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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo articolo presenta un metodo per stabilire un modello infiammatorio cutaneo psoriasiforme in vitro a livello di trascrizione utilizzando una combinazione di cinque citochine (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) su linea cellulare HaCaT.

Abstract

La psoriasi è una comune malattia infiammatoria cronica della pelle mediata dal sistema immunitario innato e adattativo, caratterizzata da proliferazione e differenziazione anomala dei cheratinociti epidermici e infiltrazione di cellule infiammatorie. I cheratinociti specifici della pelle sono partecipanti chiave nell'immunità innata, rispondono alle cellule immunitarie e alla stimolazione ambientale, svolgendo così un ruolo importante nell'immunopatogenesi della psoriasi. Qui, presentiamo un metodo per indurre l'infiammazione dei cheratinociti psoriasiformi a livello di trascrizione con la linea cellulare HaCaT utilizzando cinque combinazioni di citochine proinfiammatorie (combinazione M5), tra cui IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e oncostatina M. I risultati dimostrano che le cellule HaCaT indotte dalla combinazione M5 hanno mostrato un aumento dei livelli di peptidi antimicrobici (BD2, S100A7, S100A8 e S100A9), chemochine e citochine (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 e IL-18). I livelli di mRNA dei marcatori di differenziazione dei cheratinociti (Cheratina1, Cheratina10, Filaggrina e Loricrina) erano sottoregolati, il che era coerente con i dati del trascrittoma derivati dai cheratinociti simili alla psoriasi. Il metodo qui descritto, quindi, stabilisce un'infiammazione cutanea psoriasiforme in vitro a livello trascrizionale e contribuisce alla ricerca della patogenesi molecolare della psoriasi.

Introduzione

La psoriasi è una comune malattia infiammatoria cronica della pelle non contagiosa innescata da una risposta immunitaria disregolata, che colpisce i cheratinociti che formano prevalentemente l'epidermide1, caratterizzata da una moltiplicazione anormalmente rapida dei cheratinociti con ipercheratosi e paracheratosi. La psoriasi colpisce circa il 3% della popolazione selvatica mondiale2. Il carico di malattia è ulteriormente aumentato da diverse comorbidità, tra cui le malattie cardiovascolari e la sindrome metabolica causata dalla sindrome3.

L'epidermide è composta da cinque strati di cheratinociti e subisce un cambiamento morfologico con processo di differenziazione: lo strato basale, lo strato spinoso, lo strato granuloso, lo strato lucido (che si trova sui palmi delle mani e sulle piante dei piedi) e lo strato corneo qui descritto dalla superficie interna a quella esterna4. Il cambiamento nella differenziazione dell'epidermide porta a una barriera cutanea disturbata, che è importante per la patogenesi delle malattie infiammatorie della pelle 5,6,7,8. I cheratinociti svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento di una barriera epidermica intatta per prevenire la perdita di acqua e contro i fattori scatenanti ambientali come l'esposizione ai raggi UVB, gli allergeni e gli agenti patogeni9. Gli individui sani mostrano un equilibrio tra la proliferazione delle cellule basali e la desquamazione dello strato corneo, mentre molteplici malattie della pelle, tra cui la psoriasi, sono caratterizzate da uno squilibrio di questo complesso meccanismo10.

Oltre a formare la funzione di barriera, i cheratinociti sono anche un componente fondamentale del sistema immunitario della pelle. Nelle immunopatogenesi della psoriasi, l'attivazione delle cellule T helper di tipo 1 residenti nella pelle (Th1) e delle cellule T helper di tipo 17 (Th17), porta ad un aumento della produzione di IFN-γ e IL-17A, rispettivamente. Queste citochine inducono un aumento della sintesi di chemochine (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), peptidi antimicrobici (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) e altri fattori infiammatori (TNF-α, IL-6, IFN-β) nei cheratinociti, portando al reclutamento di più Th1, Th17 e neutrofili nella pelle, amplificando ulteriormente l'asse11 IL-17/IL23. Il crosstalk tra cheratinociti e cellule immunitarie è responsabile dell'induzione e del mantenimento della psoriasi11.

Nella psoriasi sono state descritte reti di citochine complesse ed è stato evidenziato il ruolo centrale delle citochine pro-infiammatorie (come IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, oncostatina M (OSM) e TNF-α) prodotte dall'infiltrazione di cellule immunitarie12,13. Infatti, studi precedenti hanno dimostrato che l'aumento dei livelli di IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e OSM ha indotto un profilo di psoriasiformia su cheratinociti epidermici umani normali in vitro14.

Le linee cellulari di cheratinociti immortali (HaCaT) che sono più facilmente ottenibili e coltivate rispetto ai cheratinociti primari con una migliore riproducibilità, sono state ampiamente utilizzate per lo studio della psoriasi 15,16,17,18,19,20. A differenza del papillomavirus umano16 E6/E7 trasformato HEK001 e dalle cellule KerTr, la linea cellulare HaCaT è in grado di esprimere prodotti genici di differenziazione, tra cui cheratina1 (KRT1), cheratina10 (KRT10), Loricrina e filaggrina 20,21,22, fornendo così uno strumento promettente simile ai cheratinociti primari per studiare la regolazione della cheratinizzazione e della proinfiammazione.

KRT5/14 è la principale coppia di cheratina di tipo I-tipo II espressa nei cheratinociti basali proliferativi, mentre i cheratinociti differenziati negli strati soprabasali sottoregolano KRT5/14 ed esprimono KRT1/10 come la principale coppia di cheratina23. Dopo il confronto della lesione psoriasica con la pelle sana, i cambiamenti nell'espressione della cheratina includevano diminuzioni di KRT1/1024,25 e aumenti di KRT5/14 nell'epidermide psoriasica26, caratterizzata da iperproliferazione e paracheratosi27. La loricrina è una proteina strutturale differenziante terminale che comprende oltre il 70% dell'involucro corneo cornificato, contribuisce alla funzione di barriera protettiva dello strato corneo28, sottoregolata nella pelle dei pazienti con psoriasi29. La filaggrina è espressa nelle fasi finali della differenziazione dei cheratinociti ed è coinvolta nell'aggregazione di un involucro cornificato simile a uno scaffold30, diminuendo l'espressione nella pelle con lesione psoriasica29.

Nel complesso, il nostro obiettivo era quello di generare un modello di cheratinociti infiammatori in cellule HaCaT utilizzando una combinazione di citochine che sarà in grado di ricapitolare sinergicamente alcune caratteristiche delle lesioni cutanee della psoriasi, tra cui l'avvio di una risposta immunitaria, la proliferazione e la differenziazione dei cheratinociti.

Protocollo

Eseguire i passaggi da 1 a 3 in condizioni sterili. Tutto il terreno di coltura conteneva 0,1 mg/mL di penicillina e streptomicina.

1. Preparazione delle cellule

  1. Seminare 1 x 106 cellule HaCaT in 10 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) in una piastra di coltura cellulare da 100 mm. Incubare la piastra di coltura a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 2 giorni.
  2. Quando la coltura raggiunge circa l'80% di confluenza, rimuovere con cura il terreno dalla piastra di coltura e lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x. Scuotere delicatamente il piatto di coltura manualmente.
  3. Rimuovere il PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% alle cellule. Agitare delicatamente la piastra di coltura per consentire alla soluzione di ricoprire completamente il monostrato di cellule.
  4. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per 5 minuti fino a quando le cellule non si sono visibilmente staccate dalla superficie della piastra di coltura al microscopio a contrasto di fase.
    NOTA: La morfologia delle cellule dovrebbe apparire rotonda. Se le cellule non sono ben staccate, incubare per un ulteriore periodo di 5 minuti insieme all'agitazione manuale.
  5. Una volta staccate le cellule, aggiungere 5 mL di DMEM più il 10% di FBS per inattivare la tripsina e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 50 mL utilizzando una pipetta.
  6. Centrifugare la provetta contenente la sospensione cellulare a 180 x g per 5 minuti. Decantare il surnatante.
  7. Aggiungere 10 mL di DMEM più il 10% di terreno FBS al pellet e pipettare delicatamente il terreno su e giù per portare le cellule in sospensione.

2. Semina cellulare nella piastra a 6 pozzetti

  1. Seminare le cellule a una densità di 2,0 x 105 cellule/pozzetto in una piastra di coltura a 6 pozzetti.
  2. Incubare la piastra di coltura a 6 pozzetti a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 per una notte prima della stimolazione combinata M5 per far aderire le cellule alla piastra.

3. Stimolazione M5 delle cellule HaCaT

  1. Preparare il terreno di miscela di citochine M5 contenente 10 ng/mL di IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ricombinante e la proteina M dell'oncostatina in DMEM contenente il 2% di FBS.
    NOTA: La combinazione M5 consisteva nella ricombinazione di IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e oncostatina M. L'azione sinergica della combinazione M5 ricapitola alcune caratteristiche della psoriasi, come la sovraregolazione delle chemochine e la produzione di peptidi antimicrobici31.
  2. Dopo la coltura cellulare durante la notte, rimuovere il surnatante e pipettare 2 mL di terreno di miscelazione combinato M5 in ciascun pozzetto.
  3. Continuare a coltivare le cellule; i lisati cellulari sono stati raccolti a 24 ore per la quantificazione dell'mRNA (fase 4) o il surnatante di coltura è stato raccolto a 48-72 ore per la determinazione dei livelli di citochine mediante saggio ELISA 32,33,34,35,36,37 (fase 6).

4. Raccolta dell'mRNA di cellule HaCaT stimolate M5

  1. Aspirare il terreno di coltura combinato M5 e lavare una volta con 1-2 ml di PBS freddo.
  2. Aspirare il PBS e aggiungere 1 mL di soluzione di isotiocianato di guanidio disponibile in commercio direttamente nel piatto di coltura per lisare le cellule.
  3. Pipettare il lisato su e giù più volte per omogeneizzare e trasferire il lisato cellulare in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min.
  4. Aggiungere 200 μl di cloroformio, agitare energicamente la provetta per circa 20 s e incubare il campione per 5 minuti a temperatura ambiente.
  5. Centrifugare a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.
  6. Trasferire la fase acquosa in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 mL.
  7. Aggiungere 500 μl di isopropanolo alla fase acquosa e mescolare delicatamente. Lasciare a temperatura ambiente per 5 min.
  8. Centrifugare a 10.000 x g per 15 min a 4 °C.
  9. Aspirare l'isopropanolo e aggiungere 1 mL di etanolo al 75%. Lavare il pellet una volta.
  10. Centrifugare a 7.500 x g per 5 min a 4 °C. Versare l'etanolo e lasciare asciugare i pellet all'aria.
  11. Aggiungere 30 μL di acqua trattata con DEPC al pellet di RNA. Prepararsi per il rilevamento RT-PCR.

5. Analisi dell'espressione dell'mRNA mediante Real-Time PCR

  1. Eseguire la sintesi del cDNA con 1 μg di RNA totale utilizzando un kit disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore.
    NOTA: 1 μg di RNA totale per il saggio SYBR Green RT-PCR.
  2. Preparare la miscela di reazione PCR. 12,5 μl di premiscela SYBR EX Taq II, 1 μl di PCR Forward Primer (10 μM), 1 μl di PCR Reverse Primer (10 μM), 2 μg di cDNA e 8,5 μl di dH2O. Il volume finale è di 25 μl per reazione.
    NOTA: L'elenco delle sequenze di primer dei geni utilizzati per l'analisi RT-PCR in questo studio è mostrato nella Tabella 1.
  3. Incubare in termociclatore. Le condizioni di ciclo includevano una fase di denaturazione a 95 °C per 30 s, 40 cicli di 95 °C per 5 s, 60 °C per 30 s, 72 °C per 20 s e un'analisi della curva di fusione.
  4. Analizza i dati dell'esperimento RT-PCR calcolando le differenze relative nell'espressione genica dai valori Ct (ciclo di soglia) utilizzando equazioni 2-ΔΔCT. Utilizzare la β-actina come controllo interno per la standardizzazione dell'espressione genica quantitativa relativa alla RT-PCR.

6. Raccolta del surnatante di coltura cellulare per ELISA

  1. Pipettare ciascun terreno di coltura cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.
  2. Centrifugare a 1500 x g per 10 min a 4 °C.
  3. Aliquotare il surnatante e conservare immediatamente a -80 °C.

7. Analisi dell'espressione di citochine mediante ELISA

  1. Seguire le istruzioni del produttore per preparare tutti i reagenti, lo standard di lavoro e i campioni. Una diluizione seriale tripla dello standard con diluente campione compreso tra 2.000 e 2,74 pg/mL. Diluire i campioni 1:2 con il diluente per campioni.
  2. Aggiungere 100 μl di standard e campione per pozzetto. Coprire i pozzetti con il coperchio e sigillare la piastra con pellicola di paraffina. Incubare per 2,5 ore a temperatura ambiente.
  3. Dopo 2,5 ore, scartare la soluzione. Aggiungere 300 μL di tampone di lavaggio in ciascun pozzetto della piastra per 3 minuti e aspirare. Ripeti il processo per altre quattro volte. Dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare sulla carta assorbente per rimuovere il liquido rimasto.
  4. Aggiungere 100 μl della soluzione di anticorpi di rilevamento a ciascun pozzetto. Incubare la piastra su un agitatore per 2 ore a 37 °C.
    NOTA: La soluzione di anticorpi biotinilati per la rilevazione è preparata in ogni kit ELISA.
  5. Aspirare e lavare ogni pozzetto della piastra cinque volte utilizzando 300 μL di tampone di lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare sulla carta assorbente per rimuovere il liquido rimasto.
  6. Aggiungere 100 μL di coniugato HRP-streptavidina a ciascun pozzetto. Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente agitando delicatamente.
  7. Scartare la soluzione aspirando con una pipetta dopo l'incubazione. Lavare ogni pozzetto della piastra cinque volte utilizzando 300 μL di tampone di lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, capovolgere la piastra e picchiettare sulla carta assorbente per rimuovere il liquido rimasto.
  8. Eseguire il rilevamento aggiungendo 100 μL di substrato TMB a ciascun pozzetto. Incubare per 30 minuti a 37 °C al buio.
  9. Aggiungere 50 μL di soluzione di arresto, quando si sviluppa il colore, a ciascun pozzetto. Picchiettare delicatamente la piastra per garantire una miscelazione accurata. Lettura immediata a 450 nm.

Risultati

La stimolazione combinata M5 ha indotto la risposta infiammatoria delle cellule HaCaT.
Le cellule HaCaT sono state stimolate con o senza combinazione di citochine M5 per 24 ore. È stata valutata l'espressione dell'mRNA dei geni correlati alla psoriasi, che sono coinvolti nella regolazione delle chemochine immunitarie e infiammatorie e dei peptidi antimicrobici. Le chemochine neutrofile CXCL138, CXC...

Discussione

Il metodo qui descritto è un metodo che utilizza la combinazione di cinque citochine (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) in una linea cellulare HaCaT per stabilire un profilo di infiammazione cutanea psoriasiforme in vitro a livello di trascrizione. Questo protocollo può essere adattato per lo studio del meccanismo dei geni nella patogenesi della psoriasi e per lo screening di farmaci terapeutici per la psoriasi. Recenti studi hanno dimostrato che la sovraespressione delle cellule T C...

Divulgazioni

Gli autori non hanno segnalato alcun potenziale conflitto di interessi.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 e 81601462]

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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