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Resumo

Este trabalho apresenta um método de estabelecimento de um modelo inflamatório cutâneo psoriasiforme in vitro no nível de transcrição usando uma combinação de cinco citocinas (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) na linhagem HaCaT.

Resumo

A psoríase é uma doença inflamatória crônica comum da pele mediada pelo sistema imunológico inato e adaptativo, caracterizada por proliferação e diferenciação anormal de queratinócitos epidérmicos e infiltração de células inflamatórias. Os queratinócitos específicos da pele são os principais participantes da imunidade inata, respondendo às células imunes e à estimulação ambiental, desempenhando assim um papel importante na imunopatogênese da psoríase. Aqui, apresentamos um método para induzir a inflamação de queratinócitos psoriasiformes em nível de transcrição com a linhagem celular HaCaT usando cinco combinações de citocinas pró-inflamatórias (combinação M5), incluindo IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e oncostatina M. Os resultados demonstram que as células HaCaT induzidas pela combinação M5 mostraram níveis aumentados de peptídeos antimicrobianos (BD2, S100A7, S100A8 e S100A9), quimiocinas e citocinas (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 e IL-18). Os níveis de mRNA dos marcadores de diferenciação de queratinócitos (queratina1, queratina10, filagrina e loricrina) foram regulados negativamente, o que foi consistente com os dados do transcriptoma derivados de queratinócitos semelhantes à psoríase. O método aqui descrito, portanto, estabelece uma inflamação cutânea psoriasiforme in vitro em nível de transcrição e contribui para a pesquisa da patogênese molecular da psoríase.

Introdução

A psoríase é uma doença inflamatória crônica comum da pele, não contagiosa, desencadeada por uma resposta imune desregulada, que afeta os queratinócitos que formam predominantemente a epiderme1, caracterizada por multiplicação anormalmente rápida de queratinócitos com hiperqueratose e paraceratose. A psoríase afeta cerca de 3% da população selvagem mundial2. A carga de doenças é aumentada por várias comorbidades, incluindo doenças cardiovasculares e síndrome metabólica causada pela síndrome3.

A epiderme é composta por cinco camadas de queratinócitos e sofre alterações morfológicas com o processo de diferenciação: estrato basal, estrato espinhoso, estrato granuloso, estrato lúcido (encontrado nas palmas das mãos e solas dos pés) e estrato córneo aqui descritos da superfície interna para externa4. A alteração na diferenciação da epiderme leva a uma barreira cutânea perturbada, o que é importante para a patogênese das doenças inflamatórias da pele 5,6,7,8. Os queratinócitos desempenham um papel vital na manutenção de uma barreira epidérmica intacta para evitar a perda de água e contra gatilhos ambientais, como exposição a UVB, alérgenos e patógenos9. Indivíduos saudáveis apresentam um equilíbrio entre a proliferação de células basais e a descamação do estrato córneo, enquanto múltiplas doenças de pele, incluindo a psoríase, são caracterizadas por um desequilíbrio desse complexo mecanismo10.

Além de formar a função de barreira, os queratinócitos também são um componente crítico do sistema imunológico da pele. Nas imunopatogêneses da psoríase, a ativação de células T auxiliares do tipo 1 residentes na pele (Th1) e células T auxiliares do tipo 17 (Th17) leva ao aumento da produção de IFN-γ e IL-17A, respectivamente. Essas citocinas induzem aumento da síntese de quimiocinas (CCL20, CXCL1/2/8/9/10/11), peptídeos antimicrobianos (BD2, LL37, S100A7/8/9/12) e outros fatores inflamatórios (TNF-α, IL-6, IFN-β) nos queratinócitos, levando ao recrutamento de mais Th1, Th17 e neutrófilos na pele, amplificando ainda mais o eixo IL-17/IL2311. O crosstalk entre queratinócitos e células imunes é responsável pela indução e manutenção da psoríase11.

Redes complexas de citocinas têm sido descritas na psoríase, e o papel central de citocinas pró-inflamatórias (como IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, oncostatina M(OSM) e TNF-α) produzidas por infiltração de células imunes tem sido destacado12,13. De fato, estudos anteriores mostraram que níveis aumentados de IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e OSM induziram um perfil de psoriasiforme em queratinócitos epidérmicos humanos normais in vitro14.

Linhagens celulares de queratinócitos imortais (HaCaT), que são mais facilmente obtidas e cultivadas do que os queratinócitos primários com melhor reprodutibilidade, têm sido amplamente utilizadas para o estudo da psoríase 15,16,17,18,19,20. Diferente das células HEK001 e KerTr transformadas pelo papilomavírus humano16 E6/E7, a linhagem HaCaT é capaz de expressar produtos gênicos de diferenciação, incluindo queratina1 (KRT1), queratina10 (KRT10), Loricirina e filagrina 20,21,22, fornecendo assim uma ferramenta promissora semelhante aos queratinócitos primários para estudar a regulação da queratinização e pró-inflamação.

KRT5/14 é o principal par de queratina tipo I-tipo II expresso em queratinócitos basais proliferativos, enquanto queratinócitos diferenciados nas camadas suprabasais regulam negativamente KRT5/14 e expressam KRT1/10 como o principal par de queratina23. Ao comparar a lesão da psoríase com a pele sadia, as alterações na expressão de queratina incluíram diminuição do KRT1/1024,25 e aumento do KRT5/14 na epiderme psoriásica26, caracterizada por hiperproliferação e paraceratose27. A loricrina é uma proteína estrutural de diferenciação terminal que compreende mais de 70% do envelope cornificado, contribui para a função de barreira protetora do estrato córneo28, regulada negativamente na pele de pacientes com psoríase29. A filagrina é expressa nos estágios finais da diferenciação dos queratinócitos e está envolvida na agregação de um envelope cornificado semelhante a um andaime30, diminuição da expressão na pele da lesão de psoríase29.

No geral, nosso objetivo foi gerar um modelo de queratinócitos inflamatórios em células HaCaT usando uma combinação de citocinas que será capaz de recapitular sinergicamente algumas características das lesões cutâneas da psoríase, incluindo o início de uma resposta imune, proliferação e diferenciação de queratinócitos.

Protocolo

Execute as etapas 1 a 3 em condições estéreis. Todo o meio de cultura continha 0,1 mg/mL de penicilina e estreptomicina.

1. Preparação celular

  1. Semear 1 x 106 células HaCaT em 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) em placa de cultura de células de 100 mm. Incubar a placa de cultura a 37 °C numa incubadora humidificada de CO5 2 durante 2 dias.
  2. Quando a cultura atingir cerca de 80% de confluência, remova cuidadosamente o meio da placa de cultura e lave as células com 5 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS). Balance suavemente o prato de cultura manualmente.
  3. Remova o PBS e adicione 2 mL de solução de tripsina-EDTA a 0,25% às células. Agite suavemente a placa de cultura para que a solução cubra completamente a monocamada de células.
  4. Incubar as células a 37 °C numa incubadora de CO2 a 5% humidificada durante 5 minutos até que as células estejam visivelmente separadas da superfície da placa de cultura sob microscopia de contraste de fase.
    NOTA: A morfologia das células deve parecer redonda. Se as células não estiverem bem destacadas, incubar por um período adicional de 5 min junto com agitação manual.
  5. Uma vez que as células estejam separadas, adicione 5 mL de DMEM mais 10% de FBS para inativar a tripsina e colete a suspensão celular em um tubo de centrífuga de 50 mL usando uma pipeta.
  6. Centrifugue o tubo contendo a suspensão celular a 180 x g por 5 min. Decantar o sobrenadante.
  7. Adicione 10 mL de DMEM mais 10% de meio FBS ao pellet e pipete suavemente o meio para cima e para baixo para colocar as células em suspensão.

2. Semeadura celular na placa de 6 poços

  1. Semeie as células a uma densidade de 2,0 x 105 células/poço em placa de cultura de 6 poços.
  2. Incube a placa de cultura de 6 poços a 37 °C em uma incubadora umidificada de CO5 2 durante a noite antes da estimulação combinada M5 para permitir que as células adiram à placa.

3. Estimulação M5 de células HaCaT

  1. Prepare o meio de mistura de combinação de citocinas M5 contendo 10 ng/mL de IL-17A recombinante, IL-22, IL-1α, TNF-α e proteína M oncostatina M em DMEM contendo 2% de FBS.
    NOTA: A combinação M5 consistiu na recombinação de IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α e oncostatina M. A ação sinérgica da combinação M5 recapitula algumas características da psoríase, como regulação positiva de quimiocinas e produção de peptídeos antimicrobianos31.
  2. Após a cultura de células durante a noite, remova o sobrenadante e pipete 2 mL de meio de mistura combinada M5 em cada poço.
  3. Continue cultivando as células; lisados celulares foram coletados em 24 h para quantificação de mRNA (etapa 4) ou sobrenadante de cultura foram coletados em 48-72 h para a determinação dos níveis de citocinas pelo ensaio ELISA 32,33,34,35,36,37 (etapa 6).

4. Colheita de mRNA de células HaCaT estimuladas por M5

  1. Aspire o meio da mistura combinada M5 e lave uma vez com 1-2 mL de PBS frio.
  2. Aspire PBS e adicione 1 mL de solução de isotiocianato de guanídio disponível comercialmente diretamente na placa de cultura para lisar as células.
  3. Pipetar o lisado para cima e para baixo várias vezes para homogeneizar e transferir o lisado celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Deixe em temperatura ambiente por 5 min.
  4. Adicionar 200 μL de clorofórmio, agitar vigorosamente o tubo durante cerca de 20 s e incubar a amostra durante 5 minutos à temperatura ambiente.
  5. Centrifugue a 12.000 x g por 10 min a 4 °C.
  6. Transferir a fase aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  7. Adicione 500 μL de isopropanol à fase aquosa e misture suavemente. Deixe em temperatura ambiente por 5 min.
  8. Centrifugue a 10.000 x g por 15 min a 4 °C.
  9. Aspire isopropanol e adicione 1 mL de etanol a 75%. Lave o pellet uma vez.
  10. Centrifugue a 7.500 x g por 5 min a 4 °C. Despeje o etanol e deixe os pellets secarem ao ar.
  11. Adicione 30 μL de água tratada com DEPC ao pellet de RNA. Prepare-se para a detecção de RT-PCR.

5. Análise da expressão de mRNA por PCR em tempo real

  1. Realize a síntese de cDNA com 1 μg de RNA total usando um kit disponível comercialmente seguindo as instruções do fabricante.
    NOTA: 1 μg de RNA total para o ensaio SYBR Green RT-PCR.
  2. Preparar a mistura de reacção PCR. 12,5 μL de pré-mistura SYBR EX Taq II, 1 μL de PCR Forward Primer (10 μM), 1 μL de PCR Reverse Primer (10 μM), 2 μg de cDNA e 8,5 μL de dH2O. O volume final é de 25 μL por reação.
    NOTA: A lista de sequências de primers de genes usados para análise de RT-PCR neste estudo é mostrada na Tabela 1.
  3. Incubar em termociclador. As condições de ciclagem incluíram uma etapa de desnaturação a 95 °C por 30 s, 40 ciclos de 95 °C por 5 s, 60 °C por 30 s, 72 °C por 20s e uma análise da curva de fusão.
  4. Analise os dados do experimento de RT-PCR calculando as diferenças relativas na expressão gênica dos valores de Ct (ciclo limiar) usando equações 2-ΔΔCT. Use β-actina como um controle interno para a padronização da expressão gênica quantitativa relativa por RT-PCR.

6. Colheita do sobrenadante de cultura celular para ELISA

  1. Pipetar cada meio de cultura celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  2. Centrifugue a 1500 x g por 10 min a 4 °C.
  3. Aliquotar o sobrenadante e conservar imediatamente a -80 °C.

7. Análise da expressão de citocinas por ELISA

  1. Siga as instruções do fabricante para preparar todos os reagentes, padrão de trabalho e amostras. Uma diluição serial tripla do padrão com diluente de amostra variando de 2.000 a 2,74 pg/mL. Diluir as amostras 1:2 com o diluente da amostra.
  2. Adicione 100 μL de padrão e amostra por poço. Cubra os poços com a tampa e sele a placa com filme de parafina. Incubar durante 2,5 h à temperatura ambiente.
  3. Após 2,5 h, descarte a solução. Adicione 300 μL de tampão de lavagem a cada poço da placa por 3 min e aspire. Repita o processo por mais quatro vezes. Após a última lavagem, inverta a placa e bata no papel absorvente para remover o líquido restante.
  4. Adicione 100 μL da solução de anticorpos de detecção a cada poço. Incubar a placa num shaker durante 2 h a 37 °C.
    NOTA: A solução de anticorpos de detecção biotinilada é preparada em cada kit ELISA.
  5. Aspire e lave cada poço da placa cinco vezes usando 300 μL de tampão de lavagem. Após a última lavagem, inverta a placa e bata no papel absorvente para remover o líquido restante.
  6. Adicione 100 μL de conjugado HRP-estreptavidina a cada poço. Incubar durante 45 min à temperatura ambiente com agitação suave.
  7. Rejeitar a solução por aspiração com uma pipeta após a incubação. Lave cada poço da placa cinco vezes usando 300 μL de tampão de lavagem. Após a última lavagem, inverta a placa e bata no papel absorvente para remover o líquido restante.
  8. Realize a detecção adicionando 100 μL de substrato TMB a cada poço. Incubar durante 30 min a 37 °C no escuro.
  9. Adicione 50 μL de solução de parada, quando a cor se desenvolver, a cada poço. Bata suavemente no prato para garantir uma mistura completa. Leia a 450 nm imediatamente.

Resultados

A estimulação da combinação M5 induziu a resposta inflamatória das células HaCaT.
As células HaCaT foram estimuladas com ou sem combinação de citocinas M5 por 24 h. A expressão de mRNA de genes relacionados à psoríase, que estão envolvidos na regulação das quimiocinas imunes e inflamatórias e peptídeos antimicrobianos, foi avaliada. As quimiocinas de neutrófilos CXCL138, CXCL2...

Discussão

Aqui descrito é um método que usa cinco combinações de citocinas (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) na linhagem celular HaCaT para estabelecer um perfil de inflamação cutânea psoriasiforme in vitro no nível de transcrição. Este protocolo pode ser adaptado para o estudo do mecanismo dos genes na patogênese da psoríase, bem como para a triagem de drogas terapêuticas para a psoríase. Relatos recentes têm mostrado que a superexpressão de células T CD8 produtoras de IL-17A ...

Divulgações

Nenhum potencial conflito de interesse foi relatado pelos autores.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 e 81601462]

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

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