Approche de cytométrie en flux pour caractériser les propriétés phagocytaires de microglie adulte isolée de manière aiguë et de macrophages cérébraux in vitro

Résumé

L’évaluation des propriétés phagocytaires des microglies et des macrophages cérébraux peut apporter une dimension fonctionnelle précieuse aux études de profilage moléculaire. Nous décrivons un protocole validé qui utilise la cytométrie en flux pour quantifier rapidement et de manière fiable la phagocytose des microsphères fluorescentes et des fibrilles bêta-amyloïdes par des microglies et des macrophages cérébraux isolés de manière aiguë à partir de modèles murins.

Résumé

La microglie et les macrophages infiltrant le système nerveux central (SNC), collectivement appelés phagocytes mononucléaires du SNC (CNS-MPS), jouent un rôle central dans les maladies neurologiques, notamment la neurodégénérescence et les accidents vasculaires cérébraux. Les MP-SNC sont impliqués dans la clairance phagocytaire des protéines pathologiques, des débris et des synapses neuronales, chacune ayant des voies moléculaires sous-jacentes distinctes. La caractérisation de ces propriétés phagocytaires peut fournir une lecture fonctionnelle qui complète le profilage moléculaire de la microglie à l’aide des approches traditionnelles de cytométrie en flux, de transcriptomique et de protéomique. Le profilage phagocytaire de la microglie s’est appuyé sur la visualisation microscopique et les cultures in vitro de la microglie néonatale de souris. La première approche souffre d’un échantillonnage limité, tandis que la seconde approche est intrinsèquement peu représentative de l’état réel in vivo des MP-SNC adultes. Cet article décrit des protocoles optimisés pour les propriétés phagocytaires phénotypiques des CNS-MP de souris isolées de manière aiguë par cytométrie en flux. Les MP-SNC sont isolés de manière aiguë du cerveau de souris adulte par dissociation mécanique suivie d’une centrifugation à gradient de densité, incubés avec des microsphères fluorescentes ou des fibrilles Aβ fluorescentes, lavés, puis marqués avec des panels d’anticorps contre les marqueurs de surface (CD11b, CD45). En utilisant cette approche, il est possible de comparer les propriétés phagocytaires de la microglie résidente du cerveau avec les macrophages infiltrant le SNC, puis d’évaluer l’effet du vieillissement et de la pathologie de la maladie sur ces phénotypes phagocytaires. Cette méthode rapide a également le potentiel de phénotyper fonctionnellement des MP-CNS humains isolés de manière aiguë à partir d’échantillons cérébraux post-mortem ou chirurgicaux. De plus, des mécanismes spécifiques de phagocytose par des sous-ensembles du SNC-MP peuvent être étudiés en inhibant certaines voies phagocytaires.

Introduction

Les cellules immunitaires innées du système nerveux central (SNC) sont principalement composées de microglies et de monocytes/macrophages infiltrants, appelés ensemble phagocytes mononucléaires du SNC (SNC-MP)¹. Les MP-SNC sont impliqués dans les maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer (MA), les troubles neuro-inflammatoires et les accidents vasculaires cérébraux ^2,3,4. Les MP-SNC, ainsi que les astrocytes, les péricytes et les cellules épendymaires, ont des fonctions phagocytaires ^5,6. Dans leur état homéostatique, les MP-SNC sont impliqués dans la surveillance constante du microenvironnement local, ainsi que dans l’élimination phagocytaire des débris cellulaires et des protéines apoptotiques, et l’élagage synaptique pour remodeler les connexions neuronales 7,8,9,10. Dans les maladies neurodégénératives telles que la MA, les MP-SNC adoptent des phénotypes moléculaires et fonctionnels distincts associés à la maladie qui peuvent jouer des rôles pathologiques, notamment l’élimination de la bêta-amyloïde agrégée (Aβ) et des éléments neuronaux, ainsi que la libération de cytokines et de facteurs inflammatoires, entraînant des rôles protecteurs pro-inflammatoires, préjudiciables et anti-inflammatoires^complexes 11,12,13,14 . La phagocytose des macroparticules, des débris cellulaires, des protéines et d’autres particules infectieuses par les MP-SNC est médiée par des récepteurs distincts exprimés à leur surface⁹. La perturbation de ces voies phagocytaires peut entraîner une clairance défectueuse et une accumulation progressive d’Aβ, conduisant finalement à des lésions neuronales progressives dans AD ^4,9. Bien que les progrès réalisés dans le profilage moléculaire des MP-SNC à l’aide d’approches transcriptomiques et protéomiques aient fourni des informations inestimables sur l’hétérogénéité moléculaire au sein des MP-SNC dans les maladies neurologiques^15,16, la caractérisation fonctionnelle des propriétés phagocytaires des MP-SNC et de leurs sous-ensembles fait actuellement défaut. La caractérisation fonctionnelle des propriétés phagocytaires des MP-SNC peut compléter les stratégies de profilage moléculaire, faciliter un meilleur phénotypage fonctionnel et aider à évaluer l’efficacité des traitements capables de rectifier la phagocytose défectueuse dans les modèles de maladies¹⁷.

Les tests traditionnels de phagocytose pour les MP-SNC comprennent l’incubation de la microglie primaire avec des substrats fluorescents tels que l’Aβ ou les particules de latex/polystyrène. La phagocytose est ensuite étudiée en fonction de l’absorption du substrat fluorescent à l’aide de la microscopie d’immunofluorescence 18,19,20. Il est bien établi que les MP-SNC, lorsqu’ils sont maintenus dans de longues cultures, peuvent modifier radicalement leur morphologie et leurs profils transcriptionnels^21,22. Cela entrave l’étude des propriétés phagocytaires des MP-SNC dans leur état représentatif dans le SNC. Un test de cytométrie en flux fonctionnel pour profiler des MP-SNC vivants isolés de manière aiguë peut fournir une évaluation rapide des propriétés phagocytaires et peut échantillonner un pool beaucoup plus important de MP-CNS que les approches de microscopie ^9,23. De plus, la cytométrie en flux élimine la nécessité de maintenir les MP-SNC en culture et fournit une plate-forme pour étudier les propriétés phagocytotiques dans différentes sous-populations de MP-SNC. Ce manuscrit décrit des protocoles optimisés pour les propriétés phagocytaires phénotypiques des CNS-MP de souris isolées de manière aiguë par cytométrie en flux. L’adaptation des tests de phagocytose à l’aide de la cytométrie en flux permet un multiplexage rapide du phénotype phagocytaire des MP-SNC couplé à un phénotypage immunitaire, fournissant ainsi des informations sur l’hétérogénéité des propriétés phagocytaires au sein des MP-SNC à la résolution d’une seule cellule.

Protocole

Toutes les études sur les souris ont été menées après avoir obtenu l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Emory, et en stricte conformité avec le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health.

1. Préparation le jour de l’isolement

1. Préparez un seau à glace pour garder tous les réactifs, tampons et suspensions cellulaires froids tout au long de la procédure d’isolement.
2. Placez le flacon de 1× de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (au moins 1 L) à 4 °C pendant 30 min à 1 h avant la perfusion et conservez 1× PBS sur de la glace pendant la procédure de perfusion et d’isolement.
3. Préparez la concentration de travail du milieu à gradient de densité (appelée SIP à 35 %, voir le tableau des matériaux).
4. Étiquetez tous les tubes de cytométrie conique et en flux utilisés dans l’expérience avant l’isolement des cellules afin d’éviter les retards dans les délais de traitement. De plus, rassemblez toutes les autres fournitures nécessaires à l’isolement avant la perfusion, telles que des filtres à cellules de 40 μm, des seringues et des aiguilles.

2. Isolement aigu de la microglie de souris adulte

1. Anesthésier une souris adulte en la plaçant dans une chambre d’induction en verre avec de l’isoflurane (5 ml) jusqu’à ce qu’elle cesse de respirer et ne réponde plus au pincement de la patte arrière.
2. À l’aide d’une aiguille de 26 g et d’une seringue de 10 ml, effectuez une perfusion cardiaque avec 30 ml de PBS 1× glacé jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de sang visible.
3. Décapitez la souris avec des ciseaux chirurgicaux. Utilisez de petits ciseaux pour couper la peau, exposant le crâne. Retirez le crâne sans endommager le tissu cérébral comme décrit²⁴. Retirez immédiatement le cerveau et transférez-le dans une crépine stérile de 40 μm placée sur un tube conique de 50 mL.
4. Utilisez l’arrière du piston d’une seringue de 3 mL pour pousser le cerveau à travers la crépine et dissocier mécaniquement tout le tissu cérébral. Lavez la crépine et le piston de la cellule par intermittence pendant la dissociation avec 2 ml de PBS 1× glacé à chaque fois pour vous assurer que tous les tissus passent à travers la crépine.
5. Raclez le fond de la crépine de la cellule avec le piston pour recueillir toute suspension résiduelle dans la conique. Rincez abondamment la crépine à cellules avec du PBS 1× glacé et versez la suspension dans le tube conique de 50 ml.
   REMARQUE : Lors du traitement de plusieurs animaux en série, placez les suspensions cellulaires sur de la glace jusqu’à ce que le traitement soit ultérieur.
6. Ajouter du PBS 1× glacé pour porter le volume de la suspension cellulaire à 30 mL et centrifuger à 800 × g pendant 5 min à 4 °C.
7. Verser le surnageant sans déranger la pastille et remettre la pastille en suspension dans 6 mL de SIP à 35 % avec une pipette sérologique de 10 mL. Transférez la suspension cellulaire + 35 % de mélange SIP dans un nouveau tube conique de 15 mL et centrifugez à 800 × g pendant 25 min à 15 °C sans frein.
   ATTENTION : Faites particulièrement attention à éviter l’introduction de bulles lors de la remise en suspension. Des bulles excessives peuvent nuire au rendement cellulaire.
8. Retirez délicatement le tube conique de 15 mL de la centrifugeuse sans déranger les couches et aspirez la couche supérieure de myéline flottante.
9. Transférer la suspension cellulaire + le mélange SIP 35 % à l’aide d’une pipette sérologique de 10 mL dans un nouveau tube conique de 50 mL contenant 30 mL de PBS 1× glacé et centrifuger à 800 × g pendant 5 min à 4 °C. Versez délicatement le surnageant, en laissant derrière vous la pastille de cellule avec 500\u2012800 μL de 1× PBS.
10. Remettez la pastille en suspension en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette p1000 et transférez-la dans un tube à fond rond de 5 ml. Ajouter 2 ml de PBS 1× glacé dans le tube à fond rond et centrifuger à 1 400 × g pendant 2 min à 4 °C. Versez rapidement le surnageant, en laissant la pastille de cellule contenant des MP-SNC dans environ 100 μL de PBS 1× (figure 1).

3. Mise en place de la phagocytose et coloration par cytométrie en flux

1. Transférez 20 μL (≈ 200 000 cellules) des CNS-MP remis en suspension dans un tube à fond rond frais de 5 ml et ajoutez 80 μL de PBS 1× glacé. N’ajoutez pas de substrats fluorescents ou d’anticorps de cytométrie en flux dans ce tube. Ces cellules servent de contrôle négatif pour déterminer la fluorescence de fond des MP-SNC pour les analyses de cytométrie en flux.
2. Pour établir la viabilité des MP-SNC isolés, utilisez des colorants vivants/morts à base d’amines (p. ex., Fixable Blue UV).
   1. Remettre en suspension le reste de la pastille cellulaire dans 500 μL de PBS 1× et ajouter 1 μL du colorant reconstitué dans chaque tube d’échantillon, à l’exception du témoin négatif.
   2. Agitez doucement, couvrez les tubes d’une feuille d’aluminium et incubez-les à température ambiante pendant 30 min. Par la suite, ajoutez 1 mL de PBS 1× dans chaque tube et agitez doucement.
   3. Centrifugez les cellules à 1 400 × g pendant 2 min à 4 °C. Versez rapidement le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS 1×.
      REMARQUE : Les colorants à base d’amines se lient aux fibrilles Aβ extracellulaires, confondant les résultats de la phagocytose. D’autres indicateurs vivants/morts peuvent interférer avec la fluorescence des fibrilles/microsphères Aβ. Par conséquent, il est conseillé de n’utiliser l’indicateur Live/dead que dans des expériences préliminaires afin d’établir la viabilité des MP-CNS isolés.
3. Tourbillonner complètement le tube contenant des microsphères de polystyrène PE et ajouter 2 μL (≈200 microsphères/cellule) à 100 μL de suspension cellulaire dans les tubes d’écoulement, à l’exception du témoin négatif. Agitez doucement chaque tube pour assurer une répartition égale du substrat avec les cellules et placez les tubes à fond rond dans un incubateur humide stérile pendant 30 min à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   1. Manipulez doucement et incubez le tube de contrôle négatif pour assurer des conditions expérimentales similaires entre les échantillons positifs et négatifs.
      REMARQUE : Si vous utilisez des fibrilles Aβ au lieu de microsphères PE, préparez des fibrilles fluorescentes HiLyte488 Aβ comme décrit précédemment⁹. La concentration finale des fibrilles Aβ est de 200 μM qui sont ensuite diluées pour préparer un stock frais de 20 μM dans du PBS de monomères Aβ fluorescents. Ajouter 12,5 μL des 20 μM de monomères Aβ de base dans chaque tube contenant des cellules isolées.
4. Retirez les cellules de l’incubateur et ajoutez 1 ml de PBS 1× dans chaque tube et agitez doucement. Centrifugez les cellules à 1 400 × g pendant 2 min à 4 °C et versez rapidement le surnageant. Répéter le lavage avec 1 mL de PBS 1×, centrifuger à 1 400 × g pendant 2 min, vider le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS 1×.
   REMARQUE : Après chaque rotation, il est important de garder les cellules sur de la glace pour inhiber l’absorption progressive des phagocytes.
5. Vortex les anticorps de cytométrie en flux et les centrifuger dans une microcentrifugeuse pendant 10 s. À chaque tube de suspension cellulaire, ajoutez 1 μL de CD11b-APC/Cy7 et de CD45-PE/Cy7 pour le dosage de la phagocytose Aβ, ou de CD45-FITC pour la phagocytose des microsphères PE. Agitez doucement chaque tube et incubez dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
   REMARQUE : Les utilisateurs peuvent également inclure un tube séparé contenant des cellules phagocytaires puissantes telles que la microglie BV2 en culture ou les macrophages péritonéaux comme contrôle positif et les traiter avec des microsphères PE et des anticorps cytométriques en flux comme décrit ci-dessus. Les données de cet échantillon peuvent être utilisées pour définir le contrôle positif dénotant une véritable phagocytose dans les expériences préliminaires.
6. Pendant que les cellules sont en incubation, installez des tubes de compensation à l’aide de quatre tubes d’écoulement à fond rond de 5 ml. Tourbillonnez soigneusement les billes de compensation et ajoutez 1 goutte dans chaque tube. Ajoutez 1 μL de CD11b-APC/Cy7 dans le premier tube et de CD45-FITC dans le deuxième tube. Ajoutez 1 μL de polystyrène PE dans le troisième tube et conservez les billes de compensation non colorées dans le quatrième tube. Utilisez ce quatrième tube comme contrôle négatif pour mettre en place un panneau de compensation sur le cytomètre en flux.
   REMARQUE : Lorsque les fibrilles Aβ sont utilisées pour étudier la phagocytose, ajoutez CD45-PECy7 dans la deuxième sonde au lieu de CD45-FITC. Ajouter 1 μL d’anticorps de cytométrie en flux marqué FITC ou d’anticorps secondaire FITC (n’importe quelle espèce) dans le troisième tube de compensation. Ceci est important car les billes ne peuvent pas se lier aux fibrilles Aβ et seront emportées lors du lavage des tubes de compensation.
7. Laissez les billes de compensation incuber avec leurs anticorps respectifs pendant au moins 10 min. Après l’incubation, ajouter 1 mL de PBS 1× dans chaque tube, centrifuger à 1 400 x g pendant 2 min à 4 °C et vider rapidement le surnageant. Placez les tubes de compensation sur de la glace et couvrez-les de la feuille jusqu’à la cytométrie en flux.
8. Après l’incubation avec des anticorps de cytométrie en flux, laver les cellules colorées avec 1 mL de PBS 1×. Agiter doucement et centrifuger les cellules à 1 400 × g pendant 2 min à 4 °C. Versez rapidement le surnageant et répétez le lavage avec 1 ml de PBS 1×. Après la centrifugation, videz le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 100 μL de PBS 1×.
9. Placez les tubes d’échantillon sur de la glace et couvrez-les de papier d’aluminium jusqu’à la cytométrie en flux.
   REMARQUE : Utilisez 1× PBS (pH 7,0) sans Ca²⁺/Mg²⁺ comme tampon d’écoulement tout au long de l’expérience. Assurez-vous d’exclure le sérum fœtal bovin (FBS) dans le tampon d’écoulement pour éviter une éventuelle activation microgliale.

4. Cytométrie en flux et analyse

1. Réglage et compensation de l’instrument
   REMARQUE : Les expériences de ce manuscrit ont été réalisées sur un cytomètre en flux avec des lasers ultraviolets, violets, bleus, jaune-vert et rouges. Cette expérience peut également être adaptée à des cytomètres en flux à trois lasers avec des lasers bleus, jaune-vert et rouges uniquement. Les utilisateurs doivent suivre une formation formelle avant de manipuler l’instrument.
   1. Remplissez le réservoir tampon de la gaine d’écoulement et allumez le cytomètre. « amorcez » le cytomètre avec un tube à fond rond de 5 mL contenant du ddH₂O. Connectez-vous au logiciel d’analyse sur l’ordinateur connecté au cytomètre en flux. Créez une « expérience » et sélectionnez FSC, SSC, FITC, PECy7 et APC-Cy7 comme paramètres. Si vous utilisez des microsphères PE, sélectionnez PE au lieu de PECy7 dans le panneau des paramètres.
   2. Créez un panneau de rémunération approprié.
      REMARQUE : Dans nos expériences, les tensions FSC/SSC pour les billes de compensation sont généralement d’environ 350/280, tandis que les tensions FSC/SSC pour les CNS-MP sont d’environ 320/260. Ces valeurs peuvent varier entre deux cytomètres différents et doivent être calibrées avant l’expérience proprement dite.
   3. Reconstituez chaque tube de compensation et de suspension cellulaire avec 500 μL de PBS 1×, utilisez brièvement un vortex et placez-le sur de la glace. Faites fonctionner le tube à billes de commande négative/non colorées pour régler les tensions appropriées de sorte que le pic sur chaque histogramme de fluorophore soit inférieur à 10². Exécutez les autres tubes de compensation unicolore pour identifier leurs pics positifs distincts.
      REMARQUE : Il doit y avoir au moins la moitié de la différence logarithmique (base 10) entre les pics positifs et négatifs de chaque fluorophore.
   4. Enregistrez 5000 événements à partir de chaque tube de compensation pour permettre à l’ordinateur de calculer automatiquement la configuration de compensation. Relier le dispositif de compensation à l’expérience en cours²⁵.
   5. Créez un nouveau « tube » sous l’onglet échantillon. Manipulez doucement et faites fonctionner le tube de contrôle négatif contenant des CNS-MP non colorés. Ajustez les tensions de diffusion directe et latérale pour capturer la population d’intérêt. Enregistrez les événements et le sous-gate sur les CNS-MP en direct comme mentionné ci-dessous.
   6. Capturez et enregistrez les événements de tous les tubes suivants dans des fichiers séparés, en maintenant les paramètres et les tensions cohérents. Faites tourner doucement chaque tube avant de les faire passer sur le cytomètre en flux.
2. Stratégie de déclenchement et mesure de la phagocytose
   1. Dessiner une première porte mononucléaire pour capturer tous les CNS-MP. Ces cellules mononucléées vivantes doivent être fermées dans le graphique suivant pour n’inclure que les cellules simples, à l’exclusion des couplets et des triplets.
   2. Projetez la population de CNS-MP uniques et vivants sur un graphique ultérieur affichant les fluorophores CD11b et CD45.
      REMARQUE : Les microglies résidentes du cerveau sont généralement CD11b ⁺ CD45^{intermédiaires}, tandis que les macrophages infiltrants ont^{un taux élevé de} CD11b ⁺ CD45. Des marqueurs supplémentaires tels que Ly6c peuvent être inclus dans le panel pour séparer avec plus de confiance les monocytes inflammatoires (Ly6c^élevé et CD45^élevé) de la microglie (Ly6c^faible CD45^{intermédiaire}).
   3. Appliquer les portes appropriées pour étudier plus en détail la phagocytose dans les populations respectives, comme le montre la figure 2F.
      REMARQUE : La phagocytose dans les MP-SNC est mesurée en fonction de leur absorption de fluorescence Hilyte488/Alexa488 (Aβ) ou PE (microsphère). Des pics positifs distincts sur leurs histogrammes respectifs indiquent que les MP-SNC ont phagocyté le substrat. La quantité de matière phagocytée est directement proportionnelle à l’intensité de la fluorescence. Par conséquent, la présence de plusieurs pics doit être interprétée comme une phagocytose plus élevée. Ceux-ci peuvent être confirmés par la suite par l’immunohistochimie.
   4. Après avoir enregistré tous les tubes d’échantillon sur le cytomètre en flux, exportez les fichiers de données au format .fcs pour une analyse plus approfondie.
3. Analyse statistique des données
   1. Utilisez n’importe quel logiciel d’analyse de cytométrie en flux ainsi que des tableurs et des logiciels d’analyse statistique pour toutes les analyses de données.
   2. Ajoutez les fichiers .fcs au logiciel d’analyse et double-cliquez sur le premier fichier. Un graphique affichant l’ensemble des enregistrements
      des événements apparaîtront. Suivez une stratégie de contrôle similaire à celle illustrée à la figure 2 pour ensuite contrôler des cellules mononucléées uniques et vivantes et étudier la phagocytose sur une population spécifique, par exemple les cellules microgliales^{intermédiaires} CD11b ⁺ CD45 (Figure 2H).
      REMARQUE : L’indice phagocytaire est évalué en fonction de la proportion de cellules internalisant des fibrilles Aβ fluorescentes ou ≥1 microsphère(s). Comme défini précédemment, la phagocytose de bas niveau est l’absorption d’au moins 1 microsphère et la phagocytose de haut niveau est >absorption de 1 bille ^8,9. Sur la base d’expériences antérieures, l’inhibition des processus dépendants de l’actine par la cytochalasine D inhibe complètement l’absorption de billes >1 et inhibe partiellement l’absorption de 1 bille⁹ ainsi que l’absorption complète d’Aβ, confirmant l’absorption phagocytaire dépendante de l’actine plutôt que la liaison passive à la surface cellulaire. L’immunocytochimie confirme également que chaque pic séquentiel dans le dosage des microsphères est représentatif d’une augmentation unitaire du nombre de billes phagocytées ^8,9.

Résultats

À titre d’exemple, des MP-CNS isolés de manière aiguë ont été obtenus à partir de l’hémisphère ipsilatéral après une occlusion artérielle cérébrale moyenne transitoire (MCAO)⁸. Pour plus de détails sur les propriétés phagocytaires des MP-SNC dans le modèle MCAO, veuillez vous référer aux publications précédentes⁸. Brièvement, après une récupération de 72 heures, les MP-SNC ont été isolés de manière aiguë d...

Discussion

La cytométrie en flux est une technique qui permet de détecter l’expression de protéines ou de marqueurs d’intérêt à la surface de la cellule ou dans des compartiments intracellulaires à l’aide de sondes marquées par fluorescence (généralement des anticorps) pour marquer ces marqueurs d’intérêt. Les anticorps à la surface cellulaire ou intracellulaires sont généralement conjugués à des fluorochromes excitables par laser qui ont des spectres d’émission uniques....

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.