNS-MPサブセットによる食作用の特異的なメカニズムは、選択した食作用経路を阻害することにより調査できます。

概要

中枢神経系(CNS)の自然免疫細胞は、主にミクログリアと浸潤性単球/マクロファージで構成されており、これらを合わせてCNS単核食細胞(CNS-MPs)^{と呼ばれます1}。CNS-MPは、アルツハイマー病(AD)、神経炎症性疾患、脳卒中^などの神経変性疾患に関与しています^2,3,4。CNS-MPは、アストロサイト、周皮細胞、上衣細胞とともに、食作用機能を持っています^5,6。恒常性状態では、CNS-MPは、アポトーシス細胞の破片やタンパク質の食作用クリアランス、ニューロン接続をリモデリングするためのシナプス刈り込みとともに、局所微小環境の継続的な監視に関与しています7,8,9,10。ADのような神経変性疾患では、CNS-MPは、凝集したアミロイドベータ(Aβ)およびニューロン要素のクリアランス、ならびに炎症性サイトカインおよび因子放出を含む病理学的役割を果たすことができる明確な疾患関連分子および機能表現型を採用し、その結果、複雑な炎症誘発性、有害性、および抗炎症性、保護的役割をもたらす11,12,13,14.中枢神経系-MPによるマクロ粒子、細胞残骸、タンパク質、その他の感染性粒子の食作用は、^{その表面に}発現する異なる受容体によって媒介される9。これらの食作用経路の破綻は、クリアランスの欠陥とAβの進行性蓄積につながり、最終的には^AD4,9の進行性ニューロン損傷につながる可能性があります。トランスクリプトームおよびプロテオミクスアプローチを用いたCNS-MPの分子プロファイリングの進歩により、神経疾患におけるCNS-MPs内の分子不均一性に関する貴重な洞察が得られている^15,16が、CNS-MPsおよびそのサブセットの食作用特性の機能的特性評価は現在のところ不足している。CNS-MPの食作用特性の機能的特性評価は、分子プロファイリング戦略を補完し、より優れた機能的表現型解析を促進し、疾患モデルにおける欠陥性食作用を是正できる治療薬の有効性の評価を支援することができる¹⁷。

CNS-MPsに対する従来の食作用アッセイには、Aβやラテックス/ポリスチレン粒子などの蛍光基質とともに初代ミクログリアをインキュベートすることが含まれます。次いで、食作用は、免疫蛍光顕微鏡18,19,20を用いて、蛍光基質の取り込みの関数として研究される。CNS-MPは、長い培養で維持されると、その形態および転写プロファイルを劇的に変化させることができることは十分に確立されている^21,22。これは、CNSにおけるCNS-MPの代表的な状態における食作用特性の研究を妨げます。急性単離された生きたCNS-MPをプロファイリングするための機能的フローサイトメトリーアッセイは、食作用特性の迅速な評価を提供し、顕微鏡法アプローチよりもはるかに多くのCNS-MPsをサンプリングすることができます^9,23。さらに、フローサイトメトリーは、CNS-MPを培養中に維持する必要がなくなるだけでなく、CNS-MPのさまざまな亜集団における食作用特性を研究するためのプラットフォームを提供します。この原稿では、フローサイトメトリーによる急性単離マウスCNS-MPの貪食特性の表現型に最適化されたプロトコルについて説明します。フローサイトメトリーを用いた食作用アッセイを適応させることで、CNS-MPの食作用表現型と免疫表現型の組み合わせを迅速にマルチプレックス化することができ、それにより、CNS-MPs内の食作用特性の不均一性をシングルセル分解能で得ることができます。

プロトコル

すべてのマウス研究は、エモリー大学の動物管理・使用委員会(IACUC)の承認を得た後、国立衛生研究所の実験動物の手引きに厳密に従って実施されました。

1. 隔離当日の準備

1. 分離手順全体を通して、すべての試薬、バッファー、および細胞懸濁液を冷たく保つために、アイスバケツを準備します。
2. 灌流前に1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)(少なくとも1L)のボトルを4°Cで30分から1時間置き、灌流および単離手順中は1×PBSを氷上に保ちます。
3. 密度勾配媒体(35% SIPと呼ばれる、 材料表を参照)の使用濃度を調製します。
4. 細胞単離の前に、実験で使用したすべてのコニカルサイトメトリーチューブとフローサイトメトリーチューブにラベルを付けて、処理時間の遅延を回避します。さらに、灌流前の単離に必要な他のすべての消耗品(40 μm細胞ストレーナー、シリンジ、針など)を収集します。

2. 成体マウスミクログリアの急性分離

1. 成体マウスに麻酔をかけるには、マウスをイソフルラン(5 mL)の入ったガラス製の誘導チャンバーに入れて、マウスが呼吸を停止し、後肢の足のつまみに反応しなくなるまで麻酔します。
2. 26 Gの針と10 mLの注射器を使用して、30 mLの氷冷した1× PBSで心臓灌流を行い、目に見える血液がなくなるまで行います。.
3. 手術用ハサミでマウスの首を切ります。小さなハサミを使って皮膚を切り、頭蓋骨を露出させます。説明されたように、脳組織を損傷することなく頭蓋骨を切除する²⁴。すぐに脳を取り出し、50 mLのコニカルチューブの上に置いた滅菌済みの40 μmセルストレーナーに移します。
4. 3mLシリンジのプランジャーの裏側を使用して、脳をストレーナーに押し込み、脳組織全体を機械的に解離させます。解離中に細胞ストレーナーとプランジャーを毎回2mLの氷冷した1×PBSで断続的に洗浄し、すべての組織がストレーナーを通過することを確認します。
5. プランジャーでセルストレーナーの底をこすり落とし、残留懸濁液を円錐形に集めます。細胞ストレーナーを氷冷した1×PBSで完全に洗い流し、懸濁液を50mLのコニカルチューブに注ぎます。
   注:複数の動物を連続して処理する場合は、次の処理まで細胞懸濁液を氷上に置きます。
6. 氷冷した1×PBSを加えて細胞懸濁液容量を30 mLにし、800 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
7. ペレットを乱さずに上清を注ぎ、10 mLの血清ピペットを使用して6 mLの35%SIPにペレットを再懸濁します。.細胞懸濁液+ 35% SIP混合物を新しい15 mLコニカルチューブに移し、ブレーキなしで800 × g で15°C、25分間遠心分離します。
   注意: 再懸濁中に気泡が入らないように特に注意してください。過剰な気泡は、細胞の収量に悪影響を与える可能性があります。
8. 15 mLのコニカルチューブを遠心分離機から慎重に取り外し、層を乱さずに上部に浮かぶミエリン層を吸引します。
9. 10 mLの血清ピペットを使用して細胞懸濁液+ 35% SIP混合物を、30 mLの氷冷1× PBSを含む新しい50 mLコニカルチューブに移し、800 × g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を慎重に注ぎ、細胞ペレットと500\u2012800μLの1×PBSを残します。
10. p1000ピペットで静かにピペッティングして細胞ペレットを再懸濁し、5 mLの丸底チューブに移します。氷冷した1×PBSの2 mLを丸底チューブに加え、1,400 × g で4°Cで2分間遠心分離します。 上清を速やかに注ぎ出し、CNS-MPを含む細胞ペレットを約100μLの1×PBSに残します(図1)。

3. 食作用のセットアップとフローサイトメトリー染色

1. 再懸濁したCNS-MPs20 μL(≈200,000細胞)を新鮮な5 mL丸底チューブに移し、氷冷した1× PBSを80 μL加えます。このチューブに蛍光基質やフローサイトメトリー抗体を添加しないでください。これらの細胞は、フローサイトメトリー分析のためのCNS-MPsのバックグラウンド蛍光を決定するためのネガティブコントロールとして機能します。
2. 単離されたCNS-MPの生存率を確立するには、アミンベースの生/死用色素(Fixable Blue UVなど)を使用します。
   1. 残りの細胞ペレットを500 μLの1× PBSに再懸濁し、再構成した色素1 μLをネガティブコントロールを除く各サンプルチューブに加えます。
   2. 穏やかにボルテックスし、チューブをホイルで覆い、室温で30分間インキュベートします。その後、1×PBSの1mLを各チューブに加え、穏やかにボルテックスします。
   3. 細胞を1,400 × g で4°Cで2分間遠心分離します。 上清を速やかに注ぎ取り、細胞ペレットを1×PBSの100μLに再懸濁します。
      注:アミンベースの色素は、細胞外Aβ線維に結合し、食作用の結果を交絡させます。他の生死インジケーターは、Aβ線維/ミクロスフェアの蛍光を妨害する可能性があります。したがって、単離されたCNS-MPの生存率を確立するための予備実験でのみLive/deadインジケーターを使用することをお勧めします。
3. PE-ポリスチレンミクロスフェアを含むチューブを徹底的にボルテックスし、ネガティブコントロールを除くフローチューブ内の細胞懸濁液100μLに2μL(≈200マイクロスフェア/セル)を加えます。各チューブを穏やかにボルテックスして、基質と細胞が均等に分布するようにし、丸底チューブを滅菌加湿インキュベーターに37°C、5%_CO2で30分間置きます。
   1. ネガティブコントロールチューブを穏やかにボルテックスしてインキュベートし、ポジティブサンプルとネガティブサンプルの間で同様の実験条件を確保します。
      注:PEミクロスフェアの代わりにAβフィブリルを使用する場合は^{、前述のように蛍光}HiLyte488 Aβフィブリルを調製してください9。Aβフィブリルの最終濃度は200 μMで、これを希釈して蛍光AβモノマーのPBS中に新鮮な20 μMストックを調製します。20 μMのストックAβモノマー12.5 μLを、単離された細胞を含む各チューブに加えます。
4. インキュベーターから細胞を取り出し、1×PBSの1mLを各チューブに加え、穏やかにボルテックスします。細胞を1,400 × gで4°Cで2分間遠心分離し、上清をすばやく注ぎます。1 mL 1× PBSで洗浄を繰り返し、1,400 × g で2分間遠心分離し、上清を注ぎ取り、細胞ペレットを1× PBSの100 μLに再懸濁します。
   注:各スピン後、進行中の食作用の取り込みを阻害するために、細胞を氷上に保持することが重要です。
5. フローサイトメトリー抗体をボルテックスし、微量遠心分離機で10秒間遠心分離します。各細胞懸濁液チューブに、Aβ食作用アッセイ用のCD11b-APC/Cy7およびCD45-PE/Cy7、またはPEマイクロスフェア食作用用のCD45-FITC をそれぞれ1 μL添加します。各チューブを穏やかにボルテックスし、室温で30分間暗所でインキュベートします。
   注:ユーザーは、培養BV2ミクログリアまたは腹膜マクロファージなどの強力な食細胞を含む別のチューブを陽性対照として含め、それらをPEミクロスフェアおよび上記のようにフローサイトメトリー抗体で治療することもできます。このサンプルからのデータは、予備実験で真の食作用を示すポジティブコントロールを定義するために使用できます。
6. 細胞をインキュベーションしている間に、丸底の5 mLフローチューブ4本を使用してコンペンセーションチューブをセットします。コンペンセーションビーズを十分にボルテックスし、各チューブに1滴加えます。1 μL の CD11b-APC/Cy7 を 1 本目のチューブに加え、2 本目のチューブに CD45-FITC を加えます。3本目のチューブに1μLのPEポリスチレンを加え、4本目のチューブに染色されていないコンペンセーションビーズを保管します。この4本目のチューブをネガティブコントロールとして使用して、フローサイトメーターにコンペンセーションパネルを設置します。
   注:Aβフィブリルを使用して食作用を研究する場合は、CD45-FITCの代わりにCD45-PECy7をセカンドチューブに追加してください。1 μL の別個の FITC タグ付きフローサイトメトリー抗体または FITC 二次抗体 (任意の動物種) を 3 本目のコンペンセーションチューブに加えます。ビーズはAβ線維に結合できず、補償チューブを洗浄すると洗い流されるため、これは重要です。
7. コンペンセーションビーズをそれぞれの抗体と少なくとも10分間インキュベートします。インキュベーション後、各チューブに1×PBS1 mLを加え、1,400 x g で4°Cで2分間遠心分離し、上清を速やかに注ぎ出します。コンペンセーションチューブを氷の上に置き、フローサイトメトリーまでホイルで覆います。
8. フローサイトメトリー抗体とのインキュベーション後、染色した細胞を1×PBS1 mLで洗浄します。細胞を1,400 × g で4°Cで2分間、穏やかにボルテックスし、遠心分離します。 上清をすばやく注ぎ取り、1 mL 1× PBSで洗浄を繰り返します。遠心分離後、上清を注ぎ取り、細胞ペレットを100 μLの1× PBSに再懸濁します。
9. サンプルチューブを氷の上に置き、フローサイトメトリーまでアルミホイルで覆います。
   注:実験全体を通して、Ca²⁺/Mg²⁺ を含まない1× PBS(pH 7.0)をフローバッファーとして使用します。ミクログリアの活性化を避けるために、フローバッファー中のウシ胎児血清(FBS)を必ず除外してください。

4. フローサイトメトリーと解析

1. 機器のセットアップと補正
   注:この原稿の実験は、紫外線、紫色、青色、黄緑色、赤色のレーザーを用いたフローサイトメーターで行いました。この実験は、青色、黄緑色、赤色のレーザーのみを使用する3レーザーフローサイトメーターにも適応できます。ユーザーは、機器を取り扱う前に正式なトレーニングを受ける必要があります。
   1. フローシースバッファータンクを補充し、サイトメーターの電源を入れます。ddH₂Oを含む5 mLの丸底フローチューブでサイトメーターを「プライム」し、フローサイトメーターに接続されたコンピューター上の分析ソフトウェアにログインします。「実験」を作成し、パラメータとしてFSC、SSC、FITC、PECy7、APC-Cy7を選択します。PEマイクロスフェアを使用する場合は、パラメータパネルでPECy7の代わりにPEを選択します。
   2. 適切な報酬パネルを作成します。
      注:私たちの実験では、通常、補償ビーズのFSC / SSC電圧は約350/280ですが、CNS-MPのFSC / SSC電圧は約320/260です。これらの値は、任意の2つの異なるサイトメーター間で異なる場合があり、実際の実験の前にキャリブレーションする必要があります。
   3. 各コンペンセーションチューブと細胞懸濁液チューブを500μLの1×PBSで再構成し、短時間ボルテックスして氷上に置きます。ネガティブコントロール/未染色ビーズチューブを運転して、各蛍光色素ヒストグラムのピークが10²未満になるように適切な電圧を設定します。他の単色補正チューブを走らせて、それらの明確な正のピークを特定します。
      注:各蛍光色素の正と負のピークの間には、少なくとも半分のlog(基数10)の差が必要です。
   4. 各コンペンセーションチューブから5000のイベントを記録して、コンピューターがコンペンセーション設定を自動計算できるようにします。補正設定を現在の実験²⁵にリンクします。
   5. サンプルタブの下に新しい「チューブ」を作成します。未染色のCNS-MPsを含むネガティブコントロールチューブを静かにボルテックスし、運転し、順方向および側方散乱電圧を調整して、関心のある集団を捕捉します。イベントとサブゲートをライブCNS-MPsに以下のように記録します。
   6. 後続のすべてのチューブからイベントをキャプチャして記録し、パラメーターと電圧の一貫性を保つために、別々のファイルとして記録します。各チューブをゆっくりとボルテックスしてから、フローサイトメーターに流します。
2. 食作用のゲーティング戦略と測定
   1. すべてのCNS-MPを捕捉するための初期単核ゲートを描画します。これらの生きた単核細胞は、次のグラフでゲーティングされ、カプレットとトリプレットを除く単一細胞のみを含める必要があります。
   2. ゲート化された単一の生きたCNS-MP集団を、CD11bおよびCD45蛍光色素を示す後続のグラフに投影します。
      注:脳内常在ミクログリアは通常CD11b ⁺ CD45^中間体ですが、浸潤マクロファージはCD11b ⁺ CD45^高です。ミクログリア(Ly6c^低CD45^中間体)から炎症性単球(Ly6c^高およびCD45^高)をさらに自信を持って分離するために、Ly6cなどの追加のマーカーをパネルに含めることができます。
   3. 図2Fに示すように、それぞれの集団における食作用をさらに研究するために、適切なゲートを適用します。
      注:CNS-MPの食作用は、Hilyte488/Alexa488(Aβ)またはPE(マイクロスフェア)蛍光取り込みの関数として測定されます。それぞれのヒストグラム上の明確な正のピークは、CNS-MPが基質を食作用させたことを示しています。貪食される材料の量は、蛍光の強度に正比例します。したがって、複数のピークの存在は、食作用が高いと解釈する必要があります。これらは、その後、免疫組織化学によって確認することができます。
   4. フローサイトメーターにすべてのサンプルチューブを記録した後、データファイルを.fcs形式でエクスポートして、さらに分析します。
3. 統計データ解析
   1. あらゆるフローサイトメトリー解析ソフトウェアを、スプレッドシートや統計解析ソフトウェアとともに使用して、すべてのデータ解析を行うことができます。
   2. .fcsファイルを解析ソフトウェアに追加し、最初のファイルをダブルクリックします。記録されたすべての
      イベントが表示されます。 図2 に示すのと同様のゲーティング戦略に従って、その後、単一の生きた単核細胞をゲートし、特定の集団、例えばCD11b ⁺ CD45^中間ミクログリア細胞の食作用を研究します(図2H)。
      注:食作用指数は、蛍光Aβフィブリルまたは≥1マイクロスフェアを内在化する細胞の割合に基づいて評価されます。前に定義したように、低レベルの食作用は少なくとも1つのマイクロスフェアの取り込みであり、高レベルの食作用は>1^{ビーズの取り込み8,9}です。これまでの実験から、サイトカラシンDによるアクチン依存性プロセスの阻害は、>1ビーズの取り込みを完全に阻害し、1ビーズの取り込み^を部分的に阻害する9だけでなく、Aβの取り込みも完全に阻害し、細胞表面への受動的な結合ではなく、アクチン依存的な食作用の取り込みを確認することが確認されました。免疫細胞化学はまた、マイクロスフェアアッセイの各逐次ピークが、食作用^8,9のビーズ数の単一増加を表していることも^{確認しています。}

結果

急性単離されたCNS-MPsによるミクロスフェアおよびAβ42フィブリルの食作用取り込みの典型的な結果を例示するために、一過性中脳動脈閉塞(MCAO⁾⁸後の同側半球から急性単離されたCNS-MPが得られた。MCAOモデルにおけるCNS-MPの食作用特性の詳細については、先行論文⁸を参照してください。簡単に言うと、72時間の回復後、CNS-MPは、機械?...

ディスカッション

フローサイトメトリーは、蛍光標識プローブ(通常は抗体)を使用して細胞表面または細胞内コンパートメントでの目的のタンパク質またはマーカーの発現を検出できる技術です。細胞表面抗体または細胞内抗体は、通常、独自の発光スペクトルを持つレーザー励起性蛍光色素と結合します。これらの抗体でインキュベートされた細胞は、これらのマーカーの発現パタ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.