JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو حل حساس وسريع للكشف عن المتغير الجيني. ذلك يعتمد على الاختلافات التسلسل التي تؤدي إلى تغيير شكل heteroduplexes منحنى ذوبان. من خلال تمشيط HRM و agarose هلام الكهربائي، يمكن تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية مثل indels.

Abstract

تحليل ذوبان عالية الدقة (إدارة الموارد البشرية) هو وسيلة قوية لل genotyping والمسح الجيني الاختلاف. تعتمد معظم تطبيقات إدارة الموارد البشرية على تشبع أصباغ الحمض النووي التي تكشف عن اختلافات التسلسل ، واللاتيرودوبلس التي تغير شكل منحنى الذوبان. وهناك حاجة إلى دقة ممتازة للصك وبرامج خاصة لتحليل البيانات لتحديد الاختلافات الصغيرة في منحنى الذوبان التي تحدد متغيرا أو نمطا جينيا. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد للمرضى الذين يعانون من مرض معين ، وخاصة السرطان وفي جين CALR في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية النقوية السالبة للكروموسوم في فيلادلفيا. يمكن الكشف عن التغيرات النيوكليوتيدات واحد، الإدراج و / أو الحذف (indels) في الجين من الفائدة من خلال تحليل إدارة الموارد البشرية. ويستند تحديد أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية في الغالب على الضوابط المستخدمة في فحص إدارة الموارد البشرية QPCR. ومع ذلك ، مع زيادة طول المنتج ، يصبح الفرق بين منحنيات البرية والهتيروزيجوتي أصغر ، ونوع المتغير الجيني أكثر صعوبة في تحديده. لذلك ، حيث indels هي البديل الجيني السائد المتوقع في جين الاهتمام ، يمكن استخدام طريقة إضافية مثل إلكتروفورسيس هلام الآغاروز لتوضيح نتيجة إدارة الموارد البشرية. في بعض الحالات، يجب إعادة فحص/إعادة تشخيص نتيجة غير حاسمة من خلال تسلسل سانجر القياسي. في هذه الدراسة بأثر رجعي، طبقنا هذه الطريقة على JAK2 V617F-المرضى الذين يعانون من MPN.

Introduction

تم التعرف على المتغيرات الوراثية الجسدية في جين السعرات الحرارية(CALR)في عام 2013 في المرضى الذين يعانون من الأورام النقوية (MPN) مثل تجلط الدم الأساسي والتليف النقوي الأولي1،2. ومنذ ذلك الحين، تم اكتشاف أكثر من 50 متغيرا جينيا في جين CALR، مما أدى إلى تحول إطاري +1 (−1+2)3. المتغيران الجينيان الأكثر شيوعا في CALR هما حذف 52 bp (NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46))، وتسمى أيضا طفرة من النوع 1، وإدخال 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47))، وتسمى أيضا طفرة النوع 2. يمثل هذان المتغيران الجينيان 80٪ من جميع المتغيرات الجينية CALR. وقد صنفت الأخرى على أنها نوع 1-مثل أو نوع 2-مثل استخدام خوارزميات على أساس الحفاظ على الحلزون α قريبة من نوع البرية CALR4. هنا، نقدم واحدة من الطرق الحساسة للغاية والسريعة للكشف عن المتغير الجيني CALR، وطريقة تحليل ذوبان عالية الدقة (HRM). تمكن هذه الطريقة من الكشف السريع عن المتغيرات الجينية من النوع 1 والنوع 2 ، والتي تمثل غالبية طفرات CALR 5. وقدم إدارة الموارد البشرية في تركيبة مع الوقت الحقيقي »تفاعل البوليميراز المتسلسل« (qPCR) في عام 1997 كأداة للكشف عن طفرة في عامل V لايدن6. بالمقارنة مع تسلسل سانجر الذي يمثل تقنية المعيار الذهبي ، فإن إدارة الموارد البشرية هي طريقة أكثر حساسية وأقل تحديدا5. طريقة إدارة الموارد البشرية هي طريقة فحص جيدة تمكن من التحليل السريع لعدد كبير من العينات مع فائدة كبيرة من حيث التكلفة5. وهو أسلوب PCR بسيطة يؤديها في وجود صبغة الفلورسنت ولا تتطلب مهارات محددة. فائدة أخرى هي أن الإجراء نفسه لا يضر أو يدمر العينة التي تم تحليلها التي تسمح لنا بإعادة استخدام العينة لتسلسل الكهربائي أو سانجر بعد إجراء إدارة الموارد البشرية7. العيب الوحيد هو أنه من الصعب في بعض الأحيان تفسير النتائج. بالإضافة إلى ذلك، لا تكتشف إدارة الموارد البشرية الطفرة الدقيقة في المرضى الذين يعانون من طفرات غير من النوع 1 أو النوع2 8. في هؤلاء المرضى، ينبغي تنفيذ تسلسل سانجر(الشكل 1).

وتستند إدارة الموارد البشرية على تضخيم منطقة الحمض النووي المحددة في وجود صبغة فلورية الحمض النووي المشبعة ، والتي يتم دمجها في الحمض النووي المزدوج الذين تقطعت بهم السبل (dsDNA). تنبعث من الصبغة الفلورية ضوء عند دمجها في dsDNA. بعد زيادة تدريجية في درجة الحرارة، dsDNA ينهار إلى الحمض النووي واحد تقطعت بهم السبل، والتي يمكن الكشف عنها على منحنى ذوبان كانخفاض مفاجئ في كثافة الفلورية. يعتمد شكل منحنى الذوبان على تسلسل الحمض النووي الذي يستخدم للكشف عن الطفرة. تتم مقارنة منحنيات ذوبان العينات بمنحنيات ذوبان الطفرات المعروفة أو CALR البرية. تمثل منحنيات الذوبان المتميزة طفرة مختلفة غير من النوع 1 أو النوع 29.

خوارزمية الكشف عن المتغير الجيني الجسدي في الجين CALR بواسطة إدارة الموارد البشرية، أجاروز هلام electrophoresis وطريقة التسلسل(الشكل 1)تم استخدامها والتحقق من صحتها في الدراسة بأثر رجعي نشرت قبل10.

Protocol

وقد وافقت لجنة الأخلاقيات الطبية في جمهورية سلوفينيا على الدراسة. وكانت جميع الإجراءات وفقا لإعلان هلسنكي.

1. الفلورسينس القائم على الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) وتحليل ما بعد qPCR من قبل إدارة الموارد البشرية

  1. Resuspend التمهيديات المدرجة في جدول المواد إلى 100 ميكرومتر مع عقيمة، RNase و DNase الحرة H2O (انظر جدول المواد). جعل 10 ميكرومتر عمل تركيز التمهيدي. تم نشر المبرمجين المستخدمة في البروتوكول قبل2.
  2. الكمية المحببة الحمض النووي من قبل طريقة تلطيخ مضان بعد تعليمات الشركة المصنعة11 (انظر جدول المواد). إعداد محلول الحمض النووي 20 نانوغرام / μL باستخدام 10 mM تريس-Cl، 0.5 mM EDTA، درجة الحموضة 9.0 (انظر جدول المواد).
    1. بالإضافة إلى عينات الحمض النووي، وإعداد ما لا يقل عن ثلاثة ضوابط الحمض النووي: اثنين من الضوابط الإيجابية مع NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52، p.(Leu367Thrfs*46) (حذف 52 bp أو طفرة من النوع 1)، و NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC، p.(Lys385Asnfs*47) (إدخال 5 bp أو نوع 2 طفرة) متغير جيني، بالإضافة إلى الحمض النووي البري والتحكم السلبي كتحكم غير قالب (NTC).
      ملاحظة: قبل تنفيذ إعداد إدارة الموارد البشرية، تأكد من معايرة أداة qPCR لتجارب إدارة الموارد البشرية.
  3. إعداد qPCR HRM ماجستير ميكس وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد)على النحو التالي: 10 ميكرولتر من 2x qPCR ماجستير ميكس مع صبغ، 0.2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر إلى الأمام التمهيدي، 0.2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر عكس التمهيدي، 8.6 ميكرولتر من العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O. استخدام التمهيديات من جدول المواد. تشغيل ثلاث نسخ متماثلة لكل عينة الحمض النووي والتحكم.
    1. إعداد qPCR HRM ماجستير ميكس وفقا لعدد من العينات التي يجري تجهيزها. قم بتضمين حجم زائد لا يقل عن 10٪ في الحسابات لتوفير حجم زائد للخسارة التي تحدث أثناء عمليات نقل الكاشف.
  4. مزيج محتويات رد الفعل عن طريق التنصت بلطف وعكس الأنبوب والدوامات لمدة 2-3 ق. جمع جميع قطرات متناثرة من جدار الأنبوب إلى أسفل من قبل تدور وجيزة.
  5. إعداد لوحة رد فعل مناسبة للآلة وتجربة إدارة الموارد البشرية (انظر جدول المواد). نقل 19 ميكرولتر من qPCR HRM ماجستير ميكس إلى الآبار المناسبة من لوحة رد الفعل البصري 96 جيدا.
  6. Pipet 1 ميكرولتر من الضوابط السلبية، والضوابط الإيجابية، وعينات في الآبار المناسبة من لوحة رد الفعل البصري. بالنسبة للمجلس الوطني الانتقالي، نقل 1 ميكرولتر من المعقمة، RNase و DNase الحرة H2O المستخدمة لإعداد qPCR HRM ماجستير ميكس بدلا من الحمض النووي.
  7. ختم لوحة رد الفعل مع فيلم لاصق البصرية. القيام بذلك بحزم لمنع التبخر أثناء التشغيل. تأكد من أن الفيلم اللاصق البصري هو الطائرة عبر جميع الآبار في لوحة رد الفعل لضمان الكشف عن مضان الصحيح.
  8. تدور لوحة رد الفعل في 780 × ز في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 1 دقيقة. تأكد من أن السائل في الجزء السفلي من الآبار في لوحة رد الفعل. تابع تشغيل المقايسة.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين لوحة في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 24 ساعة. السماح للوح المخزنة في 4 درجة مئوية لتدفئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله.
  9. وفقا لتعليمات الشركة المصنعة إعداد وبدء تشغيل لتضخيم وذوبان الحمض النووي وتوليد بيانات مضان إدارة الموارد البشرية في صك qPCR. في برنامج نظام الأجهزة، قم بتعيين عناصر التحكم والعينات إلى الآبار المناسبة.
  10. للكشف عن المتغير الجيني CALR، قم بتغيير بروتوكول تضخيم الأداة الافتراضية وتضخيم الحمض النووي باستخدام بروتوكول الدراجات الحرارية التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، تليها 50 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 10 ق و 62.5 درجة مئوية لمدة 60 s.
  11. قم بتنفيذ مرحلة المنحنى/التفكك الذائب (HRM) مباشرة بعد qPCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة12 على النحو التالي: 95 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، و60 درجة مئوية لمدة دقيقة واحدة، ثم معدل منحدر قدره 0.025 درجة مئوية / ثانية حتى 95 درجة مئوية. عقد درجة الحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 15 ق و 60 درجة مئوية لمدة 15 s.
  12. ينتهي التشغيل تلقائيا. أولا، مراجعة و التحقق من مؤامرة التضخيم (الشكل 2).
  13. في قائمة التجارب لبرنامج نظام الأجهزة، حدد خيار مخطط التضخيم. إذا لم يتم عرض أية بيانات، فانقر فوق الزر الأخضر تحليل.
    1. في علامة التبويب مخطط التضخيم، من القائمة المنسدلة لنوع الرسم، حدد الرسم الذي يعرض بيانات التضخيم كقراءات الفلورية الخام التي تم تطبيعها إلى الفلورسينس من المرجع السلبي (ΔRn) كدالة لرقم الدورة (ΔRn vs Cycle). في القائمة المنسدلة لون الرسم، حدد نموذج.
  14. من القائمة المنسدلة لنوع الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني التضخيم الخطي. إظهار دورة بداية ونهاية الأساس على الرسم البياني التضخيم الخطي عن طريق تحديد خيار بدء الأساس. تحقق من تعيين الأساس بشكل صحيح. يجب تعيين دورة النهاية قبل بضع دورات من رقم الدورة حيث يتم الكشف عن إشارة فلورية كبيرة. وعادة ما يتم تعيين خط الأساس من 3 إلى 15 دورة(الشكل 2).
  15. من القائمة المنسدلة لنوع الرسم البياني، حدد نوع الرسم البياني لتضخيم اللوغاريتم10. إظهار خط العتبة على الرسم البياني عن طريق تحديد خيار العتبة. ضبط العتبة وفقا لذلك إذا لم يتم تعيين بشكل صحيح. وتعني عتبة المجموعة بشكل صحيح أن خط العتبة يعبر المرحلة الأسية لمنحنيات qPCR(الشكل 2).
  16. تحقق من أن منحنيات التضخيم العادية موجودة في جميع آبار التحكم العينة والإيجابية. تحقق من عدم وجود تضخيم في آبار المجلس الانتقالي قبل الدورة 40. تظهر مؤامرة التضخيم الطبيعية زيادة أسية في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35(الشكل 2). استبعاد عينات الآبار من التحليل إذا لم يكن هناك تضخيم في وضع البئر.
    ملاحظة: إذا كانت مؤامرة تضخيم تبدو غير طبيعية أو يشير جيدا NTC التضخيم، تحديد وحل المشكلة وفقا لدليل الشركة المصنعة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.
  17. استبعاد القيمة المتطرفة مع دورة القياس الكمي (Cq) التي تختلف عن التكرارات بأكثر من 2 في برنامج نظام الأجهزة12. قد تنتج القيم المتطرفة نتائج خاطئة MM.
  18. في منحنيات ذوبان المشتقة، راجع مناطق ما قبل وما بعد الذوبان/ خطوط درجة الحرارة. وينبغي أن تكون المناطق ما قبل وما بعد ذوبان داخل منطقة مسطحة حيث لا توجد قمم كبيرة أو المنحدرات في مستويات الفلورسنت(الشكل 3). إذا لزم الأمر ضبطه وفقا لذلك. إعداد بداية وتوقف خطوط درجة الحرارة قبل وبعد ذوبان ما يقرب من 0.5 درجة مئوية وبصرف النظر عن بعضها البعض(الشكل 3). أعد تشغيل التحليل إذا تم ضبط المعلمات بالنقر فوق الزر تحليل.
  19. في علامة التبويب رسم الفرق، في علامة التبويب إعدادات الرسم، اختر أحد أنواع التحكم البرية (homozygote) التي يتم نسخها نسخا متماثلا كالحمض النووي المرجعي وإعادة تشغيل التحليل بالنقر على زر التحليل.
  20. في علامة التبويب المنحنيات ذوبان محاذاة، تأكد من أن جميع الضوابط الإيجابية لديها النمط الجيني الصحيح وفشل المجلس الانتقالي لتضخيم(الشكل 4). من جدول البئر، حدد الآبار التي تحتوي على عنصر تحكم إيجابي لتسليط الضوء على منحنى الذوبان المقابل في مؤامرات التحليل. تأكد من أن لون الخط يتوافق مع النمط الجيني الصحيح. كرر الخطوات للالآبار التي تحتوي على عناصر التحكم الإيجابية الأخرى و NTC.
  21. في علامة التبويب منحنيات الذوبان المنحازة، راجع بعناية يعرض مؤامرة لعينات غير معروف ومقارنتها يعرض مؤامرة لضوابط (الشكل 4). من الجدول البئر، حدد الآبار التي تحتوي على نماذج نسخ متماثلة غير معروفة، والتحقق من لون منحنى ذوبان ومحاذاتها مع عناصر التحكم في تسلسل أمر عن طريق تحديد الآبار التي تحتوي على ضوابط إيجابية واحدا تلو الآخر. كرر العملية لكافة العينات غير معروف.
    ملاحظة: يحتوي النموذج غير معروف متغير أحد عناصر التحكم إذا منحنى انصهار به هو محاذاة بإحكام إلى ذلك. يمكن عرض مجموعات متغير مختلفة (ألوان مختلفة) مما يشير إلى أن العينة غير معروف يتكون من متغير غير معروف، لا تتوافق مع عناصر التحكم(الشكل 8). يمكن أن يكون هناك مستوى منخفض من المتغير الوراثي الجسدي في عينة المريض. وهذا يمكن أن يؤثر على تفسير نتيجة إدارة الموارد البشرية، لا سيما عند حد الكشف عن المقايسة(الشكل 9). في هذه الحالات، يمكن أن يشبه لون الخط أو حتى شكله بشكل كبير لون النمط الجيني البري.
    1. عندما تكون النتيجة غير حاسمة، والجمع بين نتائج إدارة الموارد البشرية مع نتائج الكهروفورسيس هلام agarose وطرق التسلسل. إعادة اختبار العينة أو طلب وإعادة اختبار عينة جديدة إذا لزم الأمر.
    2. راجع بعناية مجموعة البيانات الخاصة بالمنحنيات المتماثلة وتحقق من أن محاذاة كل نسخة متماثلة داخل المجموعة ضيقة. استبعاد النسخ المتماثل إذا لم محاذاة بإحكام مع العينات الأخرى في المجموعة (شاذ). إعادة اختبار العينة إذا كان هناك المزيد من القيم المتطرفة والنتائج غير حاسمة. كن على علم بأن كمية ونوعية عينة الحمض النووي تؤثر على نتائج إدارة الموارد البشرية.
  22. تحليل النتيجة لعينة غير معروف في علامة التبويب رسم الفرق. كرر الإجراء الموضح في الخطوة 1.21 وتحقق من أن النتائج التي تم الحصول عليها للعينة غير معروف هي نفسها.
  23. ثم قم بتشغيل منتجات إدارة الموارد البشرية qPCR على هلام الآغاروز.
    ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. تخزين لوحة في 4 °C لمدة لا تزيد عن 24 ساعة أو في -20 درجة مئوية لفترة أطول ولكن لا يزيد عن 7 أيام. السماح للوح المخزنة في 4 درجة مئوية لتدفئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله. السماح للوح المخزنة في - 20 درجة مئوية لذوبان ودافئة لRT، ومن ثم تدور لوحة لفترة وجيزة قبل تشغيله.

2. أجاروز هلام الكهربائي

  1. تشغيل منتجات QPCR HRM على هلام agarose قبل المدلى بها 4٪ تحتوي على وصمة عار حمض النووي الفلورية باستخدام نظام الكهربائي هلام المناسبة (انظر جدول المواد، الشكل 5). تشغيل واحد فقط موجبة سالبة NTC و نموذج qPCR HRM النسخ المتماثل.
    ملاحظة: يجب دائما ارتداء القفازات عند التعامل مع المواد الهلامية. أي نظام آخر هلام electrophoresis يمكن تحقيق هذا الغرض إذا تم اختيار ما يعادل نسبة agarose، وصمة عار الحمض النووي الفلورية وشكل جيدا.
  2. تشغيل نظام الجل الكهربائي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). إزالة هلام ما قبل المدلى بها في كاسيت من الحزمة، وإزالة المشط وإدراجه في الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: قم بتحميل الجل خلال 15 دقيقة من فتح الحزمة.
  3. تمييع عينة 10 ميكرولتر إلى 20 ميكرولتر مع العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O. تحميل كل بئر مع 20 ميكرولتر من عينة مخففة.
  4. تمييع 3 ميكرولتر من محلول قياس حجم الحمض النووي إلى 20 ميكرولتر مع العقيمة، RNase و DNase الحرة H2O (انظر جدول المواد). تحميل M جيدا مع 20 ميكرولتر من محلول معيار حجم الحمض النووي المخفف (الشكل 6).
  5. ملء أي آبار فارغة مع 20 ميكرولتر من العقيمة، RNase و DNase مجانا H2O.
  6. حدد البرنامج فورا وفقا للنسبة المئوية من الجل الذي يتم تشغيله وتعيين وقت التشغيل على الجهاز إلى 10 دقائق.
  7. بدء الكهربية في غضون 1 دقيقة من عينة التحميل عن طريق الضغط على زر GO. يمكن تمديد وقت التحليل الكهربائي إذا تم الحصول على دقة غير كافية.
    ملاحظة: لا تتجاوز الحد الأقصى الموصى به من وقت تشغيل الكهروضوئية Agarose وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  8. عند اكتمال الكهربائي، تصور الحمض النووي في هلام باستخدام الضوء الأزرق أو الأشعة فوق البنفسجية transillumination. تصور وتحليل وتخزين الصور الكهربائي ويتم معظمها بواسطة صور هلام مع نظام توثيق الصور(الشكل 5).
  9. تحليل وتفسير تصور qPCR نمط هلام منتجات إدارة الموارد البشرية من خلال مقارنة نتائج العينة غير معروف لضوابط إيجابية (الشكل 7 والشكل 8).
  10. إذا كانت العينة غير معروفة HRM وهلام electrophoresis النتائج تشير إلى أن البديل الجيني غير معروف موجود، تسلسل المنتج QPCR إدارة الموارد البشرية باستخدام التمهيديات الموصوفة في جدول المواد وفقا للبروتوكول وصف13.
    تنبيه: يجب التخلص بشكل صحيح من المواد الهلامية الآغاروز التي تحتوي على وصمة حمض النيوكليك الفلورية لكل لوائح المؤسسة.

النتائج

إن منطقة الحمض النووي التي تم تضخيمها بنجاح مع زيادة هائلة في الفلورسينس تتجاوز العتبة بين الدورتين 15 و 35 والقيم الضيقة للغاية لدورة القياس الكمي (Cq) في جميع العينات والضوابط المكررة(الشكل 2)هي شرط أساسي لتحديد المتغيرات الجينية الموثوق بها من خلال تحليل إدارة الموارد البش...

Discussion

ذوبان عالية الدقة من الحمض النووي هو حل بسيط ل genotyping والمسح الجيني المتغير14. يعتمد ذلك على اختلافات التسلسل التي تؤدي إلى الترودوبليكس التي تغير شكل منحنى الذوبان. يمكن ملاحظة أنواع مختلفة من المتغيرات الجينية ذات الترددات المتنوعة في الجين المحدد لمجموعة معينة من المرضى ال?...

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يكشفان عنه.

Acknowledgements

ويود المؤلفون أن يشكروا جميع الخبراء الأكاديميين والموظفين في مختبر أمراض الدم المتخصص، قسم أمراض الدم، شعبة الطب الباطني، المركز الطبي الجامعي ليوبليانا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
E-Gel EX 4% AgaroseInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG401004
Fuorometer 3.0 QUBITInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo KitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2XApplied Biosystem, Thermo Fischer Scientific4415440Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4346907
MicroAmp Optical adhesive filmApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4311971
NuGeniusSyngeneNG-1045Gel documentation systems
Primer CALRex9 ForwardEurofins GenomicsSequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 ReverseEurofins GenomicsSequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51306DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay TubesInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32856
QUBIT dsDNA HS assayInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32854
Trackit 100bp DNA LadderInvitrogen, Thermo Fischer Scientific10488058Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4453534
Water nuclease freeVWR, Life Science436912CRNase, DNase and Protease free water

References

  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
  3. Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
  4. Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
  5. Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
  6. Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
  7. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
  8. Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
  9. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
  10. Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
  11. Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
  12. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
  13. Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
  14. Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
  15. Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
  16. Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
  17. Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
  18. Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
  19. Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
  20. Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
  21. Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
  22. Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
  23. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
  24. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162 agarose electrophoresis indel CALR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved