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要約

この論文では、HaCaT細胞株上の5つのサイトカイン(IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、OSM)の組み合わせを使用して、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症モデルを確立する方法を提示します。

要約

乾癬は、自然免疫系と適応免疫系によって媒介される一般的な慢性炎症性皮膚疾患であり、表皮ケラチノサイトの異常な増殖と分化、および炎症細胞の浸潤を特徴としています。皮膚特異的なケラチノサイトは、自然免疫の主要な参加者であり、免疫細胞や環境刺激に応答するため、乾癬の免疫病因に重要な役割を果たしています。ここでは、IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、およびオンコスタチンMを含む5つの炎症誘発性サイトカインの組み合わせ(M5の組み合わせ)を使用して、HaCaT細胞株で乾癬様ケラチノサイトの炎症を転写レベルで誘導する方法を紹介します。結果は、M5の組み合わせ誘導HaCaT細胞が抗菌ペプチド(BD2、 S100A7、 S100A8、および S100A9)、ケモカイン、およびサイトカイン(CXCL1、 CXCL2、 CXCL8、 CCL20、IL-1β、IL-6およびIL-18)。ケラチノサイトの分化マーカー(Keratin1、 Keratin10、 Filaggrin、 およびLoricrin)のmRNAレベルはダウンレギュレーションされており、これは乾癬様ケラチノサイトに由来するトランスクリプトームデータと一致していました。したがって、ここで説明する方法は、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症を確立し、乾癬の分子病因の研究に貢献します。

概要

乾癬は、免疫応答の調節不全によって引き起こされる一般的な非伝染性慢性炎症性皮膚疾患であり、主に表皮を形成するケラチノサイトに影響を与えます1、ケラチノサイトと角化亢進症および不全角化症を伴うケラチノサイトの異常急速な増殖を特徴としています。乾癬は、世界の野生の人口の約3%に影響を及ぼします2。疾患負担は、心血管疾患やシンドロームによって引き起こされるメタボリックシンドロームなど、いくつかの併存疾患によってさらに増加します3。

表皮は、ケラチノサイトの5つの層から構成され、分化の過程で、基底層、棘層、顆粒層、ルシダム層(手のひらと足の裏に見られる)、角質層4の形態変化を経ます。表皮の分化の変化は、皮膚のバリアの乱れを引き起こし、これは皮膚炎症性疾患の病因にとって重要です5,6,7,8。ケラチノサイトは、水分の損失を防ぎ、UVB曝露、アレルゲン、病原体などの環境トリガーに対して、無傷の表皮バリアを維持する上で重要な役割を果たします9。健康な人は、基底細胞の増殖と角質層の落屑のバランスを示していますが、乾癬を含む複数の皮膚疾患は、この複雑なメカニズムの不均衡によって特徴付けられます10。

ケラチノサイトは、バリア機能を形成するだけでなく、皮膚の免疫系の重要な構成要素でもあります。乾癬の免疫病因では、皮膚に常在する1型ヘルパーT細胞(Th1)と17型ヘルパーT細胞(Th17)の活性化により、それぞれIFN-γとIL-17Aの産生が増加します。これらのサイトカインは、ケラチノサイトにおけるケモカイン(CCL20、CXCL1/2/8/9/10/11)、抗菌ペプチド(BD2、LL37、S100A7/8/9/12)、およびその他の炎症性因子(TNF-α、IL-6、IFN-β)の合成の増加を誘導し、皮膚へのTh1、Th17、および好中球の動員につながり、IL-17/IL23軸11をさらに増幅します。ケラチノサイトと免疫細胞との間のクロストークは、乾癬の誘導と維持に関与しています11。

乾癬では複雑なサイトカインネットワークが報告されており、免疫細胞の浸潤によって産生される炎症誘発性サイトカイン(IL-23、IL-22、IL-17、IL-1α、オンコスタチンM(OSM)、TNF-αなど)の中心的な役割が強調されています12,13。実際、以前の研究では、IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、およびOSMのレベルの増加が、in vitroで正常なヒト表皮ケラチノサイトに乾癬様のプロファイルを誘発することが示されています14。

初代ケラチノサイトよりも入手が容易で培養が容易で再現性の高い不死性ケラチノサイト細胞株(HaCaT)は、乾癬の研究に広く使用されています15,16,17,18,19,20。ヒトパピローマウイルス16 E6/E7形質転換HEK001およびKerTr細胞とは異なり、HaCaT細胞株は、Keratin1(KRT1)、Keratin10(KRT10)、ロリクリン、およびfilaggrin20,21,22などの分化遺伝子産物を発現することができ、それにより、ケラチン化および炎症誘発性の調節を研究するための初代ケラチノサイトと同様の有望なツールを提供します。

KRT5/14は増殖性基底ケラチノサイトに発現する主要なI型-II型ケラチン対であるのに対し、基底上層の分化したケラチノサイトはKRT5/14をダウンレギュレートし、KRT1/10を主要なケラチン対として発現する23。乾癬病変と健康な皮膚との比較では、ケラチン発現の変化には、乾癬表皮におけるKRT1/10の減少24,25およびKRT5/14の増加が含まれ、これは過増殖および不全角化症27を特徴とする。ロリクリンは、角質化エンベロープの70%以上を含む最終分化構造タンパク質であり、角質層28の保護バリア機能に寄与し、乾癬患者29の皮膚でダウンレギュレーションされる。フィラグリンは、ケラチノサイト分化の最終段階で発現し、足場状の角質化エンベロープ30の凝集に関与し、乾癬病変皮膚29における発現の減少に関与している。

全体として、私たちの目標は、免疫応答の開始、ケラチノサイトの増殖、分化など、乾癬皮膚病変のいくつかの特徴を相乗的に再現できるサイトカインの組み合わせを使用して、HaCaT細胞に炎症性ケラチノサイトモデルを生成することでした。

プロトコル

手順1〜3は滅菌状態で行ってください。すべての培地には、0.1 mg / mLのペニシリンとストレプトマイシンが含まれていました。.

1. 細胞調製

  1. 10 mLのDulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)に10 mLのHaCaT細胞を播種し、100 mmの細胞培養皿に10%ウシ胎児血清(FBS)を添加します。培養皿を加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで2日間インキュベートします。
  2. 培養液が約80%のコンフルエントに達したら、培地を培養皿から慎重に取り出し、5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄します。手動で培養皿を静かに揺らします。
  3. PBSを取り出し、2mLの0.25%トリプシン-EDTA溶液を細胞に加えます。培養皿を静かに振って、溶液が細胞の単層を完全にコーティングします。
  4. 加湿した5% CO2 インキュベーターで細胞を37°Cで5分間インキュベートし、位相差顕微鏡で細胞が培養皿の表面から目に見える形で剥がれるまでインキュベートします。
    注:細胞の形態は丸く見えるはずです。細胞が十分に分離されていない場合は、手動で撹拌しながらさらに5分間インキュベートします。
  5. 細胞が剥離したら、5 mLのDMEMと10% FBSを加えてトリプシンを不活性化し、ピペットを使用して細胞懸濁液を50 mLの遠心チューブに回収します。
  6. 細胞懸濁液を含むチューブを180 x g で5分間遠心分離します。上清をデカントします。
  7. 10 mLのDMEMと10% FBS培地をペレットに加え、培地を静かに上下にピペットで動かして細胞を懸濁させます。

2. 6ウェルプレートでの細胞播種

  1. 6ウェル培養プレートに2.0 x 105 細胞/ウェルの密度で細胞を播種します。
  2. 6ウェル培養プレートを加湿した5% CO2 インキュベーターで37°Cでインキュベートし、M5コンビネーション刺激の前に一晩インキュベートし、細胞をプレートに接着させます。

3. HaCaT細胞のM5刺激

  1. 2% FBSを含むDMEMに、10 ng/mLの組換えIL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、およびオンコスタチンMタンパク質を含むM5サイトカインコンビネーションミックス培地を調製します。
    注:M5の組み合わせは、IL-17A、IL-22、IL-1α、TNF-α、およびオンコスタチンMの組換えで構成されていました。
  2. 細胞培養後、上清を取り除き、2 mLのM5混合培地を各ウェルにピペットで移します。
  3. 細胞の培養を続けます。細胞溶解物を24時間で収集してmRNA定量(ステップ4)、培養上清を48〜72時間で収集してELISAアッセイ32,33,34,35,36,37(ステップ6)でサイトカインレベルを測定しました。

4. M5刺激HaCaT細胞のmRNAを回収

  1. M5コンビネーションミックス培地を吸引し、1〜2mLの冷たいPBSで1回洗浄します。
  2. PBSを吸引し、市販のイソチオシアネートグアニジウム溶液1 mLを直接培養皿に加えて、細胞を溶解します。
  3. ライセートを数回上下にピペットで動かしてホモジナイズし、細胞ライセートを1.5 mLの微量遠心チューブに移します。室温で5分間放置します。
  4. 200 μLのクロロホルムを加え、チューブを約20秒間激しく振とうし、サンプルを室温で5分間インキュベートします。
  5. 12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  6. 水相を新しい1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。
  7. 水相に500μLのイソプロパノールを加え、穏やかに混合します。室温で5分間放置します。
  8. 10,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  9. イソプロパノールを吸引し、75%エタノール1mLを加えます。ペレットを一度洗います。
  10. 7,500 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 エタノールを注ぎ、ペレットを自然乾燥させます。
  11. 30 μL DEPC処理水をRNAペレットに加えます。RT-PCR検出の準備をします。

5. リアルタイムPCRによるmRNA発現の解析

  1. 1 μgの全RNAでcDNA合成は、製造元の指示に従って市販のキットを使用して行ってください。
    注:SYBR Green RT-PCRアッセイ用の全RNA1 μg。
  2. PCR反応混合物を調製します。12.5 μL の SYBR プレミックス EX Taq II、1 μL の PCR Forward Primer (10 μM)、1 μL の PCR Reverse Primer (10 μM)、2 μg の cDNA、および 8.5 μL の dH2O です。最終容量は反応あたり25μLです。
    注:この研究でRT-PCR分析に使用された遺伝子のプライマー配列のリストを 表1に示します。
  3. サーモサイクラーでインキュベートします。サイクル条件には、95°Cで30秒間の変性ステップ、95°Cで5秒間、60°Cで30秒間、72°Cで20秒間の40サイクル、および融解曲線分析が含まれていました。
  4. 2-ΔΔCT方程式を使用して Ct (閾値サイクル) 値からの遺伝子発現の相対的な差を計算することにより、RT-PCR 実験データを解析します。RT-PCRの相対定量的遺伝子発現標準化のための内部コントロールとしてβ-アクチンを使用してください。

6. ELISAのための細胞培養上清の採取

  1. 各細胞培養培地を1.5 mLの微量遠心チューブにピペットで移します。
  2. 1500 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
  3. 上清を分注し、すぐに-80°Cで保存します。

7. ELISAによるサイトカイン発現の解析

  1. 製造元の指示に従って、すべての試薬、作業標準、およびサンプルを調製します。2,000 から 2.74 pg/mL の範囲のサンプル希釈液を使用した標準試料の 3 倍段階希釈。サンプルをサンプル希釈液で1:2に希釈します。
  2. ウェルごとに100 μLの標準試料とサンプルを添加します。ウェルを蓋で覆い、プレートをパラフィンフィルムで密封します。室温で2.5時間インキュベートします。
  3. 2.5時間後、溶液を廃棄します。プレートの各ウェルに300 μLの洗浄バッファーを3分間加え、吸引します。このプロセスをさらに4回繰り返します。最後の洗浄後、プレートを反転させ、吸収紙をたたいて残りの液体を取り除きます。
  4. 各ウェルに100 μLの検出抗体溶液を添加します。プレートをシェーカーで37°Cで2時間インキュベートします。
    注:ビオチン化検出抗体溶液は、各ELISAキットに調製されています。
  5. プレートの各ウェルを吸引し、300 μLのWash bufferを使用して5回洗浄します。最後の洗浄後、プレートを裏返し、吸収紙をたたいて残りの液体を取り除きます。
  6. 各ウェルに100 μLのHRP-ストレプトアビジンコンジュゲートを添加します。室温で45分間、穏やかに振とうしながらインキュベートします。
  7. インキュベーション後にピペットで吸引して溶液を廃棄します。プレートの各ウェルを300 μLのWash bufferを使用して5回洗浄します。最後の洗浄後、プレートを反転させ、吸収紙を軽くたたいて残りの液体を取り除きます。
  8. 各ウェルに100 μLのTMB基質を添加して検出を行います。暗所で37°Cで30分間インキュベートします。
  9. 色が現色したら、50 μLの停止溶液を各ウェルに加えます。プレートを軽くたたいて、完全に混合します。すぐに450nmで読み取ります。

結果

M5併用刺激はHaCaT細胞の炎症反応を誘導した。
HaCaT細胞は、M5サイトカインの組み合わせの有無にかかわらず、免疫および炎症性ケモカインおよび抗菌ペプチドの調節に関与する乾癬関連遺伝子のmRNA発現を評価しました。好中球ケモカインCXCL138、CXCL239、CXCL840...

ディスカッション

本明細書に記載されるのは、5つのサイトカインの組み合わせ(IL−17A、IL−22、IL−1α、TNF−α、OSM)をHaCaT細胞株に用いて、転写レベルでin vitro乾癬様皮膚炎症プロファイルを確立する方法である。このプロトコルは、乾癬の病因における遺伝子のメカニズムに関する研究や、乾癬の治療薬のスクリーニングに適合させることができます。最近の報告では、IL-17AおよびIL22...

開示事項

著者らは、潜在的な利益相反を報告していない。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会[81703132、31271483、81472650、81673061、81573050、31872739、および81601462]の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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