Abordagem de citometria de fluxo para caracterizar propriedades fagocíticas de micróglia adulta e macrófagos cerebrais agudamente isolados in vitro

Resumo

A avaliação das propriedades fagocíticas da microglia e dos macrófagos cerebrais pode fornecer uma dimensão funcional valiosa para estudos de perfil molecular. Descrevemos um protocolo validado que usa citometria de fluxo para quantificar de forma rápida e confiável a fagocitose de microesferas fluorescentes e fibrilas beta amilóides por micróglia agudamente isolada e macrófagos cerebrais de modelos de camundongos.

Resumo

Os macrófagos infiltrantes da microglia e do sistema nervoso central (SNC), coletivamente chamados de fagócitos mononucleares do SNC (MP-SNC), desempenham papéis centrais em doenças neurológicas, incluindo neurodegeneração e acidente vascular cerebral. Os CNS-MPs estão envolvidos na depuração fagocítica de proteínas patológicas, detritos e sinapses neuronais, cada uma com vias moleculares subjacentes distintas. A caracterização dessas propriedades fagocíticas pode fornecer uma leitura funcional que complementa o perfil molecular da microglia usando abordagens tradicionais de citometria de fluxo, transcriptômica e proteômica. O perfil fagocítico da microglia baseou-se na visualização microscópica e em culturas in vitro da microglia neonatal de camundongos. A primeira abordagem sofre de amostragem limitada, enquanto a última abordagem é inerentemente pouco reflexiva do verdadeiro estado in vivo de CNS-MPs adultos. Este artigo descreve protocolos otimizados para propriedades fagocíticas de fenótipos de CNS-MPs de camundongos agudamente isolados por citometria de fluxo. Os CNS-MPs são isolados agudamente do cérebro de camundongos adultos usando dissociação mecânica seguida de centrifugação com gradiente de densidade, incubados com microesferas fluorescentes ou fibrilas Aβ fluorescentes, lavados e depois marcados com painéis de anticorpos contra marcadores de superfície (CD11b, CD45). Usando essa abordagem, é possível comparar as propriedades fagocíticas da micróglia residente no cérebro com macrófagos infiltrantes no SNC e, em seguida, avaliar o efeito do envelhecimento e da patologia da doença nesses fenótipos fagocíticos. Este método rápido também tem potencial para fenotipar funcionalmente MP-MPs do SNC humano agudamente isolados a partir de amostras cerebrais post-mortem ou cirúrgicas. Além disso, mecanismos específicos de fagocitose por subconjuntos de SNC-MP podem ser investigados inibindo vias fagocíticas selecionadas.

Introdução

As células imunes inatas do sistema nervoso central (SNC) são predominantemente compostas por micróglia e monócitos/macrófagos infiltrantes, juntos chamados de fagócitos mononucleares do SNC (SNC-MPs)¹. Os MP-SNC estão implicados em doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer (DA), distúrbios neuroinflamatórios e acidente vascular cerebral ^2,3,4. Os MPs do SNC, juntamente com os astrócitos, pericitos e células ependimárias, têm funções fagocíticas ^5,6. Em seu estado homeostático, os CNS-MPs estão envolvidos na vigilância constante do microambiente local, juntamente com a depuração fagocítica de detritos celulares e proteínas apoptóticas e poda sináptica para remodelar as conexões neuronais 7,8,9,10. Em condições neurodegenerativas, como a DA, os CNS-MPs adotam fenótipos moleculares e funcionais distintos associados à doença que podem desempenhar papéis patológicos, incluindo a depuração de beta-amilóide agregado (Aβ) e elementos neuronais, bem como a liberação de citocinas inflamatórias e fatores, resultando em papéis protetores complexos pró-inflamatórios, prejudiciais e anti-inflamatórios 11,12,13,14 . A fagocitose de macropartículas, detritos celulares, proteínas e outras partículas infecciosas por SNC-MPs é mediada por receptores distintos expressos em sua superfície⁹. A interrupção nessas vias fagocíticas pode levar a uma depuração defeituosa e acúmulo progressivo de Aβ, levando a danos neuronais progressivos na AD ^4,9. Embora os avanços no perfil molecular de CNS-MPs usando abordagens transcriptômicas e proteômicas tenham fornecido informações valiosas sobre a heterogeneidade molecular dentro de CNS-MPs em doenças neurológicas^15,16, a caracterização funcional das propriedades fagocíticas de CNS-MPs e seus subconjuntos está faltando atualmente. A caracterização funcional das propriedades fagocíticas dos CNS-MPs pode complementar as estratégias de perfil molecular, facilitar uma melhor fenotipagem funcional e auxiliar na avaliação da eficácia da terapêutica que pode corrigir a fagocitose defeituosa em modelos de doenças¹⁷.

Os ensaios tradicionais de fagocitose para MP-SNC incluem a incubação de micróglia primária junto com substratos fluorescentes, como Aβ ou partículas de látex/poliestireno. A fagocitose é então estudada em função da captação do substrato fluorescente por meio de microscopia de imunofluorescência 18,19,20. Está bem estabelecido que os CNS-MPs, quando mantidos em culturas longas, podem alterar drasticamente sua morfologia e perfis transcricionais^21,22. Isso dificulta o estudo das propriedades fagocíticas dos CNS-MPs em seu estado representativo no SNC. Um ensaio de citometria de fluxo funcional para traçar o perfil de CNS-MPs vivos agudamente isolados pode fornecer uma avaliação rápida das propriedades fagocíticas e pode amostrar um conjunto muito maior de CNS-MPs do que a microscopia^{se aproxima 9,23}. Além disso, a citometria de fluxo elimina a necessidade de manter os CNS-MPs em cultura, bem como fornece uma plataforma para estudar as propriedades fagocitóticas em diferentes subpopulações de CNS-MPs. Este manuscrito descreve protocolos otimizados para propriedades fagocíticas fenotípicas de CNS-MPs de camundongos agudamente isolados por citometria de fluxo. A adaptação de ensaios de fagocitose usando citometria de fluxo permite a rápida multiplexação do fenótipo fagocítico de CNS-MPs juntamente com fenotipagem imunológica, fornecendo assim informações sobre a heterogeneidade das propriedades fagocíticas dentro de CNS-MPs na resolução de célula única.

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Protocolo

Todos os estudos com camundongos foram conduzidos após a obtenção da aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Emory (IACUC) e em estrita conformidade com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Preparação no dia do isolamento

1. Prepare um balde de gelo para manter todos os reagentes, tampões e suspensões celulares frios durante todo o procedimento de isolamento.
2. Coloque o frasco de solução salina tamponada com fosfato 1× (PBS) (pelo menos 1 L) a 4 °C por 30 min a 1 h antes da perfusão e mantenha 1× PBS em gelo durante o procedimento de perfusão e isolamento.
3. Prepare a concentração de trabalho do meio de gradiente de densidade (referido como 35% SIP, consulte a Tabela de Materiais).
4. Rotular todos os tubos cônicos e de citometria de fluxo usados no experimento antes do isolamento celular para evitar atrasos nos tempos de processamento. Além disso, reúna todos os outros suprimentos necessários para o isolamento antes da perfusão, como filtros de células de 40 μm, seringas e agulhas.

2. Isolamento agudo da micróglia de camundongo adulto

1. Anestesiar um camundongo adulto colocando-o em uma câmara de indução de vidro com isoflurano (5 mL) até que o camundongo pare de respirar e não responda ao beliscão da pata posterior.
2. Use uma agulha de 26 G e uma seringa de 10 mL para realizar a perfusão cardíaca com 30 mL de PBS 1× gelada até que não haja sangue visual.
3. Decapite o rato com uma tesoura cirúrgica. Use uma tesoura pequena para cortar a pele, expondo o crânio. Remova o crânio sem danificar o tecido cerebral, conforme descrito²⁴. Remova o cérebro imediatamente e transfira para um filtro de células estéril de 40 μm colocado em cima de um tubo cônico de 50 mL.
4. Use a parte de trás do êmbolo de uma seringa de 3 mL para empurrar o cérebro através do filtro e dissociar mecanicamente todo o tecido cerebral. Lave o filtro de células e o êmbolo intermitentemente durante a dissociação com 2 mL de PBS 1× gelado de cada vez para garantir que todo o tecido passe pelo filtro.
5. Raspe o fundo do filtro de célula com o êmbolo para coletar qualquer suspensão residual no cônico. Lave bem o filtro de células com PBS 1× gelado e despeje a suspensão no tubo cônico de 50 mL.
   NOTA: Ao processar vários animais em série, coloque as suspensões celulares no gelo até o processamento posterior.
6. Adicione 1× PBS gelado para aumentar o volume da suspensão celular para 30 mL e centrifugue a 800 × g por 5 min a 4 ° C.
7. Despeje o sobrenadante sem perturbar o pellet e ressuspenda o pellet em 6 mL de SIP a 35% com uma pipeta sorológica de 10 mL. Transferir a suspensão celular + mistura SIP a 35% para um novo tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 800 × g durante 25 min a 15 °C sem travões.
   CUIDADO: Tome cuidado especial para evitar a introdução de bolhas durante a ressuspensão. Bolhas excessivas podem ser prejudiciais ao rendimento celular.
8. Remova cuidadosamente o tubo cônico de 15 mL da centrífuga sem perturbar as camadas e aspire a camada superior de mielina flutuante.
9. Transferir a suspensão celular + mistura SIP a 35% utilizando uma pipeta serológica de 10 ml para um novo tubo cónico de 50 ml contendo 30 ml de PBS 1× gelado e centrifugar a 800 × g durante 5 min a 4 °C. Despeje cuidadosamente o sobrenadante, deixando para trás o pellet celular junto com 500 a 800 μL de 1× PBS.
10. Ressuspenda o pellet celular pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta p1000 e transfira para um tubo inferior redondo de 5 mL. Adicione 2 mL de PBS 1× gelado ao tubo inferior redondo e centrifugue a 1.400 × g por 2 min a 4 °C. Despeje rapidamente o sobrenadante, deixando o pellet celular contendo CNS-MPs em cerca de 100 μL de 1× PBS (Figura 1).

3. Configuração da fagocitose e coloração por citometria de fluxo

1. Transfira 20 μL (≈200.000 células) dos CNS-MPs ressuspensos para um novo tubo inferior redondo de 5 mL e adicione 80 μL de PBS 1× gelado. Não adicione substratos fluorescentes ou anticorpos de citometria de fluxo a este tubo. Essas células servem como um controle negativo para determinar a fluorescência de fundo de CNS-MPs para análises de citometria de fluxo.
2. Para estabelecer a viabilidade dos CNS-MPs isolados, use corantes vivos/mortos à base de amina (por exemplo, Fixable Blue UV).
   1. Ressuspenda o resto do pellet celular em 500 μL de PBS 1× e adicione 1 μL do corante reconstituído a cada tubo de amostra, exceto o controle negativo.
   2. Suavemente vórtice, cubra os tubos com papel alumínio e incube-os em temperatura ambiente por 30 min. Em seguida, adicione 1 mL de 1× PBS a cada tubo e vore suavemente.
   3. Centrifugar as células a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C. Despeje rapidamente o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 μL de PBS 1×.
      NOTA: Os corantes à base de amina se ligam às fibrilas Aβ extracelulares, confundindo os resultados da fagocitose. Outros indicadores vivos/mortos podem interferir na fluorescência das fibrilas/microesferas Aβ. Portanto, é aconselhável usar o indicador Vivo/Morto apenas em experimentos preliminares para estabelecer a viabilidade dos CNS-MPs isolados.
3. Vortex completamente o tubo contendo microesferas de poliestireno PE e adicione 2 μL (≈200 microesferas/célula) a 100 μL de suspensão celular em tubos de fluxo, exceto para o controle negativo. Agite suavemente cada tubo para garantir uma distribuição igual do substrato com as células e coloque os tubos de fundo redondo em uma incubadora umidificada estéril por 30 min a 37 ° C com 5% de CO₂.
   1. Agitar suavemente e incubar o tubo de controlo negativo para assegurar condições experimentais semelhantes entre amostras positivas e negativas.
      NOTA: Se estiver usando fibrilas Aβ em vez de microesferas de PE, prepare fibrilas fluorescentes HiLyte488 Aβ conforme descrito anteriormente⁹. A concentração final de fibrilas Aβ é de 200 μM, que é então diluída para preparar um estoque fresco de 20 μM em PBS de monômeros Aβ fluorescentes. Adicione 12,5 μL dos monômeros Aβ estoque de 20 μM a cada tubo contendo células isoladas.
4. Remova as células da incubadora e adicione 1 mL de 1× PBS a cada tubo e faça um vórtice suavemente. Centrifugue as células a 1.400 × g por 2 min a 4 ° C e despeje rapidamente o sobrenadante. Repita a lavagem com 1 mL 1× PBS, centrifugue a 1.400 × g por 2 min, despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em 100 μL de 1× PBS.
   NOTA: Após cada rodada, é importante manter as células no gelo para inibir a captação fagocítica contínua.
5. Vortex os anticorpos de citometria de fluxo e centrifugá-los em uma microcentrífuga por 10 s. Para cada tubo de suspensão celular, adicione 1 μL de CD11b-APC / Cy7 e CD45-PE / Cy7 para ensaio de fagocitose Aβ, ou CD45-FITC para fagocitose de microesferas de PE. Agite suavemente cada tubo e incube no escuro por 30 minutos em temperatura ambiente.
   NOTA: Os usuários também podem incluir um tubo separado contendo células fagocíticas potentes, como micróglia BV2 cultivada ou macrófagos peritoneais como controle positivo e tratá-los com microesferas de PE e anticorpos citométricos de fluxo conforme descrito acima. Os dados desta amostra podem ser usados para definir o controle positivo denotando fagocitose verdadeira em experimentos preliminares.
6. Enquanto as células estão em incubação, configure os tubos de compensação usando quatro tubos de fluxo redondos de 5 mL de fundo. Vortex completamente os grânulos de compensação e adicione 1 gota a cada tubo. Adicione 1 μL de CD11b-APC/Cy7 ao primeiro tubo e CD45-FITC ao segundo tubo. Adicione 1 μL de PE-poliestireno ao terceiro tubo e mantenha os grânulos de compensação não corados no quarto tubo. Use este quarto tubo como um controle negativo para configurar um painel de compensação no citômetro de fluxo.
   NOTA: Quando as fibrilas Aβ são usadas para estudar a fagocitose, adicione CD45-PECy7 ao segundo tubo em vez de CD45-FITC. Adicione 1 μL de anticorpo de citometria de fluxo marcado com FITC separado ou anticorpo secundário FITC (qualquer espécie) ao terceiro tubo de compensação. Isso é importante, pois os grânulos não podem se ligar às fibrilas Aβ e serão lavados após a lavagem dos tubos de compensação.
7. Deixe os grânulos de compensação incubarem com seus respectivos anticorpos por pelo menos 10 min. Após a incubação, adicione 1 mL de PBS 1× a cada tubo, centrifugue a 1.400 x g por 2 min a 4 ° C e despeje rapidamente o sobrenadante. Coloque os tubos de compensação no gelo e cubra-os com o papel alumínio até a citometria de fluxo.
8. Após a incubação com anticorpos de citometria de fluxo, lave as células coradas com 1 mL de PBS 1×. Agitar suavemente as células a 1.400 × g durante 2 min a 4 °C. Despeje rapidamente o sobrenadante e repita a lavagem com 1 mL 1× PBS. Após centrifugação, despeje o sobrenadante e ressuspenda o sedimento celular em 100 μL de PBS 1×.
9. Coloque os tubos de amostra no gelo e cubra-os com papel alumínio até a citometria de fluxo.
   NOTA: Use 1× PBS (pH 7,0) sem Ca²⁺/Mg²⁺ como tampão de fluxo durante todo o experimento. Certifique-se de excluir o soro fetal bovino (FBS) no tampão de fluxo para evitar uma possível ativação microglial.

4. Citometria de fluxo e análise

1. Configuração e compensação do instrumento
   NOTA: Os experimentos deste manuscrito foram realizados em um citômetro de fluxo com lasers ultravioleta, violeta, azul, amarelo-verde e vermelho. Este experimento também pode ser adaptado para citômetros de fluxo de três lasers apenas com lasers azuis, amarelo-verdes e vermelhos. Os usuários precisam passar por treinamento formal antes de manusear o instrumento.
   1. Reabasteça o tanque tampão da bainha de fluxo e ligue o citômetro. "Preparar" o citômetro com um tubo de fluxo de fundo redondo de 5 mL contendo ddH₂O. Faça login no software de análise no computador conectado ao citômetro de fluxo. Crie um "experimento" e selecione FSC, SSC, FITC, PECy7 e APC-Cy7 como parâmetros. Se estiver usando microesferas PE, selecione PE em vez de PECy7 no painel de parâmetros.
   2. Crie um painel de compensação apropriado.
      NOTA: Em nossos experimentos, normalmente as tensões FSC/SSC para contas de compensação são de cerca de 350/280, enquanto as tensões FSC/SSC para CNS-MPs são de cerca de 320/260. Esses valores podem variar entre dois citômetros diferentes e precisam ser calibrados antes do experimento real.
   3. Reconstitua cada tubo de compensação e suspensão celular com 500 μL de PBS 1×, faça um vórtice breve e coloque no gelo. Execute o tubo de controle negativo/corado para definir as tensões apropriadas de modo que o pico em cada histograma de fluoróforo esteja abaixo de 10². Execute os outros tubos de compensação de cor única para identificar seus picos positivos distintos.
      NOTA: Deve haver pelo menos meio log (base 10) de diferença entre os picos positivo e negativo de cada fluoróforo.
   4. Registre 5000 eventos de cada tubo de compensação para permitir que o computador calcule automaticamente a configuração de compensação. Vincule a configuração de compensação ao experimento atual²⁵.
   5. Crie um novo "tubo" na guia de amostra. Suavemente vórtice e execute o tubo de controle negativo contendo CNS-MPs não corados. Ajuste as tensões de dispersão direta e lateral para capturar a população de interesse. Registre os eventos e o sub-gate nos CNS-MPs ao vivo, conforme mencionado abaixo.
   6. Capture e registre eventos de todos os tubos subsequentes como arquivos separados, mantendo os parâmetros e tensões consistentes. Agitar suavemente cada tubo antes de os colocar no citómetro de fluxo.
2. Estratégia de gating e medição da fagocitose
   1. Desenhe uma porta mononuclear inicial para capturar todos os CNS-MPs. Essas células mononucleares vivas devem ser fechadas no gráfico a seguir para incluir apenas células individuais, excluindo dísticos e trigêmeos.
   2. Projete a população de CNS-MPs CNS-vivos e fechados em um gráfico subsequente exibindo fluoróforos CD11b e CD45.
      NOTA: As micróglias residentes no cérebro são tipicamente^{intermediárias} CD11b ⁺ CD45, enquanto os macrófagos infiltrantes são CD11b ⁺ CD45^altos. Marcadores adicionais, como Ly6c, podem ser incluídos no painel para separar ainda mais com confiança os monócitos inflamatórios (Ly6c^alto e CD45^alto) da microglia (Ly6c^baixo CD45^{intermediário}).
   3. Aplique os portões apropriados para estudar mais a fagocitose nas respectivas populações, conforme mostrado na Figura 2F.
      NOTA: A fagocitose em CNS-MPs é medida em função de sua captação de fluorescência Hilyte488 / Alexa488 (Aβ) ou PE (microesfera). Pico positivo distinto em seus respectivos histogramas indica que os CNS-MPs fagocitaram o substrato. A quantidade de material fagocitado é diretamente proporcional à intensidade da fluorescência. Portanto, a presença de múltiplos picos deve ser interpretada como maior fagocitose. Estes podem ser posteriormente confirmados por imuno-histoquímica.
   4. Depois de registrar todos os tubos de amostra no citômetro de fluxo, exporte os arquivos de dados no formato .fcs para análise posterior.
3. Análise estatística dos dados
   1. Use qualquer software de análise de citometria de fluxo junto com planilhas e software de análise estatística para todas as análises de dados.
   2. Adicione os arquivos .fcs ao software de análise e clique duas vezes no primeiro arquivo. Um gráfico exibindo todos os registros
      eventos aparecerão. Siga uma estratégia de bloqueio semelhante, conforme mostrado na Figura 2, para posteriormente bloquear células mononucleares vivas únicas e estudar a fagocitose em uma população específica, por exemplo, células microgliais^{intermediárias} CD11b ⁺ CD45 (Figura 2H).
      NOTA: O índice fagocítico é avaliado com base na proporção de células que internalizam fibrilas Aβ fluorescentes ou ≥1 microesfera(s). Conforme definido anteriormente, a fagocitose de baixo nível é a captação de pelo menos 1 microesfera e a fagocitose de alto nível é >1 captação de grânulos ^8,9. Com base em experimentos anteriores, a inibição dos processos dependentes de actina pela citocalasina D inibe completamente a captação de >1 grânulo e inibe parcialmente a captação de 1 grânulo⁹, bem como inibe completamente a captação de Aβ, confirmando a captação fagocítica dependente de actina em vez de ligação passiva à superfície celular. A imunocitoquímica também confirma que cada pico sequencial no ensaio de microesferas é representativo de um aumento unitário no número de grânulos fagocitados ^8,9.

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Resultados

Para exemplificar os resultados típicos da captação fagocítica de microesferas e fibrilas Aβ42 por CNS-MPs agudamente isolados, CNS-MPs agudamente isolados foram obtidos do hemisfério ipsilateral após oclusão arterial cerebral média transitória (MCAO)⁸. Para obter detalhes sobre as propriedades fagocíticas dos CNS-MPs no modelo MCAO, consulte publicações anteriores⁸. Resumidamente, após uma recuperação de 72 horas, os CNS-MP...

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Discussão

A citometria de fluxo é uma técnica que pode detectar a expressão de proteínas ou marcadores de interesse na superfície celular ou em compartimentos intracelulares usando sondas marcadas com fluorescência (normalmente anticorpos) para rotular esses marcadores de interesse. Os anticorpos de superfície celular ou intracelulares são tipicamente conjugados com fluorocromos excitáveis a laser que possuem espectros de emissão únicos. As células incubadas com esses anticorpos podem ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10x Hank's balanced salt solution(10x HBSS)	ThermoFisher	14065056	Store at 4 °C. Used to make SIP as described in the protocol
1x Hank's balanced salt solution(1x HBSS)	ThermoFisher	14175095	Store at 4 °C. Used to make 35% SIP as described in the protocol
1x Phosphate Buffered Saline (PBS)			https://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/western-blotting/buffers-recipes/10x-phosphate-buffered-saline.html Store 10xPBS at Room temperature. Prepare fresh 1xPBS by diluting one part 10xPBS to nine parts of MilliQ dH20 and store it at 4 °C for an hour before use. Make sure the pH of the 1xPBS is 7.0 before refridgeration.
35% SIP			To make 20 mL of 35% SIP, use 7 mL of SIP and 13 mL of ice-cold 1× HBSS. Keep on ice until further processing
APC-Cy7 rat anti-CD11b	BD Pharmingen	557657	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
FITC rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	553080	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	ThermoFisher	L34961	Store at -20 °C. Add 50ul of DMSO to one tube of the dye, vortex throughly and centrifuge at maximun speed for 1 min. Make 10µL aliquots and store them at -20 °C. Use a fresh aliquot for each experiment and add to the samples at 1:500 dilution.
OneComp eBeads compensation beads	ThermoFisher	01-1111-42	Store at 4 °C, throughly vortex the tube before adding to the sample tube(s), keep on ice when in use.
PE-Cy7 rat anti mouse CD145	BD Pharmingen	552848	Store at 4 °C or keep on ice when in use. Sheild from light. Flow cytometry dilution - 1:100
Percoll pH8.5-9.5	Sigma	P1644	Store at 4 °C. To make 10 mL of Standard Isotonic Percoll (SIP): Use 9 mL of cold Percoll and 1 mL of cold 10× HBSS.
Phycoerythrin-conjugated microspheres	ThermoFisher	F13083	Store at 4 °C or keep on ice when in use.
β-Amyloid (1 - 42), HiLyte Fluor 488 - labeled, Human	AnaSpec	AS-60479-01	The final concentration of Ab fibrils is 200µM which is then diluted prior to use. Store at -20 °C. Prepare fresh working solution for each experiment.