JoVE Logo
Autoren
Kontakt

Anmelden

Zum Anzeigen dieser Inhalte ist ein JoVE-Abonnement erforderlich. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.

In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wird eine Methode zur Etablierung eines in vitro psoriasiformen kutanen Entzündungsmodells auf Transkriptionsebene unter Verwendung einer Kombination von fünf Zytokinen (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) auf HaCaT-Zelllinie vorgestellt.

Zusammenfassung

Psoriasis ist eine häufige chronisch entzündliche Hauterkrankung, die durch ein angeborenes und adaptives Immunsystem vermittelt wird und durch eine abnormale Proliferation und Differenzierung der epidermalen Keratinozyten und eine Infiltration von Entzündungszellen gekennzeichnet ist. Hautspezifische Keratinozyten sind wichtige Akteure der angeborenen Immunität, reagieren auf Immunzellen und Umweltreize und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Immunpathogenese der Psoriasis. Hier stellen wir eine Methode zur Induktion einer psoriasiformen Keratinozytenentzündung auf Transkriptionsebene mit HaCaT-Zelllinie unter Verwendung von fünf proinflammatorischen Zytokinkombinationen (M5-Kombination) vor, darunter IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M. Die Ergebnisse zeigen, dass M5-Kombinations-induzierte HaCaT-Zellen erhöhte Spiegel an antimikrobiellen Peptiden (BD2, S100A7, S100A8 und S100A9), Chemokinen und Zytokinen (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 und IL-18). Die mRNA-Spiegel der Keratinozyten-Differenzierungsmarker (Keratin1, Keratin10, Filaggrin und Loricrin) waren herunterreguliert, was mit den Transkriptomdaten übereinstimmte, die von Psoriasis-ähnlichen Keratinozyten abgeleitet wurden. Die hier beschriebene Methode etabliert daher in vitro eine psoriasiforme Hautentzündung auf Transkriptionsebene und trägt zur Erforschung der molekularen Pathogenese der Psoriasis bei.

Einleitung

Psoriasis ist eine häufige, nicht ansteckende chronisch-entzündliche Hauterkrankung, die durch eine fehlregulierte Immunantwort ausgelöst wird und die Keratinozyten betrifft, die überwiegend die Epidermisbilden 1, und die durch eine ungewöhnlich schnelle Vermehrung von Keratinozyten mit Hyperkeratose und Parakeratose gekennzeichnet ist. Psoriasis betrifft etwa 3 % der weltwilden Population2. Die Krankheitslast wird durch verschiedene Komorbiditäten weiter erhöht, darunter Herz-Kreislauf-Erkrankungen und das metabolische Syndrom, das durch das Syndromverursacht wird 3.

Die Epidermis besteht aus fünf Schichten von Keratinozyten, die sich morphologisch mit dem Differenzierungsprozess verändern: das Stratum basal, das Stratum spinosum, das Stratum granulosum, das Stratum lucidum (zu finden an Handflächen und Fußsohlen) und das Stratum corneum, die hier von der inneren zur äußeren Oberfläche beschriebenwerden 4. Eine Veränderung der Epidermisdifferenzierung führt zu einer gestörten Hautbarriere, die für die Pathogenese entzündlicher Hauterkrankungen wichtig ist 5,6,7,8. Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung einer intakten epidermalen Barriere, um Wasserverlust zu verhindern und Umwelteinflüsse wie UVB-Exposition, Allergene und Krankheitserregerzu bekämpfen 9. Gesunde Menschen zeigen ein Gleichgewicht zwischen der Proliferation der Basalzellen und der Abschuppung des Stratum corneum, während mehrere Hautkrankheiten, einschließlich Psoriasis, durch ein Ungleichgewicht dieses komplexen Mechanismus gekennzeichnet sind10.

Keratinozyten bilden nicht nur die Barrierefunktion, sondern sind auch ein wichtiger Bestandteil des Immunsystems der Haut. In den Immunpathogenesen der Psoriasis führt die Aktivierung von hautresidenten Typ-1-T-Helferzellen (Th1) und Typ-17-T-Helferzellen (Th17) zu einer erhöhten Produktion von IFN-γ bzw. IL-17A. Diese Zytokine induzieren eine erhöhte Synthese von Chemokinen (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), antimikrobiellen Peptiden (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) und anderen Entzündungsfaktoren (TNF-α, IL-6, IFN-β) in Keratinozyten, was zur Rekrutierung von mehr Th1, Th17 und Neutrophilen in die Haut führt, wodurch die IL-17/IL23-Achse weiter verstärktwird 11. Die Wechselwirkung zwischen Keratinozyten und Immunzellen ist für die Induktion und Aufrechterhaltung der Psoriasisverantwortlich 11.

Komplexe Zytokinnetzwerke wurden bei Psoriasis beschrieben, und die zentrale Rolle von proinflammatorischen Zytokinen (wie IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, Oncostatin M (OSM) und TNF-α), die durch die Infiltration von Immunzellen produziert werden, wurde hervorgehoben12,13. In der Tat haben frühere Studien gezeigt, dass erhöhte Spiegel von IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und OSM in vitro ein Profil von psoriasiformen Keratinozyten auf normalen menschlichen epidermalen Keratinozyten induzierten14.

Immortale Keratinozyten-Zelllinien (HaCaT), die leichter zu gewinnen und zu kultivieren sind als primäre Keratinozyten mit besserer Reproduzierbarkeit, wurden häufig für die Untersuchung von Psoriasisverwendet 15,16,17,18,19,20. Im Gegensatz zu humanen Papillomavirus16 E6/E7-transformierten HEK001- und KerTr-Zellen ist die HaCaT-Zelllinie in der Lage, Differenzierungsgenprodukte zu exprimieren, einschließlich Keratin1 (KRT1), Keratin10 (KRT10), Loricrin und Filaggrin 20,21,22, wodurch sie ein vielversprechendes Werkzeug ähnlich wie primäre Keratinozyten zur Untersuchung der Regulation von Keratinisierung und Proinflammation darstellen.

KRT5/14 ist das Hauptkeratinpaar vom Typ I und Typ II, das in proliferativen basalen Keratinozyten exprimiert wird, während differenzierte Keratinozyten in den suprabasalen Schichten KRT5/14 herunterregulieren und KRT1/10 als Hauptkeratinpaar exprimieren23. Beim Vergleich der Psoriasis-Läsion mit gesunder Haut umfassten die Veränderungen der Keratinexpression eine Abnahme von KRT1/1024,25 und eine Zunahme von KRT5/14 in der Psoriasis-Epidermis26, gekennzeichnet durch Hyperproliferation und Parakeratose27. Loricrin ist ein terminaldifferenzierendes Strukturprotein, das mehr als 70 % der verhornten Hülle ausmacht und zur Schutzbarriere des Stratum corneumbeiträgt 28, die in der Haut von Psoriasis-Patienten herunterreguliertwird 29. Filaggrin wird in den letzten Stadien der Keratinozytendifferenzierung exprimiert und ist an der Aggregation einer gerüstartigen verhornten Hüllebeteiligt 30, verminderte Expression in der Haut von Psoriasis-Läsionen29.

Insgesamt war es unser Ziel, ein inflammatorisches Keratinozytenmodell in HaCaT-Zellen unter Verwendung einer Zytokinkombination zu generieren, die in der Lage sein wird, einige Merkmale von Psoriasis-Hautläsionen, einschließlich der Initiierung einer Immunantwort, der Proliferation von Keratinozyten und der Differenzierung, synergistisch zu rekapitulieren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

Führen Sie die Schritte 1 bis 3 unter sterilen Bedingungen durch. Das gesamte Kulturmedium enthielt 0,1 mg/ml Penicillin und Streptomycin.

1. Vorbereitung der Zellen

  1. 1 x 106 HaCaT-Zellen in 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) in einer 100 mm Zellkulturschale. Inkubieren Sie die Kulturschale bei 37 °C in einem befeuchteten 5 %CO 2 -Inkubator für 2 Tage.
  2. Wenn die Kultur eine Konfluenz von etwa 80 % erreicht, nehmen Sie das Medium vorsichtig aus der Kulturschale und waschen Sie die Zellen mit 5 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig von Hand.
  3. Entfernen Sie PBS und geben Sie 2 ml 0,25% ige Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen. Schütteln Sie die Kulturschale vorsichtig, damit die Lösung die Monoschicht der Zellen vollständig bedecken kann.
  4. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator für 5 Minuten, bis sich die Zellen unter Phasenkontrastmikroskopie sichtbar von der Oberfläche der Kulturschale gelöst haben.
    HINWEIS: Die Morphologie der Zellen sollte rund erscheinen. Wenn die Zellen nicht gut abgelöst sind, inkubieren Sie für einen zusätzlichen Zeitraum von 5 Minuten unter manuellem Rühren.
  5. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie 5 ml DMEM plus 10 % FBS hinzu, um Trypsin zu inaktivieren, und sammeln Sie die Zellsuspension mit einer Pipette in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen.
  6. Das Röhrchen mit der Zellsuspension bei 180 x g für 5 min zentrifugieren. Dekantieren Sie den Überstand.
  7. Geben Sie 10 mL DMEM plus 10 % FBS-Medium zum Pellet und pipettieren Sie das Medium vorsichtig auf und ab, um die Zellen in Suspension zu bringen.

2. Zellaussaat in der 6-Well-Platte

  1. Aussaat der Zellen mit einer Dichte von 2,0 x 105 Zellen/Well in einer 6-Well-Kulturplatte.
  2. Inkubieren Sie die 6-Well-Kulturplatte bei 37 °C in einem befeuchteten 5 % CO2 -Inkubator über Nacht, bevor Sie die M5-Kombinationsstimulation durchführen, damit die Zellen an der Platte haften bleiben.

3. M5-Stimulation von HaCaT-Zellen

  1. Bereiten Sie ein M5-Zytokin-Kombinationsmischmedium vor, das 10 ng/ml rekombinantes IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M-Protein in DMEM mit 2 % FBS enthält.
    HINWEIS: Die M5-Kombination bestand aus einer Rekombination von IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α und Oncostatin M. Die synergistische Wirkung der M5-Kombination rekapituliert einige Merkmale der Psoriasis, wie die Hochregulierung von Chemokinen und die Produktion antimikrobieller Peptide31.
  2. Entfernen Sie nach der Zellkultur über Nacht den Überstand und pipettieren Sie 2 ml M5-Kombinationsmischmedium in jede Vertiefung.
  3. Kultivieren Sie die Zellen weiter; Die Zelllysate wurden nach 24 h für die mRNA-Quantifizierung (Schritt 4) entnommen oder der Kulturüberstand wurde nach 48-72 h für die Bestimmung der Zytokinspiegel mit dem ELISA-Assay 32,33,34,35,36,37 (Schritt 6) entnommen.

4. Ernte von mRNA von M5-stimulierten HaCaT-Zellen

  1. Aspirieren Sie das M5-Kombinationsmischmedium und waschen Sie es einmal mit 1-2 mL kaltem PBS.
  2. Aspirieren Sie PBS und geben Sie 1 ml handelsübliche Guanidiumisothiocyanatlösung direkt in die Kulturschale, um die Zellen zu lysieren.
  3. Pipettieren Sie das Lysat mehrmals auf und ab, um es zu homogenisieren und in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  4. 200 μl Chloroform zugeben, das Röhrchen ca. 20 s kräftig schütteln und die Probe 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  5. Zentrifugieren bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C.
  6. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  7. 500 μl Isopropanol in die wässrige Phase geben und vorsichtig mischen. 5 Min. bei Raumtemperatur ruhen lassen.
  8. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 15 min bei 4 °C.
  9. Aspirieren Sie Isopropanol und fügen Sie 1 ml 75%iges Ethanol hinzu. Waschen Sie das Pellet einmal.
  10. Zentrifugieren Sie bei 7.500 x g für 5 min bei 4 °C. Gießen Sie das Ethanol ab und lassen Sie die Pellets an der Luft trocknen.
  11. Geben Sie 30 μl DEPC-behandeltes Wasser in das RNA-Pellet. Bereiten Sie sich auf den RT-PCR-Nachweis vor.

5. Analyse der mRNA-Expression mittels Real-Time PCR

  1. Führen Sie die cDNA-Synthese mit 1 μg Gesamt-RNA unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers durch.
    HINWEIS: 1 μg Gesamt-RNA für den SYBR Green RT-PCR-Assay.
  2. Bereiten Sie das PCR-Reaktionsgemisch vor. 12,5 μl SYBR-Premix EX Taq II, 1 μl PCR Forward Primer (10 μM), 1 μl PCR Reverse Primer (10 μM), 2 μg cDNA und 8,5 μl dH2O. Das Endvolumen beträgt 25 μl pro Reaktion.
    HINWEIS: Eine Liste der Primersequenzen von Genen, die in dieser Studie für die RT-PCR-Analyse verwendet wurden, ist in Tabelle 1 aufgeführt.
  3. Im Thermocycler inkubieren. Die Zyklusbedingungen umfassten einen Denaturierungsschritt bei 95 °C für 30 s, 40 Zyklen bei 95 °C für 5 s, 60 °C für 30 s, 72 °C für 20 s und eine Schmelzkurvenanalyse.
  4. Analysieren Sie RT-PCR-Experimentdaten, indem Sie relative Unterschiede in der Genexpression von Ct-Werten (Schwellenwert) unter Verwendung von 2-ΔΔCT-Gleichungenberechnen. Verwenden Sie β-Aktin als interne Kontrolle für die relative quantitative Standardisierung der Genexpression in der RT-PCR.

6. Entnahme des Zellkulturüberstands für den ELISA

  1. Pipettieren Sie jedes Zellkulturmedium in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen.
  2. Zentrifugieren Sie bei 1500 x g für 10 min bei 4 °C.
  3. Den Überstand aliquotieren und sofort bei -80 °C lagern.

7. Analyse der Zytokinexpression mittels ELISA

  1. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers, um alle Reagenzien, den Arbeitsstandard und die Proben vorzubereiten. Eine dreifache serielle Verdünnung von Standard mit Probenverdünnungsmittel im Bereich von 2.000 bis 2,74 pg/ml. Proben 1:2 mit Probenverdünnungsmittel verdünnen.
  2. Fügen Sie 100 μl Standard und Probe pro Vertiefung hinzu. Decken Sie die Vertiefungen mit dem Deckel ab und verschließen Sie die Platte mit Paraffinfolie. 2,5 h bei Raumtemperatur inkubieren.
  3. Nach 2,5 h die Lösung verwerfen. Geben Sie 300 μl Waschpuffer für 3 Minuten in jede Vertiefung der Platte und aspirieren Sie. Wiederholen Sie den Vorgang vier weitere Male. Nach dem letzten Waschen drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf saugfähiges Papier, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  4. Geben Sie 100 μl der Nachweis-Antikörperlösung in jede Vertiefung. Die Platte auf einem Shaker 2 h bei 37 °C inkubieren.
    HINWEIS: Biotinylierte Nachweis-Antikörperlösung wird in jedem ELISA-Kit hergestellt.
  5. Aspirieren und waschen Sie jede Vertiefung der Platte fünfmal mit 300 μl Waschpuffer. Nach dem letzten Waschen die Platte umdrehen und auf saugfähiges Papier klopfen, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  6. Geben Sie 100 μl HRP-Streptavidin-Konjugat in jede Vertiefung. 45 min bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln inkubieren.
  7. Verwerfen Sie die Lösung, indem Sie sie nach der Inkubation mit einer Pipette aspirieren. Waschen Sie jede Vertiefung der Platte fünfmal mit 300 μl Waschpuffer. Nach dem letzten Waschen drehen Sie die Platte um und klopfen Sie auf das saugfähige Papier, um die restliche Flüssigkeit zu entfernen.
  8. Führen Sie die Detektion durch, indem Sie 100 μl TMB-Substrat in jede Vertiefung geben. 30 min bei 37 °C im Dunkeln inkubieren.
  9. Geben Sie 50 μl Stopplösung, wenn sich die Farbe entwickelt, in jede Vertiefung. Klopfen Sie vorsichtig auf die Platte, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten. Sofort bei 450 nm ablesen.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Die M5-Kombinationsstimulation induzierte eine Entzündungsreaktion von HaCaT-Zellen.
HaCaT-Zellen wurden mit oder ohne M5-Zytokin-Kombination für 24 h stimuliert. Die mRNA-Expression von Psoriasis-bezogenen Genen, die an der Regulation der Immun- und Entzündungschemokine und antimikrobiellen Peptide beteiligt sind, wurde untersucht. Die neutrophilen Chemokine CXCL138, CXCL2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Hierin wird ein Verfahren beschrieben, bei dem fünf Zytokinkombinationen (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) in HaCaT-Zelllinie verwendet werden, um ein in vitro psoriasiformes kutanes Entzündungsprofil auf Transkriptionsebene zu etablieren. Dieses Protokoll kann für die Untersuchung des Mechanismus von Genen in der Pathogenese der Psoriasis sowie für das Screening von therapeutischen Medikamenten gegen Psoriasis angepasst werden. Jüngste Berichte haben gezeigt, dass die Überexpre...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Offenlegungen

Die Autoren berichteten von keinem potenziellen Interessenkonflikt.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 und 81601462]

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

Referenzen

  1. Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
  2. Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
  3. Boehncke, W. -H., Schön, M. P. Psoriasis. Lancet. 386 (9997), London, England. 983-994 (2015).
  4. Zaidi, Z., Lanigan, S. W. Dermatology in Clinical Practice. Lanigan, W. S., Zaidi, Z. , Springer. London. 1-15 (2010).
  5. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: An indispensable barrier. Experimental Dermatology. 17 (12), 1063-1072 (2008).
  6. Van Smeden, J., Janssens, M., Gooris, G., Bouwstra, J. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (3), 295-313 (2014).
  7. Wolf, R., Orion, E., Ruocco, E., Ruocco, V. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of psoriasis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 323-328 (2012).
  8. Proksch, E., Brasch, J. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of contact dermatitis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 335-344 (2012).
  9. Bäsler, K., Brandner, J. M. Tight junctions in skin inflammation. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 469 (1), 3-14 (2017).
  10. Hoffjan, S., Stemmler, S. On the role of the epidermal differentiation complex in ichthyosis vulgaris, atopic dermatitis and psoriasis. British Journal of Dermatology. 157 (3), 441-449 (2007).
  11. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends in Immunology. 34 (4), 174-181 (2013).
  12. Saxena, A., Raychaudhuri, S. K., Raychaudhuri, S. P. Psoriatic Arthritis and Psoriasis. , Springer. 73-82 (2016).
  13. Lowes, M. A., Suárez-Fariñas, M., Krueger, J. G. Immunology of psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  14. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. The Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  15. Wang, Z., et al. Autophagy-based unconventional secretion of HMGB1 by keratinocytes plays a pivotal role in psoriatic skin inflammation. Autophagy. , 1-24 (2020).
  16. Choi, D. H., Hwang, H. S. Anti-inflammation activity of brazilin in TNF-α induced human psoriasis dermatitis skin model. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 46(2019).
  17. Teng, X., et al. IL-37 ameliorates the inflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokine production. Journal of Immunology. 192 (4), 1815-1823 (2014).
  18. Wu, S., et al. The potential of Diosgenin in treating psoriasis: Studies from HaCaT keratinocytes and imiquimod-induced murine model. Life Sciences. 241, 117115(2020).
  19. Katarzyna, B., Elwira, S., Marta, M., Joanna, J. -B., Magdalena, G. -C. Models in the Research Process of Psoriasis. International Journal of Molecular Ences. 18 (12), 2514(2017).
  20. Auewarakul, P., Gissmann, L., Cid-Arregui, A. Targeted expression of the E6 and E7 oncogenes of human papillomavirus type 16 in the epidermis of transgenic mice elicits generalized epidermal hyperplasia involving autocrine factors. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8250-8258 (1994).
  21. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  22. Irma, C., et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators of Inflammation. 2017, 7435621(2017).
  23. Melino, G., et al. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Results & Problems in Cell Differentiation. 24 (4), 175(1998).
  24. Thewes, M., Stadler, R., Mischke, B. K. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation-associated keratins. Archives of Dermatological Research. , (1991).
  25. Ishida-Yamamoto, A., Senshu, T., Takahashi, H., Akiyama, K., Iizuka, H. Decreased deiminated keratin K1 in psoriatic hyperproliferative epidermis. Journal of investigative Dermatology. 114 (4), 701-705 (2000).
  26. Elango, T., et al. Methotrexate normalized keratinocyte activation cycle by overturning abnormal keratins as well as deregulated inflammatory mediators in psoriatic patients. Clinica Chimica Acta. , 329-337 (2015).
  27. Ghadially, R., Reed, J. T., Elias, P. M. Stratum corneum structure and function correlates with phenotype in psoriasis. Journal of investigative dermatology. 107 (4), 558-564 (1996).
  28. Nithya, S., Radhika, T., Jeddy, N. Loricrin - An overview. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 19 (1), (2015).
  29. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal Kinase: Role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 127 (2), (2011).
  30. Gutowska-Owsiak, D., et al. IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion. Experimental dermatology. 21 (2), 104-110 (2012).
  31. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  32. Jeon, B., et al. Optimization and validation of a method to identify skin sensitization hazards using IL-1 α and IL-6 secretion from HaCaT. Toxicology In Vitro : An International Journal Published in Association with BIBRA. 61, 104589(2019).
  33. Lee, K. -M., Kang, J. H., Yun, M., Lee, S. -B. Quercetin inhibits the poly(dA:dT)-induced secretion of IL-18 via down-regulation of the expressions of AIM2 and pro-caspase-1 by inhibiting the JAK2/STAT1 pathway in IFN-γ-primed human keratinocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 116-122 (2018).
  34. Lee, N., Chung, Y. C., Kang, C. I., Park, S. -M., Hyun, C. -G. 7,8-dimethoxycoumarin attenuates the expression of IL-6, IL-8, and CCL2/MCP-1 in TNF-α-treated HaCaT cells by potentially targeting the NF-κB and MAPK pathways. Cosmetics. 6 (3), (2019).
  35. Smolińska, E., Moskot, M., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Wgrzyn, G., Gabig-Cimińska, M. Molecular action of isoflavone genistein in the human epithelial cell line HaCaT. PLoS One. 13 (2), 0192297(2018).
  36. Ying, X., Yan, Y., Li, Y. Tripterine alleviates LPS-induced inflammatory injury by up-regulation of miR-146a in HaCaT cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 798(2018).
  37. Zhang, M., et al. AIM2 inflammasome mediates Arsenic-induced secretion of IL-1 β and IL-18. Oncoimmunology. 5 (6), 1160182(2016).
  38. Lowes, M. A., et al. Immunology of Psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  39. Nedoszytko, B., Wojdyło, M. S., Dziurdzińska, K. -S., Roszkiewicz, J., Nowicki, R. J. Chemokines and cytokines network in the pathogenesis of the inflammatory skin diseases: atopic dermatitis, psoriasis and skin mastocytosis. Postepy Dermatologii i Alergologii. 31, 84-91 (2014).
  40. Glowacka, E., Lewkowicz, P., Rotsztejn, H., Zalewska, A. IL-8, IL-12 and IL-10 cytokines generation by neutrophils, fibroblasts and neutrophils- fibroblasts interaction in psoriasis. Advances in Medical Sciences. 55 (2), 254-260 (2010).
  41. Li, H., et al. Cyr61/CCN1 induces CCL20 production by keratinocyte via activating p38 and JNK/AP-1 pathway in psoriasis. Journal of Dermatological Science. 88 (1), 46-56 (2017).
  42. Kim, T. G., et al. Dermal clusters of mature dendritic cells and T cells are associated with the CCL20/CCR6 chemokine system in chronic psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1462-1465 (2014).
  43. Kolbinger, F., et al. β-Defensin 2 is a responsive biomarker of IL-17A-driven skin pathology in patients with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), (2017).
  44. Ekman, A., Vegfors, J., Eding, C., Enerbäck, C. Overexpression of psoriasin (S100A7) contributes to dysregulated differentiation in psoriasis. Acta Dermato-Venereologica. 97 (4), 441-448 (2016).
  45. Peric, M., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "Alarmins" psoriasin (S100A7) and Koebnerisin (S100A15) in psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  46. Aochi, S., et al. Markedly elevated serum levels of calcium-binding S100A8/A9 proteins in psoriatic arthritis are due to activated monocytes/macrophages. Journal of the American Academy of Dermatology. 64 (5), 879-887 (2011).
  47. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. Journal of Allergy Clinical Immunology. 130 (1), 145-154 (2012).
  48. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  49. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2018).
  50. Mizutani, H., Ohmoto, Y., Mizutani, T., Murata, M., Shimizu, M. Role of increased production of monocytes TNF-alpha, IL-1beta and IL-6 in psoriasis: relation to focal infection, disease activity and responses to treatments. Journal of dermatological science. 14 (2), 145-153 (1997).
  51. Pietrzak, A., Lecewicz-Torun, B., Chodorowska, G., Rolinski, J. Interleukin-18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI score. Acta Dermato-Venereologica. 83 (4), 262-265 (2003).
  52. Cai, Y., et al. A critical role of the IL-1β-IL-1R signaling pathway in skin inflammation and psoriasis pathogenesis. Journal of investigative Dermatology. 139 (1), 146-156 (2018).
  53. Arican, O., Aral, M., Sasmaz, S., Ciragil, P. Serum levels of TNF-α, IFN-γ IL-6, IL-8,IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity. Mediators of Inflammation. 2005 (5), 273-279 (2005).
  54. Grossman, R. M., et al. Interleukin 6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6367-6371 (1989).
  55. Nair, R. P., et al. Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways. Nature Genetics. 41 (2), 199-204 (2009).
  56. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  57. Deyrieux, A. F., Wilson, V. G. In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology. 54 (2), 77-83 (2007).
  58. Micallef, L., et al. Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes. Experimental Dermatology. 18 (2), 143-151 (2009).
  59. Wilson, V. G. Epidermal Cells. , Springer. 33-41 (2013).
  60. Ding, J., et al. Gene expression in skin and lymphoblastoid cells: Refined statistical method reveals extensive overlap in cis-eQTL signals. American Journal of Human Genetics. 87 (6), 779-789 (2010).
  61. Res, P. C., et al. Overrepresentation of IL-17A and IL-22 producing CD8 T cells in lesional skin suggests their involvement in the pathogenesis of psoriasis. PLoS One. 5 (11), (2010).
  62. Groves, R. W., Mizutani, H., Kieffer, J. D., Kupper, T. S. Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11874-11878 (1995).
  63. Chan, J. R., et al. IL-23 stimulates epidermal hyperplasia via TNF and IL-20R2-dependent mechanisms with implications for psoriasis pathogenesis. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2577-2587 (2006).
  64. Zheng, Y., et al. Interleukin-22, a TH 17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis. Nature. 445 (7128), 648-651 (2007).
  65. Ma, H. -L., et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. The Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 597-607 (2008).
  66. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends Immunol. 34 (4), 174-181 (2013).
  67. Banno, T., Gazel, A., Blumenberg, M. Effects of tumor necrosis factor-α (TNFα) in epidermal keratinocytes revealed using global transcriptional profiling. Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32633-32642 (2004).
  68. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  69. Boniface, K., et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. The Journal of Immunology. 178 (7), 4615-4622 (2007).
  70. Terui, T. Role of neutrophils in induction of acute inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis, psoriasis: A neutrophil-associated inflammation-boosting loop. Experimental Dermatology. 9, (2000).
  71. Chiang, C. -C., Cheng, W. -J., Korinek, M., Lin, C. -Y., Hwang, T. -L. Neutrophils in psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 2376(2019).
  72. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 105-113 (2012).
  73. Morizane, S., Gallo, R. L. Antimicrobial peptides in the pathogenesis of psoriasis. The Journal of Dermatology. 39 (3), 225-230 (2012).
  74. Vandal, K., et al. Blockade of S100A8 and S100A9 suppresses neutrophil migration in response to lipopolysaccharide. The Journal of Immunology. 171 (5), 2602-2609 (2003).
  75. Ryckman, C., Vandal, K., Rouleau, P., Talbot, M., Tessier, P. A. Proinflammatory activities of S100: proteins S100A8, S100A9, and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and adhesion. The Journal of Immunology. 170 (6), 3233-3242 (2003).
  76. Nukui, T., et al. S100A8/A9, a key mediator for positive feedback growth stimulation of normal human keratinocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (2), 453-464 (2008).
  77. Yang, D., et al. β-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science. 286 (5439), 525-528 (1999).
  78. Hsu, K., et al. Anti-infective protective properties of S100 calgranulins. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents). 8 (4), 290-305 (2009).
  79. Nestle, F. O., Kaplan, D. H., Barker, J. Psoriasis. The New England journal of medicine. 361 (5), 496-509 (2009).
  80. Tsoi, L. C., et al. Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity. Nature Genetics. 44 (12), 1341(2012).
  81. Swindell, W. R., et al. RNA-seq identifies a diminished differentiation gene signature in primary monolayer keratinocytes grown from lesional and uninvolved psoriatic skin. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  82. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 328-340 (2005).
  83. Frost, P., Weinstein, G. D., Van Scott, E. J. The ichthyosiform dermatoses II. Journal of Investigative Dermatology. 47, 561-567 (1966).
  84. Reichelt, J., Furstenberger, G., Magin, T. M. Loss of keratin 10 leads to mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, increased keratinocyte turnover, and decreased tumor formation in mice. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 973-981 (2004).
  85. Hu, Z., et al. Loss-of-function mutations in filaggrin gene associate with psoriasis vulgaris in Chinese population. Human Genetics. 131 (7), 1269-1274 (2012).
  86. Giardina, E., et al. Characterization of the loricrin (LOR) gene as a positional candidate for the PSORS4 psoriasis susceptibility locus. Annals of Human Genetics. 68 (6), 639-645 (2004).
  87. Suga, H., et al. Skin barrier dysfunction and low antimicrobial peptide expression in cutaneous T-cell lymphoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4339-4348 (2014).
  88. Iotzova-Weiss, G., et al. S100A8/A9 stimulates keratinocyte proliferation in the development of squamous cell carcinoma of the skin via the receptor for advanced glycation-end products. PLoS One. 10 (3), (2015).
  89. Seo, M. -D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomolecules & Therapeutics. 20 (2), 171-176 (2012).
  90. Soboleva, A. G., et al. Genetically predetermined limitation in the use of HaCaT cells that affects their ability to serve as an experimental model of psoriasis. Genetika. 50 (10), 1222-1231 (2014).
  91. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2019).
  92. Inoue, K., et al. Mechanism underlying ATP release in human epidermal keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1465-1468 (2014).
  93. Harden, J. L., et al. CARD14 expression in dermal endothelial cells in psoriasis. PLoS One. 9 (11), 111255(2014).
  94. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), (2012).
  95. Hegyi, Z., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "alarmins" psoriasin (S100A7) and koebnerisin (S100A15) in psoriasis. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  96. Schonthaler, H. B., et al. S100A8-S100A9 protein complex mediates psoriasis by regulating the expression of complement factor C3. Immunity. 39 (6), 1171-1181 (2013).
  97. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  98. Leuner, K., et al. Reduced TRPC channel expression in psoriatic keratinocytes is associated with impaired differentiation and enhanced proliferation. PLoS One. 6 (2), 14716(2011).
  99. Gao, L., et al. Ozone therapy promotes the differentiation of basal keratinocytes via increasing Tp63-mediated transcription of KRT10 to improve psoriasis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (8), 4819-4829 (2020).
  100. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal kinase: role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (6), 1272-1279 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Weitere Artikel entdecken

TranskriptionsprofilPsoriasiformHaCaT ZellenZytokinePsoriasisKeratinozytenEntz ndungenantimikrobielle PeptideChemokineZytokineDifferenzierungsmarkerTranskriptomdatenmolekulare Pathogenese

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Kontakt

BIBLIOTHEKS-EMPFEHLUNG

JoVE-Newsletter

Forschung

Lehre

Autoren

Bibliothekare

ÜBER JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten