JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu makale, HaCaT hücre hattı üzerinde beş sitokin (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) kombinasyonu kullanılarak transkripsiyon düzeyinde in vitro psoriasiform kutanöz inflamatuar model oluşturma yöntemini sunmaktadır.

Özet

Psoriasis, epidermal keratinositlerin anormal proliferasyonu ve farklılaşması ve inflamatuar hücrelerin infiltrasyonu ile karakterize, doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık sistemlerinin aracılık ettiği yaygın bir kronik inflamatuar deri hastalığıdır. Deriye özgü keratinositler, doğuştan gelen bağışıklıkta, bağışıklık hücrelerine ve çevresel stimülasyona yanıt veren anahtar katılımcılardır ve bu nedenle sedef hastalığının immünopatogenezinde önemli bir rol oynarlar. Burada, IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ve oncostatin M dahil olmak üzere beş proinflamatuar sitokin kombinasyonu (M5 kombinasyonu) kullanarak HaCaT hücre hattı ile transkripsiyon düzeyinde psoriasiform keratinosit inflamasyonunu indüklemek için bir yöntem sunuyoruz. Sonuçlar, M5 kombinasyonunun indüklediği HaCaT hücrelerinin artmış antimikrobiyal peptit seviyeleri (BD2, S100A7, S100A8 ve S100A9), kemokin ve sitokinler (CXCL1, CXCL2, CXCL8, CCL20, IL-1β, IL-6 ve IL-18). Keratinosit farklılaşma belirteçlerinin (Keratin1, Keratin10, Filaggrin ve Loricrin) mRNA seviyeleri, sedef hastalığı benzeri keratinositlerden türetilen transkriptom verileriyle tutarlı olarak aşağı regüle edildi. Bu nedenle, burada tarif edilen yöntem, transkripsiyon düzeyinde bir in vitro psoriasiform kutanöz inflamasyon oluşturur ve psoriazisin moleküler patogenezi araştırmalarına katkıda bulunur.

Giriş

Sedef hastalığı, ağırlıklı olarak epidermisi1 oluşturan keratinositleri etkileyen, hiperkeratoz ve parakeratoz ile keratinositlerin anormal derecede hızlı çoğalması ile karakterize, düzensiz bir bağışıklık tepkisi tarafından tetiklenen, bulaşıcı olmayan yaygın bir kronik inflamatuar cilt hastalığıdır. Sedef hastalığı, dünyadaki vahşi nüfusun yaklaşık% 3'ünü etkiler2. Sendromun neden olduğu kardiyovasküler hastalıklar ve metabolik sendrom dahil olmak üzere çeşitli komorbiditeler hastalık yükü daha da artmaktadır3.

Epidermis, beş keratinosit katmanından oluşur ve farklılaşma süreci ile morfolojik değişime uğrar: stratum bazal, stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum (avuç içi ve ayak tabanlarında bulunur) ve burada iç yüzeyden dış yüzeye4 tarif edilen stratum corneum. Epidermis farklılaşmasındaki değişiklik, cilt enflamatuar hastalıklarının patogenezi için önemli olan bozulmuş bir cilt bariyerine yol açar 5,6,7,8. Keratinositler, su kaybını önlemek ve UVB maruziyeti, alerjenler ve patojenler gibi çevresel tetikleyicilere karşı sağlam bir epidermal bariyerin korunmasında hayati bir rol oynar9. Sağlıklı bireyler bazal hücrelerin proliferasyonu ile stratum corneum deskuamasyonu arasında bir denge gösterirken, sedef hastalığı da dahil olmak üzere birçok cilt hastalığı bu karmaşık mekanizmanın dengesizlikleri ile karakterizedir10.

Bariyer işlevi oluşturmanın yanı sıra, keratinositler aynı zamanda cildin bağışıklık sisteminin kritik bir bileşenidir. Sedef hastalığının immünopatojenezlerinde, ciltte yerleşik Tip 1 yardımcı T hücrelerinin (Th1) ve Tip 17 yardımcı T hücrelerinin (Th17) aktivasyonu, sırasıyla IFN-γ ve IL-17A üretiminin artmasına neden olur. Bu sitokinler, kemokinlerin (CCL20, CXCL1 / 2/8/9/10/11), antimikrobiyal peptitlerin (BD2, LL37, S100A7 / 8/9/12) ve diğer enflamatuar faktörlerin (TNF-α, IL-6, IFN-β) artan sentezini indükler, bu da cilde daha fazla Th1, Th17 ve nötrofil alımına yol açar ve IL-17 / IL23 ekseni11'i daha da yükseltir. Keratinositler ve bağışıklık hücreleri arasındaki karışma, sedefhastalığı 11'in indüksiyonu ve bakımından sorumludur.

Sedef hastalığında kompleks sitokin ağları tanımlanmış ve immün hücre infiltrasyonu ile üretilen proinflamatuar sitokinlerin (IL-23, IL-22, IL-17, IL-1α, oncostatin M (OSM) ve TNF-α gibi) merkezi rolü vurgulanmıştır12,13. Gerçekten de, önceki çalışmalar, IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ve OSM seviyelerinin artmasının, in vitro14'te normal insan epidermal keratinositlerinde bir sedef hastalığı profili oluşturduğunu göstermiştir.

Primer keratinositlerden daha kolay elde edilen ve daha iyi tekrarlanabilirliğe sahip olan ölümsüz keratinosit hücre hatları (HaCaT), psoriasis 15,16,17,18,19,20 çalışmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsan papilloma virüsü16 E6 / E7 dönüştürülmüş HEK001 ve KerTr hücrelerinden farklı olarak, HaCaT hücre hattı, Keratin1 (KRT1), Keratin10 (KRT10), Loricrin ve filagrin 20,21,22 dahil olmak üzere farklılaşma gen ürünlerini eksprese edebilir, böylece keratinizasyon ve proinflamatuarın düzenlenmesini incelemek için birincil keratinositlere benzer umut verici bir araç sağlar.

KRT5/14, proliferatif bazal keratinositlerde eksprese edilen majör tip I-tip II keratin çifti iken, suprabazal tabakalardaki farklılaşmış keratinositler KRT5/14'ü aşağı regüle eder ve KRT1/10'u majör keratin çifti olarak eksprese eder23. Sedef hastalığı lezyonunun sağlıklı cilt ile karşılaştırılması üzerine, keratin ekspresyonundaki değişiklikler, hiperproliferasyon ve parakeratoz27 ile karakterize psoriatik epidermiste26 KRT1/10 24,25'te azalma ve KRT5/14'te artışları içeriyordu. Lorisrin, kornifiye zarfın %70'inden fazlasını içeren terminal olarak farklılaşan yapısal bir proteindir, sedef hastalığı hastalarının29 cildinde aşağı doğru düzenlenen stratum corneum28'in koruyucu bariyer fonksiyonuna katkıda bulunur. Filaggrin, keratinosit farklılaşmasının son aşamalarında eksprese edilir ve iskele benzeri kornifiye bir zarfın(30) agregasyonunda rol oynar, sedef hastalığı lezyonu cildinde29 ekspresyon azalır.

Genel olarak amacımız, bir immün yanıt başlatma, keratinositlerin çoğalması ve farklılaşması dahil olmak üzere psoriasis cilt lezyonlarının bazı özelliklerini sinerjik olarak özetleyebilecek bir sitokin kombinasyonu kullanarak HaCaT hücrelerinde inflamatuar keratinositler modeli oluşturmaktı.

Protokol

Steril koşullar altında 1'den 3'e kadar olan adımları gerçekleştirin. Tüm kültür ortamı 0.1 mg / mL penisilin ve streptomisin içeriyordu.

1. Hücre hazırlığı

  1. 100 mm'lik hücre kültürü kabında %10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş 10 mL Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unda (DMEM) 1 x10 6 HaCaT hücresi tohumlayın. Kültür kabını 37 °C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 2 gün boyunca inkübe edin.
  2. Kültür yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştığında, ortamı kültür kabından dikkatlice çıkarın ve hücreleri 5 mL 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın. Kültür kabını manuel olarak hafifçe sallayın.
  3. PBS'yi çıkarın ve hücrelere 2 mL% 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin. Çözeltinin hücrelerin tek tabakasını tamamen kaplamasını sağlamak için kültür kabını hafifçe sallayın.
  4. Hücreleri 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 5 dakika boyunca, hücreler faz kontrast mikroskobu altında kültür kabının yüzeyinden gözle görülür şekilde ayrılana kadar inkübe edin.
    NOT: Hücrelerin morfolojisi yuvarlak görünmelidir. Hücreler iyi ayrılmamışsa, manuel çalkalama ile birlikte 5 dakikalık ek bir süre inkübe edin.
  5. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsini inaktive etmek için 5 mL DMEM artı% 10 FBS ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
  6. Hücre süspansiyonu içeren tüpü 180 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı boşaltın.
  7. Peletin içine 10 mL DMEM artı %10 FBS ortamı ekleyin ve hücreleri süspansiyona getirmek için ortamı hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin.

2. 6 oyuklu plakada hücre tohumlaması

  1. Hücreleri 6 oyuklu kültür plakasında 2.0 x 105 hücre / kuyu yoğunluğunda tohumlayın.
  2. Hücrelerin plakaya yapışmasını sağlamak için M5 kombinasyon stimülasyonundan önce gece boyunca nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatörde 6 oyuklu kültür plakasını 37 ° C'de inkübe edin.

3. HaCaT hücrelerinin M5 stimülasyonu

  1. % 2 FBS içeren DMEM'de 10 ng / mL rekombinant IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ve onkostatin M proteini içeren M5 sitokin kombinasyon karışım ortamını hazırlayın.
    NOT: M5 kombinasyonu, IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α ve oncostatin M'nin rekombinasyonundan oluşuyordu. M5 kombinasyonunun sinerjik etkisi, kemokinlerin yukarı regülasyonu ve antimikrobiyal peptit üretimi gibi sedef hastalığının bazı özelliklerini özetler31.
  2. Gece boyunca hücre kültüründen sonra, süpernatanı çıkarın ve her bir oyuğa 2 mL M5 kombinasyon karışım ortamını pipetleyin.
  3. Hücreleri kültürlemeye devam edin; hücre lizatları, mRNA kantitasyonu için 24 saatte toplandı (adım 4) veya kültür süpernatanı, ELISA testi 32,33,34,35,36,37 (adım 6) ile sitokin seviyelerinin belirlenmesi için 48-72 saatte toplandı.

4. M5 ile uyarılmış HaCaT hücrelerinin mRNA'sını hasat edin

  1. M5 kombinasyonunu aspire edin, ortamı karıştırın ve 1-2 mL soğuk PBS ile bir kez yıkayın.
  2. PBS'yi aspire edin ve hücreleri parçalamak için ticari olarak temin edilebilen 1 mL guanidyum İzotiyosiyanat çözeltisini doğrudan kültür kabına ekleyin.
  3. Hücre lizatını homojenize etmek ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için lizatı birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin. 5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  4. 200 μL kloroform ekleyin, tüpü yaklaşık 20 saniye kuvvetlice çalkalayın ve numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  5. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 12.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Sulu fazı 1.5 mL'lik taze bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. Sulu faza 500 μL izopropanol ekleyin ve hafifçe karıştırın. 5 dakika oda sıcaklığında bırakın.
  8. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
  9. İzopropanolü aspire edin ve 1 mL %75 etanol ekleyin. Peleti bir kez yıkayın.
  10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 7.500 x g'da santrifüjleyin. Etanolü dökün ve peletlerin kurumasını bekleyin.
  11. RNA peletine 30 μL DEPC ile arıtılmış su ekleyin. RT-PCR tespiti için hazırlanın.

5. Gerçek Zamanlı PCR ile mRNA ekspresyonunun analizi

  1. Üreticinin talimatına uygun olarak piyasada bulunan bir kit kullanarak 1 μg toplam RNA ile cDNA sentezi gerçekleştirin.
    NOT: SYBR Green RT-PCR testi için 1 μg toplam RNA.
  2. PCR reaksiyon karışımını hazırlayın. 12.5 μL SYBR premiks EX Taq II, 1μL PCR Forward Primer (10 μM), 1 μL PCR Ters Primer (10 μM), 2 μg cDNA ve 8.5 μL dH2O. Son hacim reaksiyon başına 25 μL'dir.
    NOT: Bu çalışmada RT-PCR analizi için kullanılan genlerin primer dizilerinin listesi Tablo 1'de gösterilmektedir.
  3. Termocycler'da inkübe edin. Döngü koşulları, 30 saniye boyunca 95 ° C'de bir denatüre etme adımını, 5 saniye boyunca 95 ° C'de 40 döngü, 30 saniye boyunca 60 ° C, 20 saniye boyunca 72 ° C'de ve bir erime eğrisi analizini içeriyordu.
  4. 2-ΔΔCTdenklemlerini kullanarak Ct (eşik döngüsü) değerlerinden gen ekspresyonundaki nispi farklılıkları hesaplayarak RT-PCR deney verilerini analiz edin. RT-PCR nispi kantitatif gen ekspresyonu standardizasyonu için dahili kontrol olarak β-aktin kullanın.

6. ELISA için hücre kültürü süpernatantının hasat edilmesi

  1. Her hücre kültürü ortamını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin.
  2. 1500 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı alın ve hemen -80 °C'de saklayın.

7. ELISA ile sitokin ekspresyonunun analizi

  1. Tüm reaktifleri, çalışma standardını ve numuneleri hazırlamak için üreticinin talimatını izleyin. 2.000 ila 2.74 pg/mL arasında değişen numune seyreltici ile standardın üç kat seri seyreltilmesi. Numuneleri 1:2 oranında numune seyreltici ile seyreltin.
  2. Oyuk başına 100 μL standart ve numune ekleyin. Kuyuları kapakla örtün ve plakayı parafin film ile kapatın. Oda sıcaklığında 2,5 saat inkübe edin.
  3. 2,5 saat sonra çözeltiyi atın. Plakanın her bir oyuğuna 3 dakika boyunca 300 μL yıkama tamponu ekleyin ve aspire edin. İşlemi dört kez daha tekrarlayın. Son yıkamadan sonra, plakayı ters çevirin ve kalan sıvıyı çıkarmak için emici kağıda hafifçe vurun.
  4. Her oyuğa 100 μL tespit antikor çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 °C'de 2 saat çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
    NOT: Her ELISA kitinde biyotinile tespit antikor çözeltisi hazırlanır.
  5. 300 μL Yıkama tamponu kullanarak her bir plaka kuyusunu beş kez aspire edin ve yıkayın. Son yıkamadan sonra, plakayı ters çevirin ve kalan sıvıyı çıkarmak için emici kağıda hafifçe vurun.
  6. Her kuyucuğa 100 μL HRP-Streptavidin konjugatı ekleyin. Hafifçe çalkalayarak oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin.
  7. İnkübasyondan sonra bir pipetle aspire ederek çözeltiyi atın. 300 μL Yıkama tamponu kullanarak her bir plaka kuyusunu beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, plakayı ters çevirin ve kalan sıvıyı çıkarmak için emici kağıda hafifçe vurun.
  8. Her kuyucuğa 100 μL TMB substratı ekleyerek algılama gerçekleştirin. Karanlıkta 37 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  9. Renk geliştiğinde her oyuğa 50 μL durdurma çözeltisi ekleyin. İyice karıştırmayı sağlamak için plakaya hafifçe vurun. Hemen 450 nm'de okuyun.

Sonuçlar

M5 kombinasyon stimülasyonu, HaCaT hücrelerinin inflamatuar yanıtını indükledi.
HaCaT hücreleri, 24 saat boyunca M5 sitokin kombinasyonu ile veya M5 sitokin kombinasyonu olmadan uyarıldı. İmmün ve inflamatuar kemokinlerin ve antimikrobiyal peptitlerin düzenlenmesinde rol oynayan sedef hastalığı ile ilişkili genlerin mRNA ekspresyonu değerlendirildi. Nötrofil kemokinler CXCL138, CXC...

Tartışmalar

Burada tarif edilen, transkripsiyon seviyesinde in vitro psoriasiform kutanöz inflamasyon profili oluşturmak için HaCaT hücre hattına beş sitokin kombinasyonu (IL-17A, IL-22, IL-1α, TNF-α, OSM) kullanan bir yöntemdir. Bu protokol, sedef hastalığının patogenezindeki genlerin mekanizmasının yanı sıra sedef hastalığı için terapötik ilaçların taranması üzerine yapılan çalışma için uyarlanabilir. Son raporlar, lezyonel deride IL-17A ve IL22 üreten CD8 T hücrel...

Açıklamalar

Yazarlar tarafından potansiyel bir çıkar çatışması bildirilmemiştir.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı [81703132, 31271483, 81472650, 81673061, 81573050, 31872739 ve 81601462] tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM—Dulbecco's Modified Eagle MediumGibco11965092
Fetal Bovine SerumGibco10100139C
HaCaT cellsChina Center for Type CultureCollectionGDC0106Less than 15 generations
Human IL-1β ELISA KitBeyotimePI305
Human IL-6 ELISA KitBeyotimePI330
Human IL-8 ELISA KitBeyotimePI640
IL-1 alpha HumanProspecCYT-253Recombinant protein
IL-17 HumanProspecCYT-250Recombinant protein
IL-22 HumanProspecCYT-328Recombinant protein
OSM HumanProspecCYT-231Recombinant protein
PBSGibco10010049pH 7.4
Penicillin-StreptomycinGibco15140163
PrimeScrip RT reagent KitTAKARARR047A
TB Green Premix Ex TaqTAKARARR420A
TNF alpha HumanProspecCYT-223Recombinant protein
TRIzo ReagentInvitrogen15596018
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol redGibco25200072

Referanslar

  1. Lowes, M. A., Bowcock, A. M., Krueger, J. G. Pathogenesis and therapy of psoriasis. Nature. 445 (7130), 866-873 (2007).
  2. Gupta, R., Debbaneh, M. G., Liao, W. Genetic epidemiology of psoriasis. Current dermatology reports. 3 (1), 61-78 (2014).
  3. Boehncke, W. -. H., Schön, M. P. Psoriasis. Lancet. 386 (9997), 983-994 (2015).
  4. Zaidi, Z., Lanigan, S. W., Lanigan, W. S., Zaidi, Z. . Dermatology in Clinical Practice. , 1-15 (2010).
  5. Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: An indispensable barrier. Experimental Dermatology. 17 (12), 1063-1072 (2008).
  6. Van Smeden, J., Janssens, M., Gooris, G., Bouwstra, J. The important role of stratum corneum lipids for the cutaneous barrier function. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1841 (3), 295-313 (2014).
  7. Wolf, R., Orion, E., Ruocco, E., Ruocco, V. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of psoriasis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 323-328 (2012).
  8. Proksch, E., Brasch, J. Abnormal epidermal barrier in the pathogenesis of contact dermatitis. Clinics in Dermatology. 30 (3), 335-344 (2012).
  9. Bäsler, K., Brandner, J. M. Tight junctions in skin inflammation. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology. 469 (1), 3-14 (2017).
  10. Hoffjan, S., Stemmler, S. On the role of the epidermal differentiation complex in ichthyosis vulgaris, atopic dermatitis and psoriasis. British Journal of Dermatology. 157 (3), 441-449 (2007).
  11. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends in Immunology. 34 (4), 174-181 (2013).
  12. Saxena, A., Raychaudhuri, S. K., Raychaudhuri, S. P. . Psoriatic Arthritis and Psoriasis. , 73-82 (2016).
  13. Lowes, M. A., Suárez-Fariñas, M., Krueger, J. G. Immunology of psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  14. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. The Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  15. Wang, Z., et al. Autophagy-based unconventional secretion of HMGB1 by keratinocytes plays a pivotal role in psoriatic skin inflammation. Autophagy. , 1-24 (2020).
  16. Choi, D. H., Hwang, H. S. Anti-inflammation activity of brazilin in TNF-α induced human psoriasis dermatitis skin model. Applied Biological Chemistry. 62 (1), 46 (2019).
  17. Teng, X., et al. IL-37 ameliorates the inflammatory process in psoriasis by suppressing proinflammatory cytokine production. Journal of Immunology. 192 (4), 1815-1823 (2014).
  18. Wu, S., et al. The potential of Diosgenin in treating psoriasis: Studies from HaCaT keratinocytes and imiquimod-induced murine model. Life Sciences. 241, 117115 (2020).
  19. Katarzyna, B., Elwira, S., Marta, M., Joanna, J. -. B., Magdalena, G. -. C. Models in the Research Process of Psoriasis. International Journal of Molecular Ences. 18 (12), 2514 (2017).
  20. Auewarakul, P., Gissmann, L., Cid-Arregui, A. Targeted expression of the E6 and E7 oncogenes of human papillomavirus type 16 in the epidermis of transgenic mice elicits generalized epidermal hyperplasia involving autocrine factors. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8250-8258 (1994).
  21. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  22. Irma, C., et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators of Inflammation. 2017, 7435621 (2017).
  23. Melino, G., et al. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Results & Problems in Cell Differentiation. 24 (4), 175 (1998).
  24. Thewes, M., Stadler, R., Mischke, B. K. Normal psoriatic epidermis expression of hyperproliferation-associated keratins. Archives of Dermatological Research. , (1991).
  25. Ishida-Yamamoto, A., Senshu, T., Takahashi, H., Akiyama, K., Iizuka, H. Decreased deiminated keratin K1 in psoriatic hyperproliferative epidermis. Journal of investigative Dermatology. 114 (4), 701-705 (2000).
  26. Elango, T., et al. Methotrexate normalized keratinocyte activation cycle by overturning abnormal keratins as well as deregulated inflammatory mediators in psoriatic patients. Clinica Chimica Acta. , 329-337 (2015).
  27. Ghadially, R., Reed, J. T., Elias, P. M. Stratum corneum structure and function correlates with phenotype in psoriasis. Journal of investigative dermatology. 107 (4), 558-564 (1996).
  28. Nithya, S., Radhika, T., Jeddy, N. Loricrin - An overview. Journal of Oral and Maxillofacial Pathology. 19 (1), (2015).
  29. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal Kinase: Role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. Journal of Allergy & Clinical Immunology. 127 (2), (2011).
  30. Gutowska-Owsiak, D., et al. IL-17 downregulates filaggrin and affects keratinocyte expression of genes associated with cellular adhesion. Experimental dermatology. 21 (2), 104-110 (2012).
  31. Guilloteau, K., et al. Skin inflammation induced by the synergistic action of IL-17A, IL-22, oncostatin M, IL-1α, and TNF-α recapitulates some features of psoriasis. Journal of Immunology. 184 (9), 5263-5270 (2010).
  32. Jeon, B., et al. Optimization and validation of a method to identify skin sensitization hazards using IL-1 α and IL-6 secretion from HaCaT. Toxicology In Vitro : An International Journal Published in Association with BIBRA. 61, 104589 (2019).
  33. Lee, K. -. M., Kang, J. H., Yun, M., Lee, S. -. B. Quercetin inhibits the poly(dA:dT)-induced secretion of IL-18 via down-regulation of the expressions of AIM2 and pro-caspase-1 by inhibiting the JAK2/STAT1 pathway in IFN-γ-primed human keratinocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (1), 116-122 (2018).
  34. Lee, N., Chung, Y. C., Kang, C. I., Park, S. -. M., Hyun, C. -. G. 7,8-dimethoxycoumarin attenuates the expression of IL-6, IL-8, and CCL2/MCP-1 in TNF-α-treated HaCaT cells by potentially targeting the NF-κB and MAPK pathways. Cosmetics. 6 (3), (2019).
  35. Smolińska, E., Moskot, M., Jakóbkiewicz-Banecka, J., Wgrzyn, G., Gabig-Cimińska, M. Molecular action of isoflavone genistein in the human epithelial cell line HaCaT. PLoS One. 13 (2), 0192297 (2018).
  36. Ying, X., Yan, Y., Li, Y. Tripterine alleviates LPS-induced inflammatory injury by up-regulation of miR-146a in HaCaT cells. Biomedicine & Pharmacotherapy. 105, 798 (2018).
  37. Zhang, M., et al. AIM2 inflammasome mediates Arsenic-induced secretion of IL-1 β and IL-18. Oncoimmunology. 5 (6), 1160182 (2016).
  38. Lowes, M. A., et al. Immunology of Psoriasis. Annual Review of Immunology. 32, 227-255 (2014).
  39. Nedoszytko, B., Wojdyło, M. S., Dziurdzińska, K. -. S., Roszkiewicz, J., Nowicki, R. J. Chemokines and cytokines network in the pathogenesis of the inflammatory skin diseases: atopic dermatitis, psoriasis and skin mastocytosis. Postepy Dermatologii i Alergologii. 31, 84-91 (2014).
  40. Glowacka, E., Lewkowicz, P., Rotsztejn, H., Zalewska, A. IL-8, IL-12 and IL-10 cytokines generation by neutrophils, fibroblasts and neutrophils- fibroblasts interaction in psoriasis. Advances in Medical Sciences. 55 (2), 254-260 (2010).
  41. Li, H., et al. Cyr61/CCN1 induces CCL20 production by keratinocyte via activating p38 and JNK/AP-1 pathway in psoriasis. Journal of Dermatological Science. 88 (1), 46-56 (2017).
  42. Kim, T. G., et al. Dermal clusters of mature dendritic cells and T cells are associated with the CCL20/CCR6 chemokine system in chronic psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1462-1465 (2014).
  43. Kolbinger, F., et al. β-Defensin 2 is a responsive biomarker of IL-17A-driven skin pathology in patients with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 139 (3), (2017).
  44. Ekman, A., Vegfors, J., Eding, C., Enerbäck, C. Overexpression of psoriasin (S100A7) contributes to dysregulated differentiation in psoriasis. Acta Dermato-Venereologica. 97 (4), 441-448 (2016).
  45. Peric, M., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "Alarmins" psoriasin (S100A7) and Koebnerisin (S100A15) in psoriasis. Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  46. Aochi, S., et al. Markedly elevated serum levels of calcium-binding S100A8/A9 proteins in psoriatic arthritis are due to activated monocytes/macrophages. Journal of the American Academy of Dermatology. 64 (5), 879-887 (2011).
  47. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. Journal of Allergy Clinical Immunology. 130 (1), 145-154 (2012).
  48. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology & Venereology. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  49. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2018).
  50. Mizutani, H., Ohmoto, Y., Mizutani, T., Murata, M., Shimizu, M. Role of increased production of monocytes TNF-alpha, IL-1beta and IL-6 in psoriasis: relation to focal infection, disease activity and responses to treatments. Journal of dermatological science. 14 (2), 145-153 (1997).
  51. Pietrzak, A., Lecewicz-Torun, B., Chodorowska, G., Rolinski, J. Interleukin-18 levels in the plasma of psoriatic patients correlate with the extent of skin lesions and the PASI score. Acta Dermato-Venereologica. 83 (4), 262-265 (2003).
  52. Cai, Y., et al. A critical role of the IL-1β-IL-1R signaling pathway in skin inflammation and psoriasis pathogenesis. Journal of investigative Dermatology. 139 (1), 146-156 (2018).
  53. Arican, O., Aral, M., Sasmaz, S., Ciragil, P. Serum levels of TNF-α, IFN-γ IL-6, IL-8,IL-12, IL-17, and IL-18 in patients with active psoriasis and correlation with disease severity. Mediators of Inflammation. 2005 (5), 273-279 (2005).
  54. Grossman, R. M., et al. Interleukin 6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (16), 6367-6371 (1989).
  55. Nair, R. P., et al. Genome-wide scan reveals association of psoriasis with IL-23 and NF-kappaB pathways. Nature Genetics. 41 (2), 199-204 (2009).
  56. Boukamp, P., et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. The Journal of Cell Biology. 106 (3), 761-771 (1988).
  57. Deyrieux, A. F., Wilson, V. G. In vitro culture conditions to study keratinocyte differentiation using the HaCaT cell line. Cytotechnology. 54 (2), 77-83 (2007).
  58. Micallef, L., et al. Effects of extracellular calcium on the growth-differentiation switch in immortalized keratinocyte HaCaT cells compared with normal human keratinocytes. Experimental Dermatology. 18 (2), 143-151 (2009).
  59. Wilson, V. G. . Epidermal Cells. , 33-41 (2013).
  60. Ding, J., et al. Gene expression in skin and lymphoblastoid cells: Refined statistical method reveals extensive overlap in cis-eQTL signals. American Journal of Human Genetics. 87 (6), 779-789 (2010).
  61. Res, P. C., et al. Overrepresentation of IL-17A and IL-22 producing CD8 T cells in lesional skin suggests their involvement in the pathogenesis of psoriasis. PLoS One. 5 (11), (2010).
  62. Groves, R. W., Mizutani, H., Kieffer, J. D., Kupper, T. S. Inflammatory skin disease in transgenic mice that express high levels of interleukin 1 alpha in basal epidermis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (25), 11874-11878 (1995).
  63. Chan, J. R., et al. IL-23 stimulates epidermal hyperplasia via TNF and IL-20R2-dependent mechanisms with implications for psoriasis pathogenesis. The Journal of Experimental Medicine. 203 (12), 2577-2587 (2006).
  64. Zheng, Y., et al. Interleukin-22, a TH 17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and acanthosis. Nature. 445 (7128), 648-651 (2007).
  65. Ma, H. -. L., et al. IL-22 is required for Th17 cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. The Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 597-607 (2008).
  66. Lowes, M. A., Russell, C. B., Martin, D. A., Towne, J. E., Krueger, J. G. The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends Immunol. 34 (4), 174-181 (2013).
  67. Banno, T., Gazel, A., Blumenberg, M. Effects of tumor necrosis factor-α (TNFα) in epidermal keratinocytes revealed using global transcriptional profiling. Journal of Biological Chemistry. 279 (31), 32633-32642 (2004).
  68. Boniface, K., et al. IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. The Journal of Immunology. 174 (6), 3695-3702 (2005).
  69. Boniface, K., et al. Oncostatin M secreted by skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin inflammation. The Journal of Immunology. 178 (7), 4615-4622 (2007).
  70. Terui, T. Role of neutrophils in induction of acute inflammation in T-cell-mediated immune dermatosis, psoriasis: A neutrophil-associated inflammation-boosting loop. Experimental Dermatology. 9, (2000).
  71. Chiang, C. -. C., Cheng, W. -. J., Korinek, M., Lin, C. -. Y., Hwang, T. -. L. Neutrophils in psoriasis. Frontiers in Immunology. 10, 2376 (2019).
  72. Kennedy-Crispin, M., et al. Human keratinocytes' response to injury upregulates CCL20 and other genes linking innate and adaptive immunity. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 105-113 (2012).
  73. Morizane, S., Gallo, R. L. Antimicrobial peptides in the pathogenesis of psoriasis. The Journal of Dermatology. 39 (3), 225-230 (2012).
  74. Vandal, K., et al. Blockade of S100A8 and S100A9 suppresses neutrophil migration in response to lipopolysaccharide. The Journal of Immunology. 171 (5), 2602-2609 (2003).
  75. Ryckman, C., Vandal, K., Rouleau, P., Talbot, M., Tessier, P. A. Proinflammatory activities of S100: proteins S100A8, S100A9, and S100A8/A9 induce neutrophil chemotaxis and adhesion. The Journal of Immunology. 170 (6), 3233-3242 (2003).
  76. Nukui, T., et al. S100A8/A9, a key mediator for positive feedback growth stimulation of normal human keratinocytes. Journal of Cellular Biochemistry. 104 (2), 453-464 (2008).
  77. Yang, D., et al. β-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science. 286 (5439), 525-528 (1999).
  78. Hsu, K., et al. Anti-infective protective properties of S100 calgranulins. Anti-Inflammatory & Anti-Allergy Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Inflammatory and Anti-Allergy Agents). 8 (4), 290-305 (2009).
  79. Nestle, F. O., Kaplan, D. H., Barker, J. Psoriasis. The New England journal of medicine. 361 (5), 496-509 (2009).
  80. Tsoi, L. C., et al. Identification of 15 new psoriasis susceptibility loci highlights the role of innate immunity. Nature Genetics. 44 (12), 1341 (2012).
  81. Swindell, W. R., et al. RNA-seq identifies a diminished differentiation gene signature in primary monolayer keratinocytes grown from lesional and uninvolved psoriatic skin. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  82. Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. The cornified envelope: a model of cell death in the skin. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 328-340 (2005).
  83. Frost, P., Weinstein, G. D., Van Scott, E. J. The ichthyosiform dermatoses II. Journal of Investigative Dermatology. 47, 561-567 (1966).
  84. Reichelt, J., Furstenberger, G., Magin, T. M. Loss of keratin 10 leads to mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation, increased keratinocyte turnover, and decreased tumor formation in mice. Journal of Investigative Dermatology. 123 (5), 973-981 (2004).
  85. Hu, Z., et al. Loss-of-function mutations in filaggrin gene associate with psoriasis vulgaris in Chinese population. Human Genetics. 131 (7), 1269-1274 (2012).
  86. Giardina, E., et al. Characterization of the loricrin (LOR) gene as a positional candidate for the PSORS4 psoriasis susceptibility locus. Annals of Human Genetics. 68 (6), 639-645 (2004).
  87. Suga, H., et al. Skin barrier dysfunction and low antimicrobial peptide expression in cutaneous T-cell lymphoma. Clinical Cancer Research. 20 (16), 4339-4348 (2014).
  88. Iotzova-Weiss, G., et al. S100A8/A9 stimulates keratinocyte proliferation in the development of squamous cell carcinoma of the skin via the receptor for advanced glycation-end products. PLoS One. 10 (3), (2015).
  89. Seo, M. -. D., Kang, T. J., Lee, C. H., Lee, A. -. Y., Noh, M. HaCaT keratinocytes and primary epidermal keratinocytes have different transcriptional profiles of cornified envelope-associated genes to T helper cell cytokines. Biomolecules & Therapeutics. 20 (2), 171-176 (2012).
  90. Soboleva, A. G., et al. Genetically predetermined limitation in the use of HaCaT cells that affects their ability to serve as an experimental model of psoriasis. Genetika. 50 (10), 1222-1231 (2014).
  91. Wang, Z., et al. Systematic screening and identification of novel psoriasis-specific genes from the transcriptome of psoriasis-like keratinocytes. Molecular Medicine Reports. 19 (3), 1529-1542 (2019).
  92. Inoue, K., et al. Mechanism underlying ATP release in human epidermal keratinocytes. The Journal of Investigative Dermatology. 134 (5), 1465-1468 (2014).
  93. Harden, J. L., et al. CARD14 expression in dermal endothelial cells in psoriasis. PLoS One. 9 (11), 111255 (2014).
  94. Krueger, J. G., et al. IL-17A is essential for cell activation and inflammatory gene circuits in subjects with psoriasis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 130 (1), (2012).
  95. Hegyi, Z., et al. Vitamin D analog calcipotriol suppresses the Th17 cytokine-induced proinflammatory S100 "alarmins" psoriasin (S100A7) and koebnerisin (S100A15) in psoriasis. The Journal of Investigative Dermatology. 132 (5), 1416-1424 (2012).
  96. Schonthaler, H. B., et al. S100A8-S100A9 protein complex mediates psoriasis by regulating the expression of complement factor C3. Immunity. 39 (6), 1171-1181 (2013).
  97. Wilsmann-Theis, D., et al. Among the S100 proteins, S100A12 is the most significant marker for psoriasis disease activity. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology : JEADV. 30 (7), 1165-1170 (2016).
  98. Leuner, K., et al. Reduced TRPC channel expression in psoriatic keratinocytes is associated with impaired differentiation and enhanced proliferation. PLoS One. 6 (2), 14716 (2011).
  99. Gao, L., et al. Ozone therapy promotes the differentiation of basal keratinocytes via increasing Tp63-mediated transcription of KRT10 to improve psoriasis. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (8), 4819-4829 (2020).
  100. Kim, B. E., et al. TNF-α downregulates filaggrin and loricrin through c-Jun N-terminal kinase: role for TNF-α antagonists to improve skin barrier. The Journal of Investigative Dermatology. 131 (6), 1272-1279 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Transkripsiyon ProfiliPsoriasiformHaCaT H creleriSitokinlerPsoriasisKeratinositlernflamasyonAntimikrobiyal PeptitlerKemokinlerSitokinlerDiferansiyasyon Belirte leriTranskriptom VerileriMolek ler Patogenez

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır