A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
* These authors contributed equally
تقدم هذه الورقة طريقة لإنشاء نموذج التهابي جلدي الصدفي في المختبر على مستوى النسخ باستخدام مزيج من خمسة سيتوكينات (IL-17A ، IL-22 ، IL-1α ، TNF-α ، OSM) على خط خلية HaCaT.
الصدفية هي مرض جلدي التهابي مزمن شائع بوساطة أجهزة مناعية فطرية وتكيفية ، وتتميز بالتكاثر والتمايز غير الطبيعي للخلايا الكيراتينية للبشرة وتسلل الخلايا الالتهابية. الخلايا الكيراتينية الخاصة بالجلد هي مشاركون رئيسيون في المناعة الفطرية ، وتستجيب للخلايا المناعية والتحفيز البيئي ، وبالتالي تؤدي دورا مهما في التسبب المناعي للصدفية. هنا ، نقدم طريقة لتحفيز التهاب الخلايا الكيراتينية الصدفية على مستوى النسخ باستخدام خط خلايا HaCaT باستخدام خمسة تركيبات من السيتوكينات المسببة للالتهابات (تركيبة M5) ، بما في ذلك IL-17A و IL-22 و IL-1α و TNF-α و oncostatin M. أظهرت النتائج أن خلايا HaCaT المستحثة في تركيبة M5 أظهرت مستويات متزايدة من الببتيدات المضادة للميكروبات (BD2 و S100A7 و S100A8 و S100A9) والكيموكينات والسيتوكينات (CXCL1 و CXCL2 ، CXCL8 و CCL20 و IL-1β و IL-6 و IL-18). تم تنظيم مستويات mRNA لعلامات تمايز الخلايا الكيراتينية (Keratin1 و Keratin10 و Filaggrin و Loricrin) ، وهو ما كان متوافقا مع بيانات النسخ المشتقة من الخلايا الكيراتينية الشبيهة بالصدفية. لذلك ، فإن الطريقة الموضحة هنا تؤسس التهابا جلديا في المختبر الصدفي على مستوى النسخ وتساهم في البحث عن التسبب الجزيئي للصدفية.
الصدفية هي مرض جلدي التهابي مزمن شائع غير معدي ناتج عن استجابة مناعية غير منظمة ، وتؤثر على الخلايا الكيراتينية التي تشكل البشرةفي الغالب 1 ، وتتميز بالتكاثر السريع بشكل غير طبيعي للخلايا الكيراتينية مع فرط التقرن والزبغاء. تصيب الصدفية حوالي 3٪ من سكان البرية في العالم2. يزداد عبء المرض بسبب العديد من الأمراض المصاحبة ، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية ومتلازمة التمثيل الغذائي التي تسببها المتلازمة3.
تتكون البشرة من خمس طبقات من الخلايا الكيراتينية وتخضع لتغيير مورفولوجي مع عملية التمايز: الطبقة القاعدية ، والطبقة الشوكية ، والطبقة الحبيبية ، والطبقة الشفافة (الموجودة على راحة اليد وباطن القدم) والطبقة القرنية الموصوفة هنا من السطح الداخلي إلىالسطح الخارجي 4. يؤدي التغيير في تمايز البشرة إلى اضطراب حاجز الجلد ، وهو أمر مهم للتسبب في الأمراض الالتهابية الجلدية5،6،7،8. تلعب الخلايا الكيراتينية دورا حيويا في الحفاظ على حاجز البشرة السليم لمنع فقدان الماء وضد المحفزات البيئية مثل التعرض للأشعة فوق البنفسجية والمواد المسببة للحساسية ومسببات الأمراض9. يظهر الأفراد الأصحاء توازنا بين تكاثر الخلايا القاعدية وتقشر الطبقة القرنية ، في حين أن الأمراض الجلدية المتعددة بما في ذلك الصدفية ، تتميز باختلالات في هذه الآلية المعقدة10.
بالإضافة إلى تكوين وظيفة الحاجز ، تعتبر الخلايا الكيراتينية أيضا مكونا مهما في جهاز المناعة في الجلد. في المسببات المناعية للصدفية ، يؤدي تنشيط الخلايا التائية المساعدة من النوع 1 المقيمة في الجلد (Th1) والخلايا التائية المساعدة من النوع 17 (Th17) إلى زيادة إنتاج IFN-γ و IL-17A ، على التوالي. تحفز هذه السيتوكينات زيادة تخليق الكيموكينات (CCL20 ، CXCL1 / 2/8/9/10/11) ، والببتيدات المضادة للميكروبات (BD2 ، LL37 ، S100A7 / 8/9/12) ، والعوامل الالتهابية الأخرى (TNF-α ، IL-6 ، IFN-β) في الخلايا الكيراتينية ، مما يؤدي إلى تجنيد المزيد من Th1 و Th17 والعدلات في الجلد ، مما يزيد من تضخيم محور IL-17 / IL2311. الحديث المتبادل بين الخلايا الكيراتينية والخلايا المناعية مسؤول عن تحريض الصدفية11 والحفاظ عليها.
تم وصف شبكات السيتوكين المعقدة في الصدفية ، وتم تسليط الضوء على الدور المركزي للسيتوكينات المؤيدة للالتهابات (مثل IL-23 و IL-22 و IL-17 و IL-1α و oncostatin M (OSM) و TNF-α) الناتجة عن تسلل الخلايا المناعية12،13. في الواقع ، أظهرت الدراسات السابقة أن المستويات المتزايدة من IL-17A و IL-22 و IL-1α و TNF-α و OSM أدت إلى ظهور ملف تعريف الصدفية على الخلايا الكيراتينية للبشرة البشرية الطبيعية فيالمختبر 14.
تم استخدام خطوط خلايا الخلايا الكيراتينية الخالدة (HaCaT) التي يمكن الحصول عليها وزراعتها بسهولة أكبر من الخلايا الكيراتينية الأولية ذات قابلية التكاثر الأفضل ، على نطاق واسع لدراسة الصدفية15،16،17،18،19،20. يختلف عن فيروس الورم الحليمي البشري 16 E6 / E7 الذي تم تحويله إلى خلايا HEK001 و KerTr ، فإن خط خلايا HaCaT قادر على التعبير عن منتجات جينات التمايز ، بما في ذلك الكيراتين 1 (KRT1) ، والكيراتين 10 (KRT10) ، واللوريكرين ، والفيلاججرين20،21،22 ، وبالتالي توفير أداة واعدة مشابهة للخلايا الكيراتينية الأولية لدراسة تنظيم التقرن والالتهابات.
KRT5 / 14 هو زوج الكيراتين الرئيسي من النوع الأول من النوع الثاني المعبر عنه في الخلايا الكيراتينية القاعدية التكاثرية ، في حين أن الخلايا الكيراتينية المتمايزة في الطبقات فوق القاعدية تقلل من تنظيم KRT5 / 14 وتعبر عن KRT1 / 10 باعتباره زوج الكيراتين الرئيسي23. عند مقارنة آفة الصدفية بالجلد السليم ، تضمنت التغيرات في تعبير الكيراتين انخفاضا في KRT1 / 1024،25 وزيادات في KRT5 / 14 في البشرة الصدفية26 ، التي تتميز بفرط التكاثر وداء التقرن27. Loricrin هو بروتين هيكلي متمايز بشكل نهائي يضم أكثر من 70٪ من الغلاف المتقرن ، ويساهم في وظيفة الحاجز الواقي للطبقة القرنية28 ، ويتم تنظيمه في جلد مرضى الصدفية29. يتم التعبير عن Filaggrin في المراحل الأخيرة من تمايز الخلايا الكيراتينية ويشارك في تجميع غلاف مقرن يشبه السقالة30 ، وانخفاض التعبير في جلد آفة الصدفية29.
بشكل عام ، كان هدفنا هو إنشاء نموذج الخلايا الكيراتينية الالتهابية في خلايا HaCaT باستخدام تركيبة السيتوكين التي ستكون قادرة على تلخيص بعض خصائص آفات الصدفية الجلدية بشكل تآزري ، بما في ذلك بدء الاستجابة المناعية وتكاثر الخلايا الكيراتينية والتمايز.
قم بتنفيذ الخطوات من 1 إلى 3 في حالة معقمة. احتوت جميع وسط الاستزراع على 0.1 مجم / مل من البنسلين والستربتومايسين.
1. تحضير الخلية
2. بذر الخلايا في لوحة 6 آبار
3. تحفيز M5 لخلايا HaCaT
4. حصاد mRNA من خلايا HaCaT المحفزة M5
5. تحليل تعبير الرنا المرسال بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
6. حصاد طافي ثقافة الخلايا ل ELISA
7. تحليل تعبير السيتوكينات بواسطة ELISA
تحفيز M5 المركب المستحث على الاستجابة الالتهابية لخلايا HaCaT.
تم تحفيز خلايا HaCaT مع أو بدون تركيبة السيتوكينات M5 لمدة 24 ساعة. تم تقييم تعبير mRNA للجينات المرتبطة بالصدفية ، والتي تشارك في تنظيم الكيموكينات المناعية والالتهابية والببتيدات المضا?...
الموصوفة هنا هي طريقة تستخدم مجموعة خمسة سيتوكينات (IL-17A ، IL-22 ، IL-1α ، TNF-α ، OSM) في خط خلايا HaCaT لإنشاء ملف تعريف التهاب جلدي الصدفي في المختبر على مستوى النسخ. يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة آلية الجينات في التسبب في الصدفية وكذلك فحص الأدوية العلاجية للصدفية. أظهرت التقا...
ولم يبلغ أصحاب البلاغ عن أي تضارب محتمل في المصالح.
تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين [81703132 و 31271483 و 81472650 و 81673061 و 81573050 و 31872739 و 81601462]
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965092 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100139C | |
HaCaT cells | China Center for Type CultureCollection | GDC0106 | Less than 15 generations |
Human IL-1β ELISA Kit | Beyotime | PI305 | |
Human IL-6 ELISA Kit | Beyotime | PI330 | |
Human IL-8 ELISA Kit | Beyotime | PI640 | |
IL-1 alpha Human | Prospec | CYT-253 | Recombinant protein |
IL-17 Human | Prospec | CYT-250 | Recombinant protein |
IL-22 Human | Prospec | CYT-328 | Recombinant protein |
OSM Human | Prospec | CYT-231 | Recombinant protein |
PBS | Gibco | 10010049 | pH 7.4 |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140163 | |
PrimeScrip RT reagent Kit | TAKARA | RR047A | |
TB Green Premix Ex Taq | TAKARA | RR420A | |
TNF alpha Human | Prospec | CYT-223 | Recombinant protein |
TRIzo Reagent | Invitrogen | 15596018 | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved