JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genetik varyant tespiti için hassas ve hızlı bir çözümdür. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. HRM ve agarose jel elektroforezi taranarak, indels gibi farklı genetik varyantlar tanımlanabilir.

Özet

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genotipleme ve genetik varyasyon taraması için güçlü bir yöntemdir. Çoğu HRM uygulaması, dizi farklılıklarını algılayan DNA boyalarını ve erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexleri doyurma işlemine bağlıdır. Bir varyantı veya genotipi tanımlayan küçük erime eğrisi farklılıklarını tanımlamak için mükemmel cihaz çözünürlüğü ve özel veri analizi yazılımı gereklidir. Philadelphia kromozomu-negatif miyeloproliferatif neoplazmları olan hastalarda, kanser başta olmak üzere belirli bir hastalığı olan hastalara özgü gende ve CALR geninde farklı frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir. İlgi geninde tek nükleotid değişiklikleri, eklemeler ve/veya silmeler (indels) HRM analizi ile tespit edilebilir. Farklı genetik varyant türlerinin tanımlanması çoğunlukla qPCR HRM testinde kullanılan kontrollere dayanmaktadır. Bununla birlikte, ürün uzunluğu arttıkça, vahşi tip ve heterozygot eğrileri arasındaki fark küçülür ve genetik varyant türünü belirlemek daha zordur. Bu nedenle, indellerin ilgi geninde beklenen yaygın genetik varyant olduğu durumlarda, HRM sonucunun netleşmesi için agarose jel elektroforezi gibi ek bir yöntem kullanılabilir. Bazı durumlarda, sonuçsuz bir sonuç standart Sanger dizilimi tarafından yeniden denetlenmeli/yeniden teşhis edilmelidir. Bu retrospektif çalışmada yöntemi MPN'li JAK2 V617F negatif hastalara uyguladık.

Giriş

Kalretikülin geninde(CALR)somatik genetik varyantlar 2013 yılında esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozis1,2gibi miyeloproliferatif neoplazmları (MPN) olan hastalarda tanınmıştır. O zamandan beri, CALR geninde 50'den fazla genetik varyant keşfedildi ve bu da +1 (−1+2) çerçeve3'üindükledi. En sık görülen iki CALR genetik varyantı 52 bp silmedir (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), tip 1 mutasyonu ve 5 bp ekleme (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), tip 2 mutasyonu olarak da adlandırılır. Bu iki genetik varyant tüm CALR genetik varyantlarının %80'ini temsil eder. Diğerleri, vahşi tip CALR4'eyakın bir α sarmalının korunmasına dayanan algoritmalar kullanılarak tip 1 gibi veya tip 2 gibi sınıflandırılmıştır. Burada, CALR genetik varyant tespiti için son derece hassas ve hızlı yöntemlerden biri olan yüksek çözünürlüklü erime analiz yöntemini (HRM) sunuyoruz. Bu yöntem, CALR mutasyonlarının çoğunluğunu temsil eden tip 1 ve tip 2 genetik varyantların hızlı bir şekilde algılanmasını sağlar5. HRM, 1997 yılında V Leiden6faktöründeki mutasyonu tespit etmek için bir araç olarak gerçek zamanlı »polimeraz zincir reaksiyonu« (qPCR) ile birlikte tanıtıldı. Altın standart tekniği temsil eden Sanger dizilimine kıyasla, HRM daha hassas ve daha az spesifik bir yöntemdir5. HRM yöntemi, çok sayıda numunenin hızlı bir şekilde analizini sağlayan iyi birtarama yöntemidir. Floresan boya varlığında gerçekleştirilen basit bir PCR yöntemidir ve belirli beceriler gerektirmez. Başka bir fayda, prosedürün kendisinin, numuneyi HRM prosedüründen sonra elektroforezi veya Sanger dizilemesi için yeniden kullanmamızı sağlayan analiz edilen örneğe zarar vermemesi veya yoketmemesidir 7. Tek dezavantajı, bazen sonuçları yorumlamanın zor olmasıdır. Ek olarak, HRM tip 1 veya tip 2 mutasyonu olmayan hastalarda tam mutasyonu tespit etmez8. Bu hastalarda Sanger dizilimi yapılmalıdır(Şekil 1).

HRM, çift iplikli DNA'ya (dsDNA) dahil edilen doygun DNA floresan boyası varlığında spesifik DNA bölgesinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Floresan boya, dsDNA'ya dahil edildiğinde ışık yayar. Sıcaklıkta ilerleyici bir artış sonrasında dsDNA, erime eğrisinde floresan yoğunluğunda ani bir azalma olarak tespit edilebilen tek iplikli DNA'ya ayrılır. Erime eğrisinin şekli mutasyonu tespit etmek için kullanılan DNA dizisine bağlıdır. Örneklerin erime eğrileri, bilinen mutasyonların veya vahşi tip CALR'nin erime eğrileriyle karşılaştırılır. Farklı erime eğrileri tip 1 veya tip 2 9 olmayan farklı bir mutasyonu temsileder.

10'danönce yayınlanan retrospektif çalışmada HRM, agarose jel elektroforezi vedizileme yöntemi ile CALR geninde somatik genetik varyant tespiti algoritması kullanılmıştır ve doğrulanmıştır.

Protokol

Çalışma Slovenya Cumhuriyeti Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler Helsinki bildirgesine uygundu.

1. HRM tarafından floresan bazlı nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve qPCR sonrası analiz

  1. Malzeme Tablosunda listelenen astarları steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile 100 μM'ye yeniden sunun(bkz. Malzeme Tablosu). 10 μM çalışma konsantrasyon astarı yapın. Protokolde kullanılan primerler2'denönce yayınlanmıştır.
  2. Quantitat granülositler DNA'yı üreticinin talimatı11'i takiben floresan boyama yöntemiyle (bkz. Malzeme Tablosu). 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 kullanarak 20 ng/μL DNA çözeltisi hazırlayın(bkz. Malzeme Tablosu).
    1. DNA örneklerine ek olarak, en az üç DNA kontrolü hazırlayın: NM_004343.3 (CALR) ile iki pozitif kontrol : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp silme veya tip 1 mutasyon) ve NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp ekleme veya tip 2 mutasyon) genetik varyantı, ayrıca şablon olmayan (NTC) kontrol olarak vahşi tip DNA ve negatif kontrol.
      NOT: HRM kurulumunu gerçekleştirmeden önce, qPCR aygıtının HRM denemeleri için kalibre edilmiş olduğunu onaylayın.
  3. Üretici protokolüne göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)aşağıdaki gibi: 10 μL 2x qPCR Ana Boya ile Karışımı, 0.2 μL 10 μM İleri Astar, 0.2 μL 10 μM Ters Astar, 8.6 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O. Malzeme Masasındanastarları kullanın. Her DNA örneği ve kontrolü için üç kopya çalıştırın.
    1. İşlenmekteki numune sayısına göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın. Reaktif aktarımları sırasında oluşan kayıp için fazla hacim sağlamak üzere hesaplamalara en az %10'luk fazla hacim ekleyin.
  4. Tüpe hafifçe dokunup ters çevirerek reaksiyon içeriğini karıştırın ve 2-3 sn boyunca girdaplayın. Tüpün duvarından dibe kadar tüm dağınık damlacıkları kısa bir dönüşle toplayın.
  5. Cihaz ve HRM deneyi için uygun bir reaksiyon plakası hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). qPCR HRM Master Mix'in 19 μL'lik kısmını 96 kuyulu optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına aktarın.
  6. Negatif kontrollerin, pozitif kontrollerin ve numunelerin pipet 1 μL'si optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına. NTC için, DNA yerine qPCR HRM Master Mix'i hazırlamak için kullanılan1 μLsteril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O aktarın.
  7. Reaksiyon plakasını optik yapışkan filmle kapatın. Çalıştırma sırasında buharlaşmayı önlemek için sıkıca yapın. Doğru floresan algılamasını sağlamak için optik yapışkan filmin reaksiyon plakasındaki tüm kuyularda düzlem olup olmadığını kontrol edin.
  8. Reaksiyon plakasını oda sıcaklığında (RT) 780 x g'da 1 dakika döndürün. Sıvının reaksiyon plakasındaki kuyuların dibinde olup olmadığını kontrol edin. Tahlilleri çalıştırmaya devam edin.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat saklayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün.
  9. Üreticinin talimatına göre, DNA'yı yükseltmek ve eritmek ve qPCR cihazında HRM floresan verileri oluşturmak için koşuyu hazırlayın ve başlatın. Cihaz sistemi yazılımında, kontrolleri ve örnekleri uygun kuyulara atayın.
  10. CALR genetik varyant tespiti için, varsayılan cihaz amplifikasyon protokolünü değiştirin ve aşağıdaki termal bisiklet protokolünü kullanarak DNA'yı güçlendirin: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 10 s için 95 °C ve 60 s için 62,5 °C'lik 50 döngü.
  11. Üreticinin talimatlarına göre qPCR'den hemen sonra eriyik eğrisi/ayrışma (HRM) aşamasını gerçekleştirin12 aşağıdaki gibi: 10 s için 95 °C, 1 dakika için 60 °C ve ardından 95 °C'ye kadar 0,025 °C/s rampa hızı. Sıcaklığı 15 s için 95 °C'de ve 15 sn için 60 °C'de tutun.
  12. Çalıştırma otomatik olarak sona erer. İlk olarak, büyütme grafiğini gözden geçirin ve doğrulayın (Şekil 2).
  13. Cihaz sistemi yazılımının deneme menüsünde, amplifikasyon çizim seçeneğini seçin. Veri görüntülenmiyorsa, Çözümleyeşil düğmesini tıklatın.
    1. Amplifikasyon çizimi sekmesinde, çizim türü açılan menüsünden, döngü numarasının (ΔRn vs Döngü) bir işlevi olarak pasif referanstan (ΔRn) floresan'a normalleştirilen ham floresan okumaları olarak amplifikasyon verilerini görüntüleyen çizimi seçin. Çizim rengi açılan menüsünde Örnek 'iseçin.
  14. Grafik türü açılır menüsünden doğrusal amplifikasyon grafik türünü seçin. Taban çizgisi başlangıç seçeneğini belirleyerek doğrusal amplifikasyon grafiğinde taban çizgisi başlangıç ve bitiş döngüsünü gösterin. Taban çizgisinin doğru ayarlı olduğunu doğrulayın. Uç döngü, önemli floresan sinyalin algılandığı döngü numarasından önce birkaç döngü ayarlanmalıdır. Taban çizgisi genellikle 3 ila 15 döngü arasında ayarlanır (Şekil 2).
  15. Grafik türü açılan menüsünden log10 amplifikasyon grafik türünü seçin. Eşik seçeneğini belirleyerek grafikteki eşik çizgisini gösterin. Doğru ayarlanmazsa eşiği buna göre ayarlayın. Doğru ayarlanmış eşik, eşik çizgisinin qPCR eğrilerinin üstel aşamasını geçtiği anlamına gelir (Şekil 2).
  16. Normal amplifikasyon eğrilerinin tüm numune ve pozitif kontrol kuyularında olduğunu doğrulayın. Döngü 40'dan önce NTC kuyularında amplifikasyon olmadığını doğrulayın. Normal bir amplifikasyon grafiği, floresanda 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan üstel bir artış gösterir (Şekil 2). Kuyu pozisyonunda amplifikasyon yoksa numune kuyularını analizden hariç tutun.
    NOT: Amplifikasyon grafiği anormal görünüyorsa veya NTC amplifikasyonu iyi gösteriyorsa, üreticinin sorun giderme kılavuzuna göre sorunu tanımlayın ve çözün.
  17. Enstrüman sistemi yazılımında 2'den fazla çoğaltmadan farklı olan nicelik döngüsü (Cq) değeri ile aykırı değeri hariç tutun12. Aykırılıklar hatalı HRM sonuçları üretebilir.
  18. Türev erime eğrilerinde, erime öncesi ve sonrası bölgeleri/sıcaklık çizgilerini gözden geçirin. Erime öncesi ve sonrası bölgeler floresan seviyelerinde büyük piklerin veya eğimlerin olmadığı düz bir alan içinde olmalıdır(Şekil 3). Gerekirse ona göre ayarlayın. Erime öncesi ve sonrası sıcaklık çizgilerinin başlangıç ve durağını birbirinden yaklaşık 0,5 °C aralıkla ayarlayın (Şekil 3). Parametreler Analiz Et düğmesine tıklayarak ayarlanırsa analizi yeniden başlatın.
  19. Fark çizimi sekmesinde, çizim ayarları sekmesinde, referans DNA'sı olarak çoğaltılan vahşi tür denetiminden (homozygote) birini seçin ve Analiz Et düğmesine tıklayarak analizi yeniden başlatın.
  20. Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, tüm pozitif denetimlerin doğru genotipe sahip olduğunu ve NTC'nin yükseltilemediğini onaylayın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, analiz çizimlerinde karşılık gelen erime eğrisini vurgulamak için pozitif bir kontrol içeren kuyuları seçin. Çizginin renginin doğru genotipe karşılık geldiğini onaylayın. Diğer pozitif kontrolleri ve NTC'yi içeren kuyular için adımları yineleyin.
  21. Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, bilinmeyen örneklerin çizim ekranlarını dikkatlice gözden geçirin ve kontroller için çizim ekranlarıyla karşılaştırın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, bilinmeyen örnek çoğaltmalarını içeren kuyuları seçin, eriyik eğrisinin rengini kontrol edin ve pozitif kontroller içeren kuyuları tek tek seçerek sıralı bir sırayla kontrollerle hizalayın. Bilinmeyen tüm örnekler için işlemi yineleyin.
    NOT: Bilinmeyen örnek, erime eğrisi ona sıkıca hizalanmışsa kontrollerden birinin varyantını içerir. Bilinmeyen örneğin kontrollere karşılık gelen bilinmeyen bir varyantdan oluştuğunu gösteren farklı varyant grupları (farklı renkler) görüntülenebilir (Şekil 8). Hastanın örneğinde düşük düzeyde somatik genetik varyant bulunabilir. Bu, özellikle tahlil tespit sınırında İkM sonucunun yorumlanmasını etkileyebilir (Şekil 9). Bu durumlarda, çizginin rengi ve hatta şekli vahşi tip genotipine çok benzeyebilir.
    1. Sonuç sonuçsuz kaldığında, HRM sonuçlarını agarose jel elektroforezi ve dizileme yöntemlerinin sonuçlarıyla birleştirin. Örneği veya isteği yeniden test edin ve gerekirse yeni bir örneği yeniden test edin.
    2. Eğrileri çoğaltmak için veri kümesini dikkatlice gözden geçirin ve grup içindeki her çoğaltmanın hizalamasının sıkı olup olmadığını kontrol edin. Gruptaki diğer örneklerle (aykırı) sıkıca hizalanmamışsa, yinelemeyi hariç tutun. Daha fazla aykırılık varsa ve sonuçlar sonuçsuzsa örneği yeniden test edin. DNA örneğinin miktarının ve kalitesinin İkM sonuçlarını etkilediğini unutmayın.
  22. Fark çizimi sekmesinde bilinmeyen örnek için sonucu çözümle. 1.21 adımında açıklanan yordamı yineleyin ve bilinmeyen örnek için elde edilen sonuçların aynı olduğunu doğrulayın.
  23. Ardından, qPCR HRM ürünlerini agarose jel üzerinde çalıştırın.
    NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat veya -20 °C'de daha uzun bir süre, ancak 7 günden fazla saklamayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün. - 20 °C'de depolanan plakanın çözülmesine ve RT'ye ısınmasına izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün.

2. Agarose jel elektroforezi

  1. QPCR HRM ürünlerini uygun jel elektroforez sistemini kullanarak floresan nükleik asit lekesi içeren% 4 agarose ön döküm jel üzerinde çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu , Şekil 5). Yalnızca bir pozitif, negatif, NTC ve örnek qPCR HRM çoğaltması çalıştırın.
    NOT: Jelleri kullanırken eldivenler her zaman giyilmelidir. Eşdeğer agarose yüzdesi, floresan nükleik asit lekesi ve kuyu formatı seçilirse, başka herhangi bir jel elektroforezi sistemi bu amacı yerine getirebilir.
  2. Jel elektroforezi sistemini üreticinin protokolüne göre çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu). Kasetteki ön döküm jeli paketten çıkarın, tarağı çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre cihaza yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
    NOT: Paketi açtıktan sonraki 15 dakika içinde jeli yükleyin.
  3. 10 μL'lik bir numuneyi steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile20μL'ye seyreltin.
  4. Steril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O ile 3 μL DNA boyutu standart çözeltisini20μL'ye seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). M'yi 20 μL seyreltilmiş DNA boyutu standart çözeltisi ile iyi yükleyin (Şekil 6).
  5. Boş kuyuları 20 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O ile doldurun.
  6. Çalıştırılan jelin yüzdesine göre programı hemen seçin ve cihazdaki çalışma süresini 10 dakika olarak ayarlayın.
  7. GO düğmesine basarak elektroforezi yükleme örneğinden 1 dakika sonra başlatın. Yetersiz çözünürlük elde edilirse elektroforezi süresi uzatılabilir.
    NOT: Üreticinin talimatlarına göre önerilen maksimum agarose elektroforez çalışma süresini aşmayın.
  8. Elektroforez tamamlandığında, mavi ışık veya UV transillumination kullanarak jeldeki DNA'yı görselleştirin. Elektroforez görüntülerinin görselleştirilmesi, analizlenmesi ve saklanması çoğunlukla foto-dokümantasyon sistemine sahip bir jel görüntüleyiç tarafından yapılır (Şekil 5).
  9. Bilinmeyen numunenin sonuçlarını pozitif kontrollerle karşılaştırarak görselleştirilmiş qPCR HRM ürünleri jel desenini analiz edin ve yorumlayın (Şekil 7 ve Şekil 8).
  10. Bilinmeyen örnek HRM ve jel elektroforez sonuçları bilinmeyen bir genetik varyantın mevcut olduğunu gösteriyorsa, açıklanan protokole göre Malzeme Tablosunda açıklanan astarları kullanarak qPCR HRM ürününü sıralayın13.
    DİkKAT: Floresan nükleik asit lekesi içeren agarose jelleri kurum yönetmeliklerine uygun şekilde atılmalıdır.

Sonuçlar

Tüm çoğaltılmış örnek ve kontrollerde 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği ve nicelik döngüsünün çok dar değerlerini aşan üstel bir floresan artışı ile ilgi çekici DNA bölgesi başarıyla güçlendirilmişTIR (Şekil 2), genetik varyantların HRM analizi ile güvenilir bir şekilde tanımlanması için bir ön koşuldur. Bu, qPCR HRM deneyinde floresan boyama ile DNA'nın kesin bir şekilde belirlenmesi ve eşit miktarda DNA kullanılarak elde edilir (bkz. adım 1.2)....

Tartışmalar

DNA'nın yüksek çözünürlüklü erimesi genotipleme ve genetik varyant taraması için basit bir çözümdür14. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. Kanserli belirli bir grup hastaya özgü gende çeşitli frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir 1,2,15,16,

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, Ljubljana Üniversitesi Tıp Merkezi, İhtisas Hematoloji Laboratuvarı, Hematoloji Bölümü, İç Hastalıkları Anabilim Dalı'ndaki tüm akademik uzmanlara ve çalışanlara teşekkür eder.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
E-Gel EX 4% AgaroseInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG401004
Fuorometer 3.0 QUBITInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo KitInvitrogen, Thermo Fischer ScientificG6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2XApplied Biosystem, Thermo Fischer Scientific4415440Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4346907
MicroAmp Optical adhesive filmApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4311971
NuGeniusSyngeneNG-1045Gel documentation systems
Primer CALRex9 ForwardEurofins GenomicsSequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 ReverseEurofins GenomicsSequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini KitQIAGEN51306DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay TubesInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32856
QUBIT dsDNA HS assayInvitrogen, Thermo Fischer ScientificQ32854
Trackit 100bp DNA LadderInvitrogen, Thermo Fischer Scientific10488058Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR SystemApplied Biosystems, Thermo Fischer Scientific4453534
Water nuclease freeVWR, Life Science436912CRNase, DNase and Protease free water

Referanslar

  1. Nangalia, J., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).
  2. Klampfl, T., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).
  3. Vainchenker, W., Kralovics, R. Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms. Blood. 129, 667-679 (2017).
  4. Pietra, D., et al. Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms. Leukemia. 30, 431-438 (2016).
  5. Lim, K. H., et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).
  6. Lay, M. J., Wittwer, C. T. Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR. Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).
  7. Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening. Human Mutation. 30, 860-866 (2009).
  8. Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis. Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).
  9. Reed, G. H., Wittwer, C. T. Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis. Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).
  10. Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms. Scientific Reports. 9, 19838 (2019).
  11. Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. . QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).
  12. Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. . High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).
  13. Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. . High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).
  14. Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics. Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).
  15. Gonzalez-Bosquet, J., et al. Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers. PLoS One. 6, 14522 (2011).
  16. Van Der Stoep, N., et al. Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner. Human Mutation. 30, 899-909 (2009).
  17. Singdong, R., et al. Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms. Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).
  18. Erali, M., Wittwer, C. T. High resolution melting analysis for gene scanning. Methods. 50, 250-261 (2010).
  19. Bilbao-Sieyro, C., et al. High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations. PLoS One. 9, 103511 (2014).
  20. Słomka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies. International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).
  21. Li, X., et al. Comparison of three common DNA concentration measurement methods. Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).
  22. Voytas, D. Agarose Gel Electrophoresis. Current Protocols in Immunology. 2, (1992).
  23. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).
  24. Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. Analysis of Endonuclease R·EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis. Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

GenetikSay 162Y ksek z n rl kl erime analizifloresan bazl nicel ger ek zamanl polimeraz zincir reaksiyonugenetik varyantpre cast agarose jel elektroforeziindel somatik mutasyonheteroduplex taramaCALR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır