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  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
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Résumé

Cet article présente une méthode d’établissement d’un modèle inflammatoire cutané psoriasiforme in vitro au niveau de la transcription en utilisant une combinaison de cinq cytokines (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) sur la lignée cellulaire HaCaT.

Résumé

Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique courante de la peau médiée par les systèmes immunitaires innés et adaptatifs, caractérisée par une prolifération et une différenciation anormales des kératinocytes épidermiques et une infiltration de cellules inflammatoires. Les kératinocytes spécifiques de la peau sont des participants clés de l’immunité innée, répondant aux cellules immunitaires et à la stimulation environnementale, jouant ainsi un rôle important dans l’immunopathogenèse du psoriasis. Ici, nous présentons une méthode pour induire l’inflammation des kératinocytes psoriasiformes au niveau de la transcription avec la lignée cellulaire HaCaT en utilisant cinq combinaisons de cytokines pro-inflammatoires (combinaison M5), y compris IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α et oncostatine M. Les résultats démontrent que les cellules HaCaT induites par la combinaison M5 ont montré des niveaux accrus de peptides antimicrobiens (BD2, S100A7, S100A8 et S100A9), de chimiokines et de cytokines (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 et IL-18). Les niveaux d’ARNm des marqueurs de différenciation des kératinocytes (kératine1, kératine10, filaggrine et lorithrine) étaient régulés à la baisse, ce qui était cohérent avec les données du transcriptome dérivées des kératinocytes de type psoriasis. La méthode décrite ici établit donc une inflammation cutanée psoriasiforme in vitro au niveau de la transcription et contribue à la recherche de la pathogenèse moléculaire du psoriasis.

Introduction

Le psoriasis est une maladie inflammatoire chronique non contagieuse courante de la peau déclenchée par une réponse immunitaire dérégulée, affectant les kératinocytes qui forment principalement l’épiderme1, caractérisée par une multiplication anormalement rapide des kératinocytes avec hyperkératose et parakératose. Le psoriasis touche environ 3 % de la population sauvage mondiale2. Le fardeau de la maladie est encore aggravé par plusieurs comorbidités, notamment les maladies cardiovasculaires et le syndrome métabolique causé par le syndrome3.

L’épiderme est composé de cinq couches de kératinocytes et subit des changements morphologiques avec le processus de différenciation : la couche basale, la couche épineuse, la couche granuleuse, la couche claire (trouvée sur les paumes et la plante des pieds) et la couche cornée décrite ici de la surface interne à la surface externe4. La modification de la différenciation de l’épiderme entraîne une perturbation de la barrière cutanée, ce qui est important pour la pathogenèse des maladies inflammatoires de la peau 5,6,7,8. Les kératinocytes jouent un rôle essentiel dans le maintien d’une barrière épidermique intacte pour prévenir la perte d’eau et contre les déclencheurs environnementaux tels que l’exposition aux UVB, les allergènes et les agents pathogènes9. Les individus sains présentent un équilibre entre la prolifération des cellules basales et la desquamation de la couche cornée, tandis que de multiples maladies de la peau, dont le psoriasis, sont caractérisées par un déséquilibre de ce mécanisme complexe10.

En plus de former une fonction barrière, les kératinocytes sont également un composant essentiel du système immunitaire de la peau. Dans les immunopathogènes du psoriasis, l’activation des lymphocytes T auxiliaires de type 1 (Th1) et des lymphocytes T auxiliaires de type 17 (Th17) résidant dans la peau entraîne une augmentation de la production d’IFN-γ et d’IL-17A, respectivement. Ces cytokines induisent une synthèse accrue de chimiokines (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), de peptides antimicrobiens (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) et d’autres facteurs inflammatoires (TNF-α, IL-6, IFN-β) dans les kératinocytes, conduisant au recrutement de plus de Th1, Th17 et de neutrophiles dans la peau, amplifiant encore l’axe IL-17/IL2311. La diaphonie entre les kératinocytes et les cellules immunitaires est responsable de l’induction et du maintien du psoriasis11.

Des réseaux complexes de cytokines ont été décrits dans le psoriasis, et le rôle central des cytokines pro-inflammatoires (telles que l’IL-23, l’IL-22, l’IL-17, l’IL-1α, l’oncostatine M (OSM) et le TNF-α) produites par l’infiltration des cellules immunitaires a été mis en évidence12,13. En effet, des études antérieures ont montré que des niveaux accrus d’IL-17A, d’IL-22, d’IL-1α, de TNF-α et d’OSM induisaient un profil psoriasiforme sur les kératinocytes épidermiques humains normaux in vitro14.

Les lignées cellulaires de kératinocytes immortels (HaCaT) qui sont plus faciles à obtenir et à cultiver que les kératinocytes primaires avec une meilleure reproductibilité, ont été largement utilisées pour l’étude du psoriasis 15,16,17,18,19,20. Contrairement aux cellules HEK001 et KerTr transformées par le virus du papillome humain16 E6/E7, la lignée cellulaire HaCaT est capable d’exprimer des produits géniques de différenciation, notamment la kératine1 (KRT1), la kératine10 (KRT10), la loricidrine et la filaggrine 20,21,22, fournissant ainsi un outil prometteur similaire aux kératinocytes primaires pour étudier la régulation de la kératinisation et de la pro-inflammatoire.

KRT5/14 est la principale paire de kératine de type I et de type II exprimée dans les kératinocytes basaux prolifératifs, tandis que les kératinocytes différenciés dans les couches suprabasales régulent à la baisse KRT5/14 et expriment KRT1/10 comme la paire de kératine majeure23. En comparant une lésion de psoriasis avec une peau saine, les modifications de l’expression de la kératine comprenaient des diminutions de KRT1/1024,25 et des augmentations de KRT5/14 dans l’épiderme psoriasique26, caractérisée par une hyperprolifération et une parakératose27. La loricrine est une protéine structurelle différenciante terminale comprenant plus de 70 % de l’enveloppe cornifiée, contribue à la fonction de barrière protectrice de la couche cornée28, régulée vers le bas dans la peau des patients atteints de psoriasis29. La filaggrine est exprimée aux stades finaux de la différenciation des kératinocytes et est impliquée dans l’agrégation d’une enveloppe cornifiée en forme d’échafaudage30, expression diminuée dans la peau des lésions du psoriasis29.

Dans l’ensemble, notre objectif était de générer un modèle de kératinocytes inflammatoires dans les cellules HaCaT en utilisant une combinaison de cytokines qui sera capable de récapituler de manière synergique certaines caractéristiques des lésions cutanées du psoriasis, notamment l’initiation d’une réponse immunitaire, la prolifération et la différenciation des kératinocytes.

Protocole

Effectuez les étapes 1 à 3 dans des conditions stériles. Tout le milieu de culture contenait 0,1 mg/mL de pénicilline et de streptomycine.

1. Préparation cellulaire

  1. Semez 1 x 10cellules 6 HaCaT dans 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) dans une boîte de culture cellulaire de 100 mm. Incuber la coupelle de culture à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 2 jours.
  2. Lorsque la culture atteint environ 80 % de confluence, retirez soigneusement le milieu de la boîte de culture et lavez les cellules avec 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Secouez doucement le plat de culture manuellement.
  3. Retirer le PBS et ajouter 2 ml de solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans les cellules. Secouez doucement la boîte de culture pour laisser la solution recouvrir complètement la monocouche de cellules.
  4. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant 5 min jusqu’à ce que les cellules soient visiblement détachées de la surface de la boîte de culture sous microscopie à contraste de phase.
    REMARQUE : La morphologie des cellules doit apparaître ronde. Si les cellules ne sont pas bien détachées, incuber pendant une période supplémentaire de 5 minutes avec une agitation manuelle.
  5. Une fois les cellules détachées, ajoutez 5 ml de DMEM plus 10 % de FBS pour inactiver la trypsine et recueillez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 50 ml à l’aide d’une pipette.
  6. Centrifuger le tube contenant la suspension cellulaire à 180 x g pendant 5 min. Décanter le surnageant.
  7. Ajoutez 10 ml de DMEM plus 10 % de milieu FBS à la pastille et pipetez doucement le milieu de haut en bas pour mettre les cellules en suspension.

2. Ensemencement cellulaire dans la plaque à 6 puits

  1. Ensemencez les cellules à une densité de 2,0 x 105 cellules/puits dans une plaque de culture à 6 puits.
  2. Incuber la plaque de culture à 6 puits à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2 pendant la nuit avant la stimulation combinée M5 pour permettre aux cellules d’adhérer à la plaque.

3. Stimulation M5 des cellules HaCaT

  1. Préparez un milieu de mélange de cytokines M5 contenant 10 ng/mL d’IL-17A, d’IL-22, d’IL-1α, de TNF-α recombinante et de protéine M d’oncostatine contenant 2 % de FBS.
    REMARQUE : La combinaison M5 consistait en une recombinaison d’IL-17A, d’IL-22, d’IL-1α, de TNF-α et d’oncostatine M. L’action synergique de la combinaison M5 récapitule certaines caractéristiques du psoriasis, comme la régulation positive des chimiokines et la production de peptides antimicrobiens31.
  2. Après une nuit de culture cellulaire, retirer le surnageant et pipeter 2 ml de milieu de mélange combiné M5 dans chaque puits.
  3. Poursuivre la culture des cellules ; des lysats cellulaires ont été prélevés à 24 h pour la quantification de l’ARNm (étape 4) ou des surnageants de culture ont été prélevés à 48-72 h pour la détermination des niveaux de cytokines par test ELISA32, 33, 34, 35, 36, 37 (étape 6).

4. Récolter l’ARNm des cellules HaCaT stimulées par M5

  1. Aspirez le milieu de mélange combiné M5 et lavez-le une fois avec 1 à 2 ml de PBS froid.
  2. Aspirez le PBS et ajoutez 1 ml de solution d’isothiocyanate de guanidium disponible dans le commerce directement dans la boîte de culture pour lyser les cellules.
  3. Pipetez le lysat de haut en bas plusieurs fois pour homogénéiser et transférez le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Laisser à température ambiante pendant 5 min.
  4. Ajouter 200 μL de chloroforme, agiter vigoureusement le tube pendant environ 20 s et incuber l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.
  5. Centrifugeuse à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
  6. Transférez la phase aqueuse dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 ml.
  7. Ajouter 500 μL d’isopropanol à la phase aqueuse et mélanger délicatement. Laisser à température ambiante pendant 5 min.
  8. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
  9. Aspirez l’isopropanol et ajoutez 1 mL d’éthanol à 75 %. Lavez le granulé une fois.
  10. Centrifugeuse à 7 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Videz l’éthanol et laissez les granulés sécher à l’air.
  11. Ajouter 30 μL d’eau traitée au DEPC à la pastille d’ARN. Préparez-vous à la détection RT-PCR.

5. Analyse de l’expression de l’ARNm par PCR en temps réel

  1. Effectuer la synthèse de l’ADNc avec 1 μg d’ARN total à l’aide d’un kit disponible dans le commerce en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE : 1 μg d’ARN total pour le test SYBR Green RT-PCR.
  2. Préparez le mélange réactionnel PCR. 12,5 μL de prémélange SYBR EX TAQ II, 1 μL d’amorce directe PCR (10 μM), 1 μL d’amorce inverse PCR (10 μM), 2 μg d’ADNc et 8,5 μL de dH2O. Le volume final est de 25 μL par réaction.
    REMARQUE : Le tableau 1 présente la liste des séquences d’amorces des gènes utilisés pour l’analyse RT-PCR dans cette étude.
  3. Incuber dans le thermocycleur. Les conditions de cycle comprenaient une étape de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, 40 cycles de 95 °C pendant 5 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 20 s et une analyse de la courbe de fusion.
  4. Analysez les données de l’expérience RT-PCR en calculant les différences relatives d’expression génique à partir des valeurs Ct (cycle seuil) à l’aide d’équations 2-ΔΔCT. Utiliser la β-actine comme contrôle interne pour la standardisation quantitative de l’expression génique relative par RT-PCR.

6. Récolte du surnageant de culture cellulaire pour ELISA

  1. Pipeter chaque milieu de culture cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
  2. Centrifugeuse à 1500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  3. Aliquote le surnageant et stockez-le immédiatement à -80 °C.

7. Analyse de l’expression des cytokines par ELISA

  1. Suivez les instructions du fabricant pour préparer tous les réactifs, l’étalon de travail et les échantillons. Une dilution en série triple de l’étalon avec un diluant d’échantillon allant de 2 000 à 2,74 pg/mL. Diluer les échantillons 1:2 avec le diluant de l’échantillon.
  2. Ajouter 100 μL d’étalon et échantillonner par puits. Couvrez les puits avec un couvercle et scellez la plaque avec un film de paraffine. Incuber pendant 2,5 h à température ambiante.
  3. Après 2,5 h, jetez la solution. Ajouter 300 μL de tampon de lavage dans chaque puits de la plaque pendant 3 min et aspirer. Répétez le processus quatre fois de plus. Après le dernier lavage, retournez l’assiette et tapotez sur du papier absorbant pour enlever le liquide restant.
  4. Ajouter 100 μL de la solution d’anticorps de détection dans chaque puits. Incuber la plaque sur un shaker pendant 2 h à 37 °C.
    REMARQUE : Une solution d’anticorps de détection biotinylés est préparée dans chaque kit ELISA.
  5. Aspirez et lavez chaque puits de la plaque cinq fois à l’aide de 300 μL de tampon de lavage. Après le dernier lavage, retournez la plaque et tapotez sur du papier absorbant pour retirer le liquide restant.
  6. Ajouter 100 μL de conjugué HRP-streptavidine dans chaque puits. Incuber pendant 45 min à température ambiante en secouant doucement.
  7. Jetez la solution en aspirant avec une pipette après l’incubation. Lavez chaque puits de la plaque cinq fois à l’aide de 300 μL de tampon de lavage. Après le dernier lavage, retournez la plaque et tapotez sur le papier absorbant pour retirer le liquide restant.
  8. Effectuez la détection en ajoutant 100 μL de substrat TMB dans chaque puits. Incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité.
  9. Ajouter 50 μL de solution d’arrêt, lorsque la couleur se développe, dans chaque puits. Tapotez doucement la plaque pour assurer un mélange complet. Lire immédiatement à 450 nm.

Résultats

La stimulation combinée M5 a induit une réponse inflammatoire des cellules HaCaT.
Les cellules HaCaT ont été stimulées avec ou sans combinaison de cytokines M5 pendant 24 h. L’expression de l’ARNm des gènes liés au psoriasis, qui sont impliqués dans la régulation des chimiokines immunitaires et inflammatoires et des peptides antimicrobiens, a été évaluée. Les chimiokines neutrophiles CXCL138<...

Discussion

La présente invention concerne une méthode utilisant une combinaison de cinq cytokines (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) dans une lignée cellulaire HaCaT pour établir un profil d’inflammation cutanée psoriasiforme in vitro au niveau de la transcription. Ce protocole peut être adapté pour l’étude du mécanisme des gènes dans la pathogenèse du psoriasis ainsi que pour le criblage de médicaments thérapeutiques pour le psoriasis. Des rapports récents ont montré que la su...

Déclarations de divulgation

Aucun conflit d’intérêts potentiel n’a été signalé par les auteurs.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 et 81601462]

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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