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요약

고해상도 용융 분석(HRM)은 유전적 이체 검출을 위한 민감하고 신속한 솔루션입니다. 그것은 이발 곡선의 모양을 변경 하는 heteroduplexes 귀착되는 시퀀스 차이에 따라 달라 집니다. HRM 및 아가로즈 젤 전기전도를 빗질함으로써, 인델과 같은 유전적 변이체의 상이한 유형을 확인할 수 있다.

초록

고해상도 용융 분석(HRM)은 유전화 및 유전적 변이 스캐닝을 위한 강력한 방법입니다. 대부분의 HRM 응용 프로그램은 서열 차이를 감지하는 DNA 염료를 포화시키고 용융 곡선의 모양을 변경하는 이테로두플렉스에 의존합니다. 우수한 계측기 해상도와 특수 데이터 분석 소프트웨어는 변형 또는 유전자형을 식별하는 작은 용융 곡선 차이를 식별하는 데 필요합니다. 다양한 주파수를 가진 유전 이체의 다른 모형은 특정 질병을 가진 환자를 위해 특정한 유전자에서 관찰될 수 있습니다, 특히 암 및 필라델피아 염색체-음성 골수증성 신생물을 가진 환자에 있는 CALR 유전자에서. 관심 유전자의 단일 뉴클레오티드 변화, 삽입 및/또는 삭제(indels)는 HRM 분석에 의해 검출될 수 있다. 유전 이체의 다른 모형의 확인은 주로 qPCR HRM 분석에서 사용된 통제에 근거를 두릅니다. 그러나 제품 길이가 증가함에 따라 야생형곡선과 이종조곡선의 차이가 작아지고 유전적 변이체의 유형이 결정되기 가 더 어려워진다. 따라서, 인델이 관심 있는 유전자에서 예상되는 널리 퍼진 유전적 이체인 경우, 아가로즈 겔 전기포진과 같은 추가 방법이 HRM 결과의 해명에 사용될 수 있다. 경우에 따라 표준 Sanger 시퀀싱에 의해 결정적인 결과를 다시 검사/다시 진단해야 합니다. 이 회고 연구에서, 우리는 MPN을 가진 JAK2 V617F 음성 환자에 방법을 적용했습니다.

서문

calreticulin유전자(CALR)의체세포 유전 변이체는 2013년에 필수 혈전세포증 및 1차 골수혈증과같은 골수증성 신생물(MPN)을 가진 환자에서1,2를인식하였다. 그 이후로 CALR 유전자에 있는 50개 이상의 유전 변이체가 발견되어 +1(−1+2) 프레임 시프트3을유도합니다. 가장 빈번한 CALR 유전변이체 는 52bp 삭제(NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)) 및 타입-1 돌연변이라고도 하며, 5bp 삽입(NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, p.(lys385Asnfs*47))라고도 합니다. 이 2개의 유전 이체는 모든 CALR 유전 이체의 80%를 나타냅니다. 다른 것들은 야생형 CALR4에가까운 α 나선의 보존에 기초한 알고리즘을 사용하여 유형 1-like 또는 유형 2-와 같은 유형으로 분류되었습니다. 여기서, 우리는 CALR 유전이체 검출을 위한 고민감하고 신속한 방법 중 하나인 고해상도 용융 분석 방법(HRM)을 제시한다. 이 방법은 CALR 돌연변이5의대다수를 나타내는 타입-1 및 타입-2 유전 이체의 급속한 검출을 가능하게 합니다. HRM은 1997년 V 라이덴6의돌연변이를 검출하는 도구로 실시간 »폴리머라제 연쇄 반응«(qPCR)과 함께 도입되었다. 황금 표준 기술을 나타내는 Sanger 시퀀싱과 비교하여 HRM은 보다 민감하고 덜 구체적인 방법5입니다. HRM 방법은 비용 이점5를가진 많은 수의 샘플을 신속하게 분석할 수 있는 좋은 스크리닝 방법입니다. 형광염의 존재에서 수행되는 간단한 PCR 방법이며 특정 기술이 필요하지 않습니다. 또 다른 이점은 절차 자체가 HRM 시술7후 전기전도 또는 Sanger 시퀀싱시퀀싱시료를 재사용할 수 있는 분석된 샘플을 손상시키거나 파괴하지 않는다는 것입니다. 유일한 단점은 때때로 결과를 해석하기 어렵다는 것입니다. 또한, HRM은 비형 1 또는 타입-2 돌연변이8을가진 환자에서 정확한 돌연변이를 검출하지 않습니다. 이러한 환자에서, Sanger 시퀀싱을 수행해야한다(도 1).

HRM은 이중 좌초 된 DNA (dsDNA)에 통합되는 포화 DNA 형광 염료의 존재에서 특정 DNA 영역의 증폭에 기초한다. 형광 염료는 dsDNA에 통합 될 때 빛을 방출합니다. 온도가 점진적으로 증가한 후 dsDNA는 단일 좌초 된 DNA로 분해되어 용융 곡선에서 형광 강도가 급격히 감소함에 따라 감지 될 수 있습니다. 용융 곡선의 모양은 돌연변이를 검출하는 데 사용되는 DNA 서열에 따라 달라집니다. 시료의 용융 곡선은 알려진 돌연변이 또는 야생 형 CALR의 용융 곡선과 비교됩니다. 뚜렷한 용융 곡선은 비타입 1 또는 유형 29인다른 돌연변이를 나타낸다.

HRM, 아가로즈 겔 전기포진 및 시퀀싱방법(도 1)에의한 CALR 유전자내체 유전적 이체 검출을 위한 알고리즘은10일전에 발표된 회고전 연구에서 사용되고 검증되었다.

프로토콜

연구 결과는 슬로베니아 공화국의 의학 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 모든 절차는 헬싱키 선언에 따른 것입니다.

1. HRM에 의한 형광 기반 정량적 실시간 PCR(qPCR) 및 사후 qPCR 분석

  1. 재료 표에 나열된 프라이머를 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O로 100 μM로 재일시 중지합니다(재료 표참조). 10 μM 작업 농도 프라이머를 만듭니다. 프로토콜에 사용된 프라이머는2이전에 게시되었습니다.
  2. 제조업체의 지시 에 따른 형광 염색 방법에 의한 DNA 의 양수과립세포(재료표 참조). 10m Tris-Cl, 0.5 mM EDTA, pH 9.0을 사용하여 20 ng/μL DNA 용액을 준비한다(재료표참조).
    1. DNA 샘플 이외에, 적어도 세 가지 DNA 컨트롤을 준비: NM_004343.3(CALR)와두 개의 양성 대조군 : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52bp 삭제 또는 타입 1 돌연변이), 및 NM_004343.3(CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5bp 삽입 또는 유형 2 돌연변이) 유전 변이체뿐만 아니라 야생형 DNA 및 음극대조를 비템플릿(NTC) 대조로 조절한다.
      참고: HRM 설정을 수행하기 전에 HRM 실험을 위해 qPCR 계측기를 교정하는지 확인합니다.
  3. 제조사의 프로토콜에 따라 qPCR HRM 마스터 믹스준비(재료표 참조) : 2x qPCR 마스터 믹스의 10 μL, 염료와 함께 하는 0.2 μL, 10 μM 포워드 프라이머의 0.2 μL, 10 μM 역 프라이머의 0.2 μL, 멸균, RNase 및 DNase 프리 H2O 의 사용. 각 DNA 샘플 및 제어에 대해 세 가지 복제를 실행합니다.
    1. 처리되는 샘플 수에 따라 qPCR HRM 마스터 믹스를 준비합니다. 시약 전송 중에 발생하는 손실에 대한 초과 볼륨을 제공하기 위해 계산에 최소 10 %의 초과 볼륨을 포함합니다.
  4. 튜브를 부드럽게 두드리고 반전시키고 2-3초 동안 소용돌이를 통해 반응 내용을 섞는다. 튜브 의 벽에서 바닥까지 짧은 스핀으로 흩어진 모든 물방울을 수집합니다.
  5. 계측기 및 HRM 실험에 적합한 반응 플레이트를 준비합니다(재료 표참조). qPCR HRM 마스터 믹스의 19 μL을 96웰 광학 반응 플레이트의 적절한 웰으로 옮기다.
  6. 옵트 1 μL의 음수 컨트롤, 양수 제어 및 시료를 광학 반응 플레이트의 적절한 우물로 넣습니다. NTC의 경우, DNA 대신 qPCR HRM 마스터 믹스를 준비하는 데 사용되는 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O의 1 μL을 전송합니다.
  7. 광학 접착 필름으로 반응 플레이트를 밀봉합니다. 실행 중에 증발을 방지하기 위해 단단히 하십시오. 광학 접착 필름이 반응 플레이트의 모든 우물을 가로질러 평면인지 확인하여 올바른 형광 검출을 보장합니다.
  8. 반응 플레이트를 실온(RT)에서 780 x g로 1분간 회전시합니다. 액체가 반응 플레이트의 우물 바닥에 있는지 확인합니다. 분석기를 실행하려면 진행합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 플레이트를 4°C에 24시간 이하로 저장합니다. 4°C에 저장된 플레이트를 RT로 따뜻하게 한 다음 플레이트를 실행하기 전에 잠시 회전합니다.
  9. 제조업체의 지시에 따르면 DNA를 증폭 및 용융하고 qPCR 기기에서 HRM 형광 데이터를 생성하기 위해 실행을 준비하고 시작합니다. 계측기 시스템 소프트웨어에서 컨트롤과 샘플을 적절한 우물에 할당합니다.
  10. CALR 유전 적 변이체 검출의 경우, 기본 계측기 증폭 프로토콜을 변경하고 다음 열 순환 프로토콜을 사용하여 DNA를 증폭 : 95 °C 10 분 동안, 그 다음에 10 s에 대한 95 °C의 50 사이클과 60 s에 대한 62.5 ° C.
  11. 제조업체의지침(12)에 따라 qPCR 직후용융 곡선/해리(HRM) 단계를 수행합니다: 10s용 95°C, 1분 동안 60°C, 그리고 95°C까지0.025°C/s의 경사로 속도를 갖는다. 온도를 95°C에서 15s, 60°C에서 15s로 유지합니다.
  12. 실행이 자동으로 종료됩니다. 먼저 증폭 플롯을 검토하고 확인합니다(그림2).
  13. 계측기 시스템 소프트웨어의 실험 메뉴에서 증폭 플롯 옵션을 선택합니다. 데이터가 표시되지 않으면 녹색 단추 를 클릭합니다.
    1. 증폭 플롯 탭에서, 플롯 유형 드롭다운 메뉴에서, 사이클 수(ΔRn vs Cycle)의 함수로서 수동 참조(ΔRn)로부터 형광으로 정규화된 원시 형광 판독값으로 증폭 데이터를 표시하는 플롯을 선택한다. 플롯 색상 드롭다운 메뉴에서 샘플을선택합니다.
  14. 그래프 유형 드롭다운 메뉴에서 선형 증폭 그래프 유형을 선택합니다. 기준 시작 옵션을 선택하여 선형 증폭 그래프에서 기준선 시작 및 끝 주기를 표시합니다. 기준선이 올바르게 설정되어 있는지 확인합니다. 종주기는 상당한 형광 신호가 감지되는 사이클 수 전에 몇 사이클을 설정해야 합니다. 기준선은 일반적으로 3에서 15 사이클로 설정됩니다(그림2).
  15. 그래프 유형 드롭다운 메뉴에서 log10 증폭 그래프 유형을 선택합니다. 임계값 옵션을 선택하여 그래프의 임계값 선을 표시합니다. 올바르게 설정하지 않으면 임계값을 적절하게 조정합니다. 올바르게 설정된 임계값은 임계값 선이 qPCR 곡선의 지수 단계를 교차한다는 것을 의미합니다(그림2).
  16. 일반 증폭 곡선이 모든 샘플 및 양수 제어 우물에 있는지 확인합니다. 주기 40 전에 NTC 우물에 증폭이 없는지 확인합니다. 정상 증폭 플롯은 주기 15와 35(그림2)사이의 임계값을 초과하는 형광의 기하급수적 증가를 나타낸다. 양면 위치에 증폭이 없는 경우 분석에서 샘플 우물을 제외합니다.
    참고: 증폭 플롯이 비정상으로 보이거나 NTC가 증폭을 나타내는 경우 제조업체의 문제 해결 가이드에 따라 문제를 식별하고 해결합니다.
  17. 계측기 시스템소프트웨어(12)에서복제와 다른 정량화 주기(Cq) 값으로 이상값을 제외한다. 이상값은 잘못된 HRM 결과를 생성할 수 있습니다.
  18. 유도체 용융 곡선에서 사전 및 후 용융 영역/온도 선을 검토합니다. 녹는 전 및 후 지역은 형광 수준에 큰 봉우리 나 경사가없는 평평한 지역 내에 있어야합니다(그림 3). 필요한 경우 그에 따라 조정합니다. 연동 후 온도선의 시작 및 정지를 서로 약 0.5°C 떨어져설정(도 3). 분석 버튼을 클릭하여 매개 변수가 조정되면 분석을 다시 시작합니다.
  19. 차이 플롯 탭에서 플롯 설정 탭에서 복제된 야생식 컨트롤(homozygote) 중 하나를 참조 DNA로 선택하고 분석 버튼을 클릭하여 분석을 다시 시작합니다.
  20. 정렬된 용융 곡선 탭에서 모든 양수 컨트롤에 올바른 유전자형이 있고 NTC가 증폭하지 않았는지 확인합니다(그림4). 웰 테이블에서 양수 컨트롤이 포함된 웰을 선택하여 해석 플롯에서 해당 용융 곡선을 강조 표시합니다. 선의 색상이 올바른 유전자형에 해당하는지 확인합니다. 다른 양수 컨트롤 및 NTC를 포함하는 우물에 대한 단계를 반복합니다.
  21. 정렬된 용융 곡선 탭에서 알 수 없는 샘플에 대한 플롯 디스플레이를 주의 깊게 검토하고 컨트롤을 위한 플롯 디스플레이와 비교합니다(그림4). 웰 테이블에서 알 수 없는 샘플 복제를 포함하는 웰을 선택하고, 용융 곡선의 색상을 확인하고, 양수 컨트롤을 하나씩 포함하는 우물을 선택하여 정렬된 순서로 컨트롤과 정렬합니다. 알 수 없는 모든 샘플에 대한 프로세스를 반복합니다.
    참고: 알 수 없는 샘플에는 용융 곡선이 단단히 정렬된 경우 컨트롤 중 하나의 변형이 포함되어 있습니다. 상이체 그룹(상이한 색)은 알 수 없는 샘플이컨트롤(그림 8)에해당되지 않는 알 수 없는 변형으로 구성되어 있음을 나타내는 표시될 수 있다. 체세포 유전 적 변이체의 낮은 수준은 환자의 샘플에 존재할 수 있습니다. 이는 특히 분석의 검출한계(도 9)에서HRM 결과의 해석에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 경우, 선의 색상이나 모양은 야생 형 유전자형의 색상과 유사 할 수 있습니다.
    1. 결과가 결정적이지 않으면 HRM 결과를 아가로즈 겔 전기포진 및 시퀀싱 방법의 결과와 결합합니다. 필요한 경우 시료 또는 요청을 다시 테스트하고 새 샘플을 다시 테스트합니다.
    2. 데이터 집합을 신중하게 검토하여 곡선을 복제하고 그룹 내에서 각 복제의 정렬이 타이트한지 확인합니다. 그룹의 다른 샘플(이상값)과 긴밀하게 정렬되지 않는 경우 복제를 제외합니다. 더 많은 이상치가 존재하고 결과가 결정적이지 않은 경우 샘플을 다시 테스트합니다. DNA 샘플의 양과 품질이 HRM 결과에 영향을 미친다는 점에 유의하십시오.
  22. 차이 플롯 탭에서 알 수 없는 샘플의 결과를 분석합니다. 단계 1.21에 설명된 절차를 반복하고 알 수 없는 샘플에 대해 얻은 결과가 동일한지 확인합니다.
  23. 그런 다음, 아가로즈 젤에 qPCR HRM 제품을 실행한다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다. 플레이트를 4°C에서 24시간 이상 또는 -20°C에서 더 긴 기간 동안 저장하지만 7일 이상 보관하십시오. 4°C에 저장된 플레이트를 RT로 따뜻하게 한 다음 플레이트를 실행하기 전에 잠시 회전합니다. 20°C에 저장된 플레이트를 허용하여 RT로 해동하고 따뜻하게 한 다음 플레이트를 실행하기 전에 간단히 회전합니다.

2. 아가로즈 젤 전기포레시스

  1. qPCR HRM 제품을 적절한 겔 전기포고시스템을 이용하여 형광핵산 얼룩을 함유한 4% 아가로즈 프리캐스트 젤에 실행한다(재료표, 도 5참조). 하나의 양수, 음수, NTC 및 샘플 qPCR HRM 복제만 실행합니다.
    참고: 젤을 취급할 때는 항상 장갑을 착용해야 합니다. 다른 어떤 겔 전기지질 시스템은 동등한 아가로즈 백분율, 형광 핵산 얼룩 및 웰 포맷이 선택되면 이러한 목적을 달성할 수 있다.
  2. 제조업체의 프로토콜에 따라 젤 전기 전광 시스템을 실행합니다(재료 표참조). 패키지에서 카세트의 프리 캐스트 젤을 제거하고 빗을 제거하고 제조업체의 지침에 따라 장치에 삽입하십시오 (재료 표참조).
    참고: 패키지를 여은 후 15분 이내에 젤을 로드합니다.
  3. 10 μL 샘플을 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O. 희석 시료 20 μL로 각각 잘 희석하여 20 μL로 희석합니다.
  4. 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O (재료의 표참조)와 20 μL에 DNA 크기 표준 용액의 3 μL을 희석. 희석 된 DNA 크기 표준 용액의 20 μL(도 6)으로M을 잘 로드합니다.
  5. 빈 우물을 멸균, RNase 및 DNase 무료 H2O로 채웁니다.
  6. 즉시 실행되는 젤의 백분율에 따라 프로그램을 선택하고 장치의 런타임을 10분으로 설정합니다.
  7. GO 버튼을 눌러 시료를 적재한 후 1분 이내에 전기전도를 시작합니다. 충분한 분해능을 얻을 경우 전기전도 시간을 연장할 수 있다.
    참고: 제조업체의 지침에 따라 권장되는 최대 아가로즈 전기전도 실행 시간을 초과하지 마십시오.
  8. 전기전경이 완료되면 청색광 또는 UV 트랜스실린화를 사용하여 젤내DNA를 시각화합니다. 전기 전도 영상을 시각화, 분석 및 저장하는 것은 대부분 사진 문서화시스템(그림 5)을사용하는 젤 이미저에 의해 수행됩니다.
  9. 알 수 없는 샘플의 결과를 양수 대조군(도7 및 도 8)과비교하여 시각화된 qPCR HRM 제품 젤 패턴을 분석하고 해석한다.
  10. 알 수 없는 시료 HRM 및 겔 전기전도 결과가 알려지지 않은 유전적 변이체가 존재한다는 것을 나타내면,13에기재된 프로토콜에 따라 재료표에 기재된 프라이머를 사용하여 qPCR HRM 제품을 서열한다.
    주의: 형광 핵산 얼룩을 함유한 아가로즈 젤은 기관 규정에 따라 적절히 폐기되어야 합니다.

결과

모든 복제된 샘플 및 대조군(그림2)에서주기 15및 35 사이의 임계값과 매우 좁은 값사이의 임계값을 초과하는 형광의 기하급수적 증가와 함께 성공적으로 증폭된 DNA 영역은 HRM 분석에 의한 유전적 이체의 신뢰성 있는 식별을 위한 전제 조건이다. 이것은 형광 염색을 가진 DNA의 정확한 측정 및 qPCR HRM 실험에 있는 DNA의 동등한 양을 사용하여 달성됩니다 (단계 1.2 참조).

토론

DNA의 고해상도 용융은 유전화 및 유전 적 변이체 스캐닝14에대한 간단한 솔루션이다. 그것은 용융 곡선의 모양을 변경 하는 heteroduplexes 귀착되는 시퀀스 차이에 따라 달라 집니다. 다양한 주파수를 가진 유전이체의 상이한유형은 암1, 2,15,16,10을가진 환자의 특정 집단에 대한 ...

공개

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

저자는 전문 혈액학 연구소, 혈액학학과, 내과, 대학 의료 센터 류블랴나의 모든 학술 전문가와 직원에게 감사드립니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
E-Gel EX 4% AgaroseInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG401004
Fuorometer 3.0 QUBITInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo KitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2XApplied Biosystem, Thermo Fischer Scientific4415440Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4346907
MicroAmp Optical adhesive filmApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4311971
NuGeniusSyngeneNG-1045Gel documentation systems
Primer CALRex9 ForwardEurofins GenomicsSequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 ReverseEurofins GenomicsSequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51306DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay TubesInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32856
QUBIT dsDNA HS assayInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32854
Trackit 100bp DNA LadderInvitrogen, Thermo Fischer Scientific10488058Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4453534
Water nuclease freeVWR, Life Science436912CRNase, DNase and Protease free water

참고문헌

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