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Resumen

En este trabajo se presenta un método para establecer un modelo inflamatorio cutáneo psoriasiforme in vitro a nivel de transcripción utilizando una combinación de cinco citocinas (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) en una línea celular HaCaT.

Resumen

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica común de la piel mediada por sistemas inmunitarios innatos y adaptativos, caracterizada por una proliferación y diferenciación anormales de queratinocitos epidérmicos e infiltración de células inflamatorias. Los queratinocitos específicos de la piel son participantes clave en la inmunidad innata, ya que responden a las células inmunitarias y a la estimulación ambiental, por lo que desempeñan un papel importante en la inmunopatogénesis de la psoriasis. Aquí, presentamos un método para inducir la inflamación de los queratinocitos psoriasiformes a nivel de transcripción con la línea celular HaCaT utilizando cinco combinaciones de citocinas proinflamatorias (combinación M5), que incluyen IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α y oncostatina M. Los resultados demuestran que las células HaCaT inducidas por la combinación de M5 mostraron niveles aumentados de péptidos antimicrobianos (BD2, S100A7, S100A8 y S100A9), quimiocinas y citocinas (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 e IL-18). Los niveles de ARNm de los marcadores de diferenciación de queratinocitos (queratina1, queratina10, filagrina y loricrina) estaban regulados a la baja, lo que era consistente con los datos del transcriptoma derivados de los queratinocitos similares a la psoriasis. El método aquí descrito, por lo tanto, establece una inflamación cutánea psoriasiforme in vitro a nivel de transcripción y contribuye a la investigación de la patogénesis molecular de la psoriasis.

Introducción

La psoriasis es una enfermedad inflamatoria crónica no contagiosa de la piel frecuente desencadenada por una respuesta inmunitaria desregulada, que afecta a los queratinocitos que forman predominantemente la epidermis1, caracterizada por una multiplicación anormalmente rápida de los queratinocitos con hiperqueratosis y paraqueratosis. La psoriasis afecta a alrededor del 3% de la población silvestre mundial2. La carga de enfermedad se incrementa aún más por varias comorbilidades, incluidas las enfermedades cardiovasculares y el síndrome metabólico causado por el síndrome3.

La epidermis está compuesta por cinco capas de queratinocitos y sufre cambios morfológicos con proceso de diferenciación: el estrato basal, el estrato espinoso, el estrato granuloso, el estrato lúcido (que se encuentra en las palmas de las manos y las plantas de los pies) y el estrato córneo descrito aquí desde la superficie interna hacia la externa4. El cambio en la diferenciación de la epidermis conduce a una barrera cutánea alterada, que es importante para la patogénesis de las enfermedades inflamatorias de la piel 5,6,7,8. Los queratinocitos desempeñan un papel vital en el mantenimiento de una barrera epidérmica intacta para evitar la pérdida de agua y contra los desencadenantes ambientales como la exposición a los rayos UVB, los alérgenos y los patógenos9. Los individuos sanos muestran un equilibrio entre la proliferación de células basales y la descamación del estrato córneo, mientras que múltiples enfermedades de la piel, incluida la psoriasis, se caracterizan por un desequilibrio de este complejo mecanismo10.

Además de formar la función de barrera, los queratinocitos también son un componente crítico del sistema inmunológico de la piel. En las inmunopatogenias de la psoriasis, la activación de las células T auxiliares de tipo 1 (Th1) y de las células T auxiliares de tipo 17 (Th17) residentes en la piel, conduce a una mayor producción de IFN-γ e IL-17A, respectivamente. Estas citocinas inducen un aumento de la síntesis de quimiocinas (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), péptidos antimicrobianos (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) y otros factores inflamatorios (TNF-α, IL-6, IFN-β) en los queratinocitos, lo que conduce al reclutamiento de más Th1, Th17 y neutrófilos en la piel, amplificando aún más el eje IL-17/IL2311. La diafonía entre los queratinocitos y las células inmunitarias es responsable de la inducción y mantenimiento de la psoriasis11.

Se han descrito redes complejas de citocinas en la psoriasis, y se ha destacado el papel central de las citocinas proinflamatorias (como IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, oncostatina M(OSM) y TNF-α) producidas por la infiltración de células inmunitarias12,13. De hecho, estudios previos han demostrado que el aumento de los niveles de IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α y OSM indujo un perfil de psoriasiforme en queratinocitos epidérmicos humanos normales in vitro14.

Las líneas celulares de queratinocitos inmortales (HaCaT), que se obtienen y cultivan más fácilmente que los queratinocitos primarios con mejor reproducibilidad, han sido ampliamente utilizadas para el estudio de la psoriasis 15,16,17,18,19,20. A diferencia de las células HEK001 y KerTr transformadas en el virus del papiloma humano16 E6/E7, la línea celular HaCaT es capaz de expresar productos génicos de diferenciación, como la queratina1 (KRT1), la queratina10 (KRT10), la loricrina y la filagrina 20,21,22, proporcionando así una herramienta prometedora similar a los queratinocitos primarios para estudiar la regulación de la queratinización y la proinflamación.

KRT5/14 es el principal par de queratina tipo I-tipo II expresado en los queratinocitos basales proliferativos, mientras que los queratinocitos diferenciados en las capas suprabasales regulan negativamente KRT5/14 y expresan KRT1/10 como el par principal de queratina23. Al comparar la lesión de psoriasis con la piel sana, los cambios en la expresión de queratina incluyeron disminuciones en KRT1/1024,25 y aumentos en KRT5/14 en la epidermis psoriásica26, caracterizada por hiperproliferación y paraqueratosis27. La loricrina es una proteína estructural diferenciadora terminal que comprende más del 70% de la envoltura córnea, contribuye a la función de barrera protectora del estrato córneo28, regulada a la baja en la piel de los pacientes con psoriasis29. La filagrina se expresa en las etapas finales de la diferenciación de los queratinocitos y está involucrada en la agregación de una envoltura córnea en forma de andamio30, disminución de la expresión en la piel de la lesión de psoriasis29.

En general, nuestro objetivo fue generar un modelo de queratinocitos inflamatorios en células HaCaT utilizando una combinación de citoquinas que pueda recapitular sinérgicamente algunas características de las lesiones cutáneas de la psoriasis, incluido el inicio de una respuesta inmune, la proliferación y diferenciación de queratinocitos.

Protocolo

Realice los pasos 1 a 3 en condiciones estériles. Todos los medios de cultivo contenían 0,1 mg/mL de penicilina y estreptomicina.

1. Preparación de la célula

  1. Siembre 1 x 106 células HaCaT en 10 mL de Medio Eagle Modificado (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) en una placa de cultivo celular de 100 mm. Incubar la placa de cultivo a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% deCO2 durante 2 días.
  2. Cuando el cultivo alcance alrededor del 80% de confluencia, retire con cuidado el medio de la placa de cultivo y lave las células con 5 mL de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 1x. Meca suavemente el plato de cultivo manualmente.
  3. Retire el PBS y añada 2 ml de solución de tripsina-EDTA al 0,25% a las células. Agite suavemente la placa de cultivo para que la solución cubra completamente la monocapa de células.
  4. Incubar las células a 37 °C en una incubadora humidificada con 5% de CO2 durante 5 min hasta que las células se desprendan visiblemente de la superficie de la placa de cultivo bajo microscopía de contraste de fase.
    NOTA: La morfología de las células debe aparecer redonda. Si las celdas no están bien separadas, incubar durante un período adicional de 5 minutos junto con agitación manual.
  5. Una vez separadas las células, se añadan 5 mL de DMEM más un 10% de FBS para inactivar la tripsina y se recoge la suspensión celular en un tubo de centrífuga de 50 mL con una pipeta.
  6. Centrifugar el tubo que contiene la suspensión celular a 180 x g durante 5 min. Decantar el sobrenadante.
  7. Agregue 10 ml de DMEM más un 10% de medio FBS al pellet y pipetee suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo para poner las células en suspensión.

2. Siembra de células en la placa de 6 pocillos

  1. Siembre las células a una densidad de 2,0 x 105 células/pocillo en una placa de cultivo de 6 pocillos.
  2. Incubar la placa de cultivo de 6 pocillos a 37 °C en una incubadora humidificada deCO2 al 5% durante la noche antes de la estimulación combinada M5 para permitir que las células se adhieran a la placa.

3. Estimulación M5 de las células HaCaT

  1. Prepare un medio de mezcla combinado de citocinas M5 que contenga 10 ng/mL de IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α recombinantes y proteína M de oncostatina en DMEM que contenga 2% de FBS.
    NOTA: La combinación de M5 consistió en la recombinación de IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α y oncostatina M. La acción sinérgica de la combinación de M5 recapitula algunas características de la psoriasis, como la regulación positiva de las quimiocinas y la producción de péptidos antimicrobianos31.
  2. Después del cultivo celular durante la noche, retire el sobrenadante y pipetee 2 mL de medio de mezcla combinado M5 en cada pocillo.
  3. Continuar cultivando las células; Los lisados celulares se recolectaron a las 24 h para la cuantificación del ARNm (paso 4) o el sobrenadante de cultivo se recolectó a las 48-72 h para la determinación de los niveles de citocinas mediante el ensayo ELISA 32,33,34,35,36,37 (paso 6).

4. Cosecha ARNm de células HaCaT estimuladas con M5

  1. Aspire el medio de mezcla combinado M5 y lave una vez con 1-2 mL de PBS frío.
  2. Aspire PBS y agregue 1 mL de solución de isotiocianato de guanidio disponible comercialmente directamente a la placa de cultivo para lisar las células.
  3. Pipetear el lisado hacia arriba y hacia abajo varias veces para homogeneizar y transferir el lisado celular a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Dejar a temperatura ambiente durante 5 min.
  4. Añadir 200 μL de cloroformo, agitar el tubo enérgicamente durante unos 20 s e incubar la muestra durante 5 min a temperatura ambiente.
  5. Centrifugar a 12.000 x g durante 10 min a 4 °C.
  6. Transfiera la fase acuosa a un tubo de microcentrífuga nuevo de 1,5 mL.
  7. Añadir 500 μL de isopropanol a la fase acuosa y mezclar suavemente. Dejar a temperatura ambiente durante 5 min.
  8. Centrifugar a 10.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  9. Aspire isopropanol y agregue 1 mL de etanol al 75%. Lave el pellet una vez.
  10. Centrifugar a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C. Vierta el etanol y deje que los gránulos se sequen al aire.
  11. Agregue 30 μL de agua tratada con DEPC al pellet de ARN. Prepárese para la detección de RT-PCR.

5. Análisis de la expresión de ARNm por PCR en tiempo real

  1. Realice la síntesis de ADNc con 1 μg de ARN total utilizando un kit disponible en el mercado siguiendo las instrucciones del fabricante.
    NOTA: 1 μg de ARN total para el ensayo SYBR Green RT-PCR.
  2. Prepare la mezcla de reacción PCR. 12,5 μL de premezcla SYBR EX Taq II, 1 μL de cebador directo de PCR (10 μM), 1 μL de cebador inverso de PCR (10 μM), 2 μg de ADNc y 8,5 μL de dH2O. El volumen final es de 25 μL por reacción.
    NOTA: En la Tabla 1 se muestra la lista de secuencias de cebadores de genes utilizadas para el análisis de RT-PCR en este estudio.
  3. Incubar en termociclador. Las condiciones de ciclo incluyeron una etapa de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, 40 ciclos de 95 °C durante 5 s, 60 °C durante 30 s, 72 °C durante 20 s y un análisis de la curva de fusión.
  4. Analice los datos del experimento RT-PCR calculando las diferencias relativas en la expresión génica con respecto a los valores de Ct (ciclo umbral) utilizando ecuaciones de 2-ΔΔCT. Utilice la β-actina como control interno para la estandarización de la expresión génica cuantitativa relativa de RT-PCR.

6. Recolección de sobrenadante de cultivo celular para ELISA

  1. Pipetear cada medio de cultivo celular en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
  2. Centrifugar a 1500 x g durante 10 min a 4 °C.
  3. Alicuone el sobrenadante y almacene a -80 °C inmediatamente.

7. Análisis de la expresión de citoquinas por ELISA

  1. Siga las instrucciones del fabricante para preparar todos los reactivos, el estándar de trabajo y las muestras. Una dilución en serie triple del patrón con diluyente de muestra que oscila entre 2.000 y 2,74 pg/mL. Diluir las muestras 1:2 con el diluyente de la muestra.
  2. Añadir 100 μL de patrón y muestra por pocillo. Cubra los pocillos con una tapa y selle la placa con una película de parafina. Incubar durante 2,5 h a temperatura ambiente.
  3. Después de 2,5 h, deseche la solución. Añadir 300 μL de tampón de lavado a cada pocillo de la placa durante 3 min y aspirar. Repita el proceso cuatro veces más. Después del último lavado, invierta la placa y golpee el papel absorbente para eliminar el líquido restante.
  4. Añada 100 μL de la solución de anticuerpos de detección a cada pocillo. Incubar la placa en un agitador durante 2 h a 37 °C.
    NOTA: La solución de anticuerpos de detección biotinilada se prepara en cada kit ELISA.
  5. Aspire y lave cada pocillo de la placa cinco veces con 300 μL de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y golpee el papel absorbente para eliminar el líquido restante.
  6. Agregue 100 μL de conjugado HRP-estreptavidina a cada pocillo. Incubar durante 45 min a temperatura ambiente con una suave agitación.
  7. Deseche la solución aspirando con una pipeta después de la incubación. Lave cada pocillo de la placa cinco veces con 300 μL de tampón de lavado. Después del último lavado, invierta la placa y golpee el papel absorbente para eliminar el líquido restante.
  8. Realice la detección añadiendo 100 μL de sustrato TMB a cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a 37 °C en la oscuridad.
  9. Agregue 50 μL de solución de parada, cuando se desarrolle el color, a cada pocillo. Golpee suavemente la placa para asegurar una mezcla completa. Lea a 450 nm inmediatamente.

Resultados

La estimulación combinada de M5 indujo la respuesta inflamatoria de las células HaCaT.
Las células HaCaT se estimularon con o sin combinación de citocinas M5 durante 24 h. Se evaluó la expresión de ARNm de genes relacionados con la psoriasis, que están involucrados en la regulación de las quimiocinas inmunes e inflamatorias y los péptidos antimicrobianos. Las quimiocinas de neutrófilos CXCL138...

Discusión

En este trabajo se describe un método que utiliza la combinación de cinco citocinas (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) en una línea celular HaCaT para establecer un perfil de inflamación cutánea psoriasiforme in vitro a nivel de transcripción. Este protocolo se puede adaptar para el estudio del mecanismo de los genes en la patogénesis de la psoriasis, así como para el cribado de fármacos terapéuticos para la psoriasis. Informes recientes han demostrado que la sobreexpresión ...

Divulgaciones

Los autores no informaron de ningún posible conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 y 81601462]

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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