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요약

본 논문은 HaCaT 세포주에 5개의 사이토카인(IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM)을 조합하여 전사 수준에서 in vitro psoriasiform 피부 염증 모델을 확립하는 방법을 제시합니다.

초록

건선은 선천면역계와 후천면역계에 의해 매개되는 흔한 만성 염증성 피부 질환으로, 표피 각질세포의 비정상적인 증식 및 분화, 염증 세포의 침투를 특징으로 합니다. 피부 특이적 각질세포는 선천면역의 핵심 구성원으로, 면역세포와 환경 자극에 반응하여 건선의 면역 발병에 중요한 역할을 합니다. 본 연구에서는 IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, 온코스타틴 M을 포함한 5가지 전염증성 사이토카인 조합(M5 combination)을 사용하여 HaCaT 세포주를 이용하여 전사 수준에서 건선각각세포의 염증을 유도하는 방법을 제시합니다. M5 조합 유도 HaCaT 세포는 항균 펩타이드(BD2, S100A7, S100A8, S100A9), 케모카인, 사이토카인(CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 및 IL-18). 각질세포 분화 마커(Keratin1, Keratin10, Filaggrin, Loricrin)의 mRNA 수치는 하향 조절되었으며, 이는 건선과 유사한 각질세포에서 파생된 전사체 데이터와 일치했습니다. 따라서 여기에 설명된 방법은 전사 수준에서 체외 건선 형태의 피부 염증을 확립하고 건선의 분자 발병 기전에 대한 연구에 기여합니다.

서문

건선은 면역 반응 조절 장애에 의해 유발되는 흔한 비전염성 만성 염증성 피부 질환으로, 표피1을 주로 형성하는 각질세포에 영향을 미치며, 과각화증 및 부각화증을 동반한 각질세포의 비정상적으로 빠른 증식을 특징으로 합니다. 건선은 전 세계 야생 개체군의 약 3%에 영향을 미칩니다2. 질병 부담은 심혈관 질환 및 대사 증후군을 포함한 여러 동반 질환에 의해 더욱 증가합니다3.

표피는 5개의 각질세포로 구성되어 있으며 분화 과정에 따라 형태학적 변화를 겪는다: 기저층(stratum basal), 스피노섬층(spinosum층), 과립층(stratum granulosum), 루시덤층(floorm lucidum, 손바닥과 발바닥에서 발견) 및 각질층(stratum corneum)은 여기에서 내표면에서 외표면으로 설명된다4. 표피 분화의 변화는 피부 장벽을 교란시키는데, 이는 피부 염증성 질환의 발병에 중요한 역할을 한다 5,6,7,8. 각질세포는 수분 손실을 방지하고 UVB 노출, 알레르기 항원 및 병원체와 같은 환경적 유발 요인에 대항하기 위해 온전한 표피 장벽을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다9. 건강한 사람은 기저세포 증식과 각질층 박리 사이의 균형을 보이는 반면, 건선을 포함한 여러 피부 질환은 이러한 복잡한 메커니즘의 불균형을 특징으로 합니다10.

장벽 기능을 형성하는 것 외에도 각질 세포는 피부 면역 체계의 중요한 구성 요소이기도 합니다. 건선의 면역병리기전에서 피부에 상주하는 제1형 보조 T 세포(Th1)와 제17형 보조 T 세포(Th17)의 활성화는 각각 IFN-γ와 IL-17A의 생산을 증가시킨다. 이러한 사이토카인은 각질세포에서 케모카인(CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), 항균 펩타이드(BD2, LL37, S100A7/8/9/12) 및 기타 염증 인자(TNF-α, IL-6, IFN-β)의 합성을 증가시켜 더 많은 Th1, Th17 및 호중구를 피부로 동원하여 IL-17/IL23 축11을 더욱 증폭시킵니다. 각질세포와 면역세포 사이의 혼선은 건선의 유도 및 유지를 담당합니다11.

건선에서는 복잡한 사이토카인 네트워크가 설명되었으며, 면역세포 침투에 의해 생성되는 전염증성 사이토카인(예: IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, 온코스타틴 M(OSM) 및 TNF-α)의 중심 역할이 강조되었습니다12,13. 실제로, 이전 연구에서는 IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α 및 OSM의 수치가 증가하면 invitro 14에서 정상 인간 표피 각질세포에서 건선의 프로파일이 유도되는 것으로 나타났습니다.

1차 각질세포보다 더 쉽게 획득하고 배양할 수 있고 재현성이 우수한 불멸의 각질세포 세포주(HaCaT)는 건선 연구에 널리 사용되어 왔습니다 15,16,17,18,19,20. 인유두종바이러스16 E6/E7 형질전환된 HEK001 및 KerTr 세포와 달리 HaCaT 세포주는 Keratin1 (KRT1), Keratin10 (KRT10), Loricrin, filaggrin20,21,22 등의 분화 유전자 산물을 발현할 수 있으며, 이에 따라 각질화 및 전염증성 조절을 연구하기 위한 1차 각질세포와 유사한 유망한 도구를 제공합니다.

KRT5/14는 증식성 기저 각질세포에서 발현되는 주요 I형 II형 각질쌍인 반면, 상기저층의 분화된 각질세포는 KRT5/14를 하향 조절하고 KRT1/10을 주요 각질쌍으로 발현합니다23. 건선 병변과 건강한 피부를 비교한 결과, 각질 발현의 변화는 과증식(hyperproliferation)과 부각화증(parakeratosis)을 특징으로 하는 건선 표피(psoriatic epidermis)에서 KRT1/1024,25 및 KRT5/14 증가를 보였다26. 로리크린(Loricrin)은 각질외피의 70% 이상을 차지하는 말단 분화 구조 단백질로, 건선 환자의 피부에서 하향 조절되는 각질층(clipumcorneum) 28의 보호 장벽 기능에 기여한다29. 필라그린(Filaggrin)은 각질세포 분화의 마지막 단계에서 발현되며, 골격과 같은 각질화된 외피(30)의 응집에 관여하며, 건선 병변 피부(29)에서 발현이 감소한다.

전반적으로 우리의 목표는 면역 반응 시작, 각질 세포 증식 및 분화를 포함하여 건선 피부 병변의 일부 특성을 시너지 효과로 요약할 수 있는 사이토카인 조합을 사용하여 HaCaT 세포에서 염증성 각질 세포 모델을 생성하는 것이었습니다.

프로토콜

멸균 상태에서 1-3단계를 수행합니다. 모든 배양 배지에는 0.1mg/mL의 페니실린과 스트렙토마이신이 함유되어 있습니다.

1. 세포 준비

  1. 100mm 세포 배양 접시에 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 10mL에 1 x 106 HaCaT 세포를 파종합니다. 배양 접시를 37°C의 가습된 5% CO2 배양기에서 2일 동안 배양합니다.
  2. 배양액이 약 80% 농도에 도달하면 배양 접시에서 배지를 조심스럽게 제거하고 5mL의 1x 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다. 배양 접시를 수동으로 부드럽게 흔듭니다.
  3. PBS를 제거하고 0.25% 트립신-EDTA 용액 2mL를 세포에 첨가합니다. 용액이 세포의 단층을 완전히 코팅하도록 배양 접시를 부드럽게 흔듭니다.
  4. 37°C의 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 세포가 위상차 현미경 검사로 배양 접시 표면에서 눈에 띄게 분리될 때까지 5분 동안 세포를 배양합니다.
    참고: 세포의 형태는 둥글게 나타나야 합니다. 세포가 잘 분리되지 않으면 수동 교반과 함께 5분 동안 추가로 배양합니다.
  5. 세포가 분리되면 5mL의 DMEM과 10% FBS를 첨가하여 트립신을 비활성화하고 피펫을 사용하여 50mL 원심분리 튜브에서 세포 현탁액을 수집합니다.
  6. 세포 현탁액이 들어 있는 튜브를 180 x g 에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅합니다.
  7. 10mL의 DMEM과 10% FBS 배지를 펠릿에 추가하고 배지를 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 세포를 현탁액으로 만듭니다.

2. 6-well 플레이트에서 세포 파스팅

  1. 6-well 배양 플레이트에 2.0 x 105 cells/well의 밀도로 세포를 파종합니다.
  2. M5 조합 자극 전에 밤새 가습된 5% CO2 인큐베이터에서 37°C의 6-well 배양 플레이트를 배양하여 세포가 플레이트에 부착되도록 합니다.

3. HaCaT 세포의 M5 자극

  1. 2% FBS를 함유하는 DMEM에서 10ng/mL의 재조합 IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α 및 온코스타틴 M 단백질을 포함하는 M5 사이토카인 조합 혼합 배지를 준비합니다.
    참고: M5 조합은 IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α 및 온코스타틴 M의 재조합으로 구성되었으며, M5 조합의 시너지 작용은 케모카인 및 항균 펩타이드 생산의 상향 조절과 같은 건선의 일부 특징을 요약합니다31.
  2. 하룻밤 세포 배양 후 상층액을 제거하고 M5 조합 배지 2mL를 각 웰에 피펫팅합니다.
  3. 세포를 계속 배양하십시오. 세포 용해액은 mRNA 정량화(4단계)를 위해 24시간에 수집 하거나 배양 상등액을 ELISA 분석 32,33,34,35,36,37(6단계)에 의한 사이토카인 수준 측정을 위해 48-72시간에 수집했습니다.

4. M5 자극 HaCaT 세포의 mRNA 수확

  1. M5 조합 믹스 배지를 흡입하고 1-2mL의 차가운 PBS로 한 번 세척합니다.
  2. PBS를 흡인하고 시판되는 구아니듐 이소티오시아네이트 용액 1mL를 배양 접시에 직접 첨가하여 세포를 용해시킵니다.
  3. 용해물을 위아래로 여러 번 피펫팅하여 세포 용해물을 균질화하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
  4. 클로로포름 200μL를 추가하고 튜브를 약 20초 동안 세게 흔든 다음 실온에서 5분 동안 샘플을 배양합니다.
  5. 12,000 x g 에서 4°C에서 10분간 원심분리기.
  6. 수성상을 새로운 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  7. 수성상에 500μL의 이소프로판올을 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 실온에서 5분 동안 그대로 두십시오.
  8. 10,000 x g 에서 4°C에서 15분간 원심분리기.
  9. 이소프로판올을 흡입하고 75% 에탄올 1mL를 추가합니다. 펠릿을 한 번 씻으십시오.
  10. 7,500 x g 에서 4°C에서 5분간 원심분리기. 에탄올을 붓고 펠릿을 자연 건조시킵니다.
  11. RNA 펠릿에 30μL DEPC 처리수를 추가합니다. RT-PCR 검출을 준비합니다.

5. Real-Time PCR에 의한 mRNA 발현 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 시판되는 키트를 사용하여 1μg의 총 RNA로 cDNA 합성을 수행합니다.
    참고: SYBR Green RT-PCR 분석을 위한 총 RNA 1μg.
  2. PCR 반응 혼합물을 준비합니다. SYBR 프리믹스 EX Taq II 12.5μL, PCR 포워드 프라이머(10μM) 1μL, PCR 리버스 프라이머(10μM) 1μL, cDNA 2μg 2μg, dH2O8.5μL. 최종 부피는 반응당 25μL입니다.
    참고: 본 연구에서 RT-PCR 분석에 사용된 유전자의 프라이머 염기서열 목록은 표 1에 나와 있습니다.
  3. thermocycler에서 배양하십시오. 사이클링 조건에는 95°C에서 30초 동안 변성 단계, 95°C에서 5초 동안 40회, 30초 동안 60°C, 20초 동안 72°C에서 변성 단계 및 용융 곡선 분석이 포함되었습니다.
  4. 2-ΔΔCT방정식을 사용하여 Ct(threshold cycle) 값에서 유전자 발현의 상대적 차이를 계산하여 RT-PCR 실험 데이터를 분석합니다. β-actin을 RT-PCR relative quantitative gene expression standardization을 위한 내부 control로 사용합니다.

6. ELISA를 위한 수확 세포 배양 상등액

  1. 각 세포 배양 배지를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다.
  2. 1500 x g 에서 4°C에서 10분 동안 원심분리기.
  3. 상등액을 분취하고 즉시 -80 °C에서 보관하십시오.

7. ELISA에 의한 사이토카인 발현 분석

  1. 제조업체의 지침에 따라 모든 시약, 작업 표준 및 샘플을 준비하십시오. 2,000 - 2.74 pg/mL 범위의 샘플 희석액을 사용한 표준물질의 3배 연속 희석. 샘플 희석제로 샘플을 1:2로 희석합니다.
  2. 웰당 100μL의 표준물질 및 시료를 추가합니다. 뚜껑으로 우물을 덮고 파라핀 필름으로 플레이트를 밀봉합니다. 실온에서 2.5시간 동안 배양합니다.
  3. 2.5시간 후에 용액을 버리십시오. 플레이트의 각 웰에 300μL의 세척 버퍼를 3분 동안 추가하고 흡입합니다. 이 과정을 네 번 더 반복합니다. 마지막 세척 후 플레이트를 뒤집고 흡수지를 두드려 남아 있는 액체를 제거합니다.
  4. 각 웰에 검출 항체 용액 100μL를 추가합니다. 37°C에서 2시간 동안 셰이커에서 플레이트를 배양합니다.
    참고: 비오틴화 검출 항체 용액은 각 ELISA 키트에 준비되어 있습니다.
  5. 300μL의 세척 버퍼를 사용하여 플레이트의 각 웰을 5회 흡입하고 세척합니다. 마지막 세척 후 플레이트를 뒤집고 흡수지를 두드려 남아 있는 액체를 제거합니다.
  6. 각 웰에 100μL의 HRP-Streptavidin 접합체를 추가합니다. 실온에서 45분 동안 부드럽게 흔들어 배양합니다.
  7. 배양 후 피펫으로 흡인하여 용액을 폐기하십시오. 300μL의 세척 버퍼를 사용하여 플레이트의 각 웰을 5번 세척합니다. 마지막 세척 후 플레이트를 뒤집고 흡수지를 두드려 남아 있는 액체를 제거합니다.
  8. 각 웰에 100μL의 TMB 기질을 추가하여 검출을 수행합니다. 어둠 속에서 37 °C에서 30분 동안 배양합니다.
  9. 색이 발현되면 각 웰에 50μL의 정지 용액을 추가합니다. 철저한 혼합을 위해 접시를 부드럽게 두드립니다. 450nm에서 즉시 판독합니다.

결과

M5 조합 자극은 HaCaT 세포의 염증 반응을 유도했습니다.
HaCaT 세포를 24시간 동안 M5 사이토카인 조합 유무에 관계없이 자극했습니다.면역 및 염증성 케모카인 및 항균 펩티드의 조절에 관여하는 건선 관련 유전자의 mRNA 발현을 평가했습니다. 호중구 케모카인 CXCL138, CXCL239, CXCL8

토론

본 명세서에는 5개의 사이토카인 조합(IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM)을 HaCaT 세포주에 사용하여 전사 수준에서 체외 건선 피부 염증 프로파일을 확립하는 방법이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 건선 발병기전에서 유전자의 메커니즘에 대한 연구와 건선 치료 약물의 스크리닝에 적용할 수 있습니다. 최근 보고에 따르면 병변 피부에서 CD8 T 세포를 생산하는 IL-17A 및 IL22의 ?...

공개

저자는 잠재적인 이해 상충을 보고하지 않았습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China)[81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739, 81601462]의 지원을 받았다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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