Rilevamento di varianti genetiche nel gene CALR utilizzando l'analisi di fusione ad alta risoluzione

Riepilogo

L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è una soluzione sensibile e rapida per il rilevamento di varianti genetiche. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Combinando l'elettroforesi hrM e gel di agarosio, è possibile identificare diversi tipi di varianti genetiche come gli indel.

Abstract

L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è un metodo potente per la genotipizzazione e la scansione delle variazioni genetiche. La maggior parte delle applicazioni HRM dipende da coloranti a DNA saturo che rilevano differenze di sequenza ed eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Sono necessari un'eccellente risoluzione dello strumento e uno speciale software di analisi dei dati per identificare le piccole differenze della curva di fusione che identificano una variante o un genotipo. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per i pazienti con una malattia specifica, in particolare il cancro e nel gene CALR nei pazienti con neoplasie mieloproliferative negative al cromosoma Philadelphia. Singoli cambiamenti nucleotidici, inserzioni e/o delezioni (indels) nel gene di interesse possono essere rilevati dall'analisi HRM. L'identificazione di diversi tipi di varianti genetiche si basa principalmente sui controlli utilizzati nel test qPCR HRM. Tuttavia, con l'aumentare della lunghezza del prodotto, la differenza tra curve wild-type ed eterozigoti diventa più piccola e il tipo di variante genetica è più difficile da determinare. Pertanto, laddove gli indels sono la variante genetica prevalente attesa nel gene di interesse, un metodo aggiuntivo come l'elettroforesi su gel di agarosio può essere utilizzato per la chiarificazione del risultato HRM. In alcuni casi, un risultato inconcludente deve essere ricontrollato/ri-diagnosticato mediante sequenziamento Sanger standard. In questo studio retrospettivo, abbiamo applicato il metodo a pazienti JAK2 V617F-negativi con MPN.

Introduzione

Varianti genetiche somatiche nel gene della calreticulina (CALR) sono state riconosciute nel 2013 in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN) come trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria^1,2. Da allora, sono state scoperte più di 50 varianti genetiche nel gene CALR, inducendo un +1 (−1+2) frameshift³. Le due varianti genetiche CALR più frequenti sono una delezione di 52 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52,p.(Leu367Thrfs*46)), chiamata anche mutazione di tipo 1, e un'inserzione di 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC,p.(Lys385Asnfs*47)), chiamata anche mutazione di tipo 2. Queste due varianti genetiche rappresentano l'80% di tutte le varianti genetiche CALR. Gli altri sono stati classificati come tipo 1 o tipo 2 utilizzando algoritmi basati sulla conservazione di un'elica α vicino al tipo selvaggio CALR⁴. Qui, presentiamo uno dei metodi altamente sensibili e rapidi per il rilevamento delle varianti genetiche CALR, il metodo di analisi della fusione ad alta risoluzione (HRM). Questo metodo consente la rapida individuazione di varianti genetiche di tipo 1 e di tipo 2, che rappresentano la maggior parte delle mutazioni CALR ⁵. HRM è stato introdotto in combinazione con la "reazione a catena della polimerasi" in tempo reale (qPCR) nel 1997 come strumento per rilevare la mutazione nel fattore V Leiden⁶. Rispetto al sequenziamento Sanger che rappresenta la tecnica golden standard, HRM è un metodo più sensibile e meno specifico⁵. Il metodo HRM è un buon metodo di screening che consente un'analisi rapida di un gran numero di campioni con un grande rapporto costi-benefici⁵. Si tratta di un semplice metodo di PCR eseguito in presenza di un colorante fluorescente e non richiede competenze specifiche. Un altro vantaggio è che la procedura stessa non danneggia o distrugge il campione analizzato che ci consente di riutilizzare il campione per l'elettroforesi o il sequenziamento Sanger dopo la procedura HRM⁷. L'unico svantaggio è che a volte è difficile interpretare i risultati. Inoltre, HRM non rileva la mutazione esatta nei pazienti con mutazioni non di tipo 1 o di tipo^{2 8}. In questi pazienti deve essere eseguito il sequenziamento Con Sanger (Figura 1).

L'HRM si basa sull'amplificazione della specifica regione del DNA in presenza di colorante fluorescente saturante di DNA, che è incorporato nel DNA a doppio filamento (dsDNA). Il colorante fluorescente emette luce quando incorporato nel dsDNA. Dopo un progressivo aumento della temperatura, il dsDNA si scompone in DNA a singolo filamento, che può essere rilevato sulla curva di fusione come un'improvvisa diminuzione dell'intensità di fluorescenza. La forma della curva di fusione dipende dalla sequenza di DNA utilizzata per rilevare la mutazione. Le curve di fusione dei campioni vengono confrontate con le curve di fusione di mutazioni note o CALR di tipo selvatico. Curve di fusione distinte rappresentano una mutazione diversa che non è di tipo 1 o di tipo 2⁹.

L'algoritmo per la rilevazione di varianti genetiche somatiche nel gene CALR mediante HRM, elettroforesi su gel di agarosio e metodo di sequenziamento (Figura 1) è stato utilizzato e convalidato nello studio retrospettivo pubblicato prima del¹⁰.

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Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato di Etica Medica della Repubblica di Slovenia. Tutte le procedure erano conformi alla dichiarazione di Helsinki.

1. Pcr quantitativa in tempo reale (qPCR) basata sulla fluorescenza e analisi post-qPCR da parte di HRM

1. Sostituire i primer elencati nella Tabella dei materiali a 100 μM con H₂O sterile, RNasi e DNasi free (vedi Tabella dei materiali). Fare un primer a concentrazione di lavoro da 10 μM. I primer utilizzati nel protocollo sono stati pubblicati prima di².
2. Quantitare il DNA dei granulociti con il metodo di colorazione a fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore¹¹ (vedere Tabella dei materiali). Preparare una soluzione di DNA da 20 ng/μL utilizzando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (vedi Tabella dei materiali).
   1. Oltre ai campioni di DNA, preparare almeno tre controlli del DNA: due controlli positivi con il NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp delezione o mutazione di tipo 1) e NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp insertion o type 2 mutation), nonché dna wild-type e controllo negativo come controllo non-template (NTC).
      NOTA: prima di eseguire la configurazione HRM, verificare che lo strumento qPCR sia calibrato per gli esperimenti HRM.
3. Preparare qPCR HRM Master Mix secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali)come segue: 10 μL di 2x qPCR Master Mix con colorante, 0,2 μL di 10 μM Forward Primer, 0,2 μL di 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL di H₂O sterile, RNasi e DNasi libera. Utilizzare i primer della Tabella dei materiali. Esegui tre repliche per ogni campione di DNA e controllo.
   1. Preparare il qPCR HRM Master Mix in base al numero di campioni in lavorazione. Includere il volume in eccesso di almeno il 10% nei calcoli per fornire un volume in eccesso per la perdita che si verifica durante i trasferimenti di reagenti.
4. Mescolare il contenuto della reazione picchiettando delicatamente e invertendo il tubo e vorticando per 2-3 s. Raccogli tutte le goccioline sparse dalla parete del tubo verso il basso con un breve giro.
5. Preparare una piastra di reazione appropriata per lo strumento e l'esperimento HRM (vedi Tabella dei materiali). Trasferire 19 μL del qPCR HRM Master Mix ai pozzetti appropriati della piastra di reazione ottica a 96 pozzetti.
6. Pipettare 1 μL dei controlli negativi, dei controlli positivi e dei campioni nei pozzetti appropriati della piastra di reazione ottica. Per l'NTC, trasferire 1 μL di H₂O sterile, RNasi e DNasi free utilizzato per preparare il qPCR HRM Master Mix invece del DNA.
7. Sigillare la piastra di reazione con la pellicola adesiva ottica. Fallo con fermezza per evitare l'evaporazione durante la corsa. Verificare che la pellicola adesiva ottica sia piana su tutti i pozzetti della piastra di reazione per garantire il corretto rilevamento della fluorescenza.
8. Ruotare la piastra di reazione a 780 x g a temperatura ambiente (RT) per 1 minuto. Controllare che il liquido si trovi sul fondo dei pozzetti nella piastra di reazione. Procedere all'esecuzione del test.
   NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare la piastra a 4 °C per non più di 24 ore. Lasciare che la piastra conservata a 4 °C si riscaldi a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di farla funzionare.
9. Secondo le istruzioni del produttore, preparare e avviare la corsa per amplificare e fondere il DNA e generare dati di fluorescenza HRM nello strumento qPCR. Nel software del sistema dello strumento, assegnare i controlli e i campioni ai pozzetti appropriati.
10. Per il rilevamento della variante genetica CALR, modificare il protocollo di amplificazione predefinito dello strumento e amplificare il DNA utilizzando il seguente protocollo di ciclo termico: 95 °C per 10 minuti, seguito da 50 cicli di 95 °C per 10 s e 62,5 °C per 60 s.
11. Eseguire lo stadio di curva di fusione/dissociazione (HRM) immediatamente dopo qPCR secondo le istruzioni del produttore¹² come segue: 95 °C per 10 s, 60 °C per 1 min, e quindi una velocità di rampa di 0,025 °C/s fino a 95 °C. Mantenere la temperatura a 95 °C per 15 s e a 60 °C per 15 s.
12. L'esecuzione termina automaticamente. Innanzitutto, rivedere e verificare il grafico di amplificazione (Figura 2).
13. Nel menu esperimento del software del sistema dello strumento, selezionare l'opzione di trama di amplificazione. Se non vengono visualizzati dati, fare clic sul pulsante verde Analizza.
    1. Nella scheda Grafico amplificazione, dal menu a discesa Tipo di trama, selezionare il grafico che visualizza i dati di amplificazione come letture di fluorescenza grezze normalizzate alla fluorescenza dal riferimento passivo (ΔRn) in funzione del numero di ciclo (ΔRn vs Ciclo). Nel menu a discesa colore della stampa, selezionare Campione.
14. Dal menu a discesa Tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione lineare. Visualizzate il ciclo di inizio e fine della linea di base sul grafico di amplificazione lineare selezionando l'opzione di inizio della linea di base. Verificare che la baseline sia impostata correttamente. Il ciclo finale deve essere impostato alcuni cicli prima del numero di ciclo in cui viene rilevato un segnale fluorescente significativo. La linea di base è solitamente impostata da 3 a 15 cicli (Figura 2).
15. Dal menu a discesa Tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione log10. Mostra la linea di soglia sul grafico selezionando l'opzione di soglia. Regolare la soglia di conseguenza se non impostata correttamente. La soglia impostata correttamente significa che la linea di soglia attraversa la fase esponenziale delle curve qPCR (Figura 2).
16. Verificare che le normali curve di amplificazione siano presenti in tutti i pozzi di controllo del campione e positivi. Verificare che non vi sia amplificazione nei pozzi NTC prima del ciclo 40. Un normale grafico di amplificazione mostra un aumento esponenziale della fluorescenza che supera la soglia tra i cicli 15 e 35 (Figura 2). Escludere i pozzetti campione dall'analisi se non vi è amplificazione nella posizione del pozzo.
    NOTA: se il grafico di amplificazione appare anomalo o l'NTC indica bene l'amplificazione, identificare e risolvere il problema in base alla guida alla risoluzione dei problemi del produttore.
17. Escludere il valore anomalo con il ciclo di quantificazione (Cq) che differisce dalle repliche di più di 2 nel software del sistema dello strumento¹². I valori anomali possono produrre risultati HRM errati.
18. Nelle curve di fusione derivate, rivedere le regioni/linee di temperatura pre e post fusione. Le regioni pre e post fusione dovrebbero trovarsi all'interno di un'area pianeggiante in cui non ci sono grandi picchi o pendenze nei livelli fluorescenti (Figura 3). Se necessario, regolarlo di conseguenza. Impostare l'avvio e l'arresto delle linee di temperatura pre e post fusione a circa 0,5 °C di distanza l'una dall'altra (Figura 3). Riavviare l'analisi se i parametri vengono regolati facendo clic sul pulsante Analizza.
19. Nella scheda grafico differenza, nella scheda Impostazioni plottaggio, scegliere uno dei controlli wild-type (omozigote) replicati come DNA di riferimento e riavviare l'analisi facendo clic sul pulsante Analizza.
20. Nella scheda Curve di fusione allineate, verificare che tutti i controlli positivi abbiano il genotipo corretto e che NTC non sia riuscito ad amplificarsi (Figura 4). Dalla tabella dei pozzetti, selezionate i pozzetti contenenti un controllo positivo per evidenziare la curva di fusione corrispondente nei grafici di analisi. Verificare che il colore della linea corrisponda al genotipo corretto. Ripetere i passaggi per i pozzetti contenenti gli altri controlli positivi e NTC.
21. Nella scheda Curve di fusione allineate, esaminare attentamente le visualizzazioni del plottaggio per i campioni sconosciuti e confrontarle con le visualizzazioni del plottaggio per i controlli (Figura 4). Dalla tabella dei pozzi, selezionare i pozzetti contenenti le repliche del campione sconosciuto, controllare il colore della curva di fusione e allinearli con i controlli in una sequenza ordinata selezionando i pozzetti contenenti controlli positivi uno per uno. Ripetere il processo per tutti i campioni sconosciuti.
    NOTA: il campione sconosciuto contiene la variante di uno dei controlli se la sua curva di fusione è strettamente allineata ad esso. È possibile visualizzare diversi gruppi di varianti (colori diversi) che indicano che il campione sconosciuto è costituito da una variante sconosciuta, non corrispondente ai controlli (Figura 8). Un basso livello della variante genetica somatica può essere presente nel campione del paziente. Ciò potrebbe influenzare l'interpretazione del risultato HRM, in particolare al limite di rilevamento del test (Figura 9). In questi casi, il colore o anche la forma della linea potrebbe assomigliare molto a quello del genotipo wild-type.
    1. Quando il risultato è inconcludente, combinare i risultati HRM con i risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio e dei metodi di sequenziamento. Riprovare il campione o richiedere e ritestare un nuovo campione, se necessario.
    2. Esaminare attentamente il set di dati per le curve di replica e verificare che l'allineamento di ciascuna replica all'interno del gruppo sia stretto. Escludere la replica se non si allinea strettamente con gli altri campioni del gruppo (valori anomali). Ritestare il campione se sono presenti più valori anomali e i risultati sono inconcludenti. Essere consapevoli del fatto che la quantità e la qualità del campione di DNA influenzano i risultati HRM.
22. Analizzare il risultato per il campione sconosciuto nella scheda Grafico differenza. Ripetere la procedura descritta nel passaggio 1.21 e verificare che i risultati ottenuti per il campione sconosciuto siano gli stessi.
23. Quindi, eseguire i prodotti qPCR HRM sul gel di agarosio.
    NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare la piastra a 4 °C per non più di 24 ore o a -20 °C per un periodo più lungo ma non superiore a 7 giorni. Lasciare che la piastra conservata a 4 °C si riscaldi a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di farla funzionare. Lasciare scongelare la piastra conservata a - 20 °C e riscaldarla a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di eseguirla.

2. Elettroforesi su gel di agarosio

1. Eseguire i prodotti qPCR HRM su un gel prefabbricato di agarosio al 4% contenente una colorazione di acido nucleico fluorescente utilizzando l'appropriato sistema di elettroforesi su gel (vedere Tabella dei materiali, Figura 5). Eseguire solo una replica HRM qPCR positiva, negativa, NTC e campione.
   NOTA: I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano i gel. Qualsiasi altro sistema di elettroforesi su gel può soddisfare questo scopo se si sceglie la percentuale equivalente di agarosio, la colorazione di acido nucleico fluorescente e il formato del pozzo.
2. Eseguire il sistema di elettroforesi su gel secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali). Rimuovere il gel prefabbricato nella cassetta dalla confezione, rimuovere il pettine e inserirlo nell'apparecchio secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Caricare il gel entro 15 minuti dall'apertura della confezione.
3. Diluire un campione da 10 μL a 20 μL con H₂O sterile, privo di RNasi e DNasi. Caricare ogni pozzetto con 20 μL di campione diluito.
4. Diluire 3 μL di soluzione standard di dimensioni del DNA a 20 μL con H₂O sterile, RNasi e DNasi libera (vedere Tabella dei materiali). Caricare il pozzetto M con 20 μL di soluzione standard di dimensioni del DNA diluito (Figura 6).
5. Riempire eventuali pozzetti vuoti con 20 μL di H₂O sterili, RNasi e DNasi.
6. Selezionare immediatamente il programma in base alla percentuale di gel in esecuzione e impostare il tempo di esecuzione sull'apparecchio su 10 minuti.
7. Avviare l'elettroforesi entro 1 minuto dal caricamento del campione premendo il pulsante GO. Il tempo di elettroforesi può essere esteso se si ottiene una risoluzione insufficiente.
   NOTA: Non superare il tempo massimo raccomandato per l'elettroforesi dell'agarosio secondo le istruzioni del produttore.
8. Quando l'elettroforesi è completata, visualizzare il DNA nel gel utilizzando una luce blu o una transilluminazione UV. La visualizzazione, l'analisi e la memorizzazione delle immagini di elettroforesi sono per lo più eseguite da un imager in gel con sistema di foto-documentazione (Figura 5).
9. Analizzare e interpretare il modello di gel dei prodotti qPCR HRM visualizzato confrontando i risultati del campione sconosciuto con i controlli positivi (Figura 7 e Figura 8).
10. Se i risultati sconosciuti dell'HRM e dell'elettroforesi su gel indicano la presenza di una variante genetica sconosciuta, sequenziare il prodotto qPCR HRM utilizzando primer descritti nella Tabella dei materiali secondo il protocollo descritto¹³.
    ATTENZIONE: I gel di agarosio contenenti una macchia di acido nucleico fluorescente devono essere smaltiti correttamente secondo i regolamenti dell'istituzione.

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Risultati

La regione di interesse del DNA amplificata con successo con un aumento esponenziale della fluorescenza che supera la soglia tra i cicli 15 e 35 e valori molto ristretti del ciclo di quantificazione (Cq) in tutti i campioni e controlli replicati(Figura 2)è un prerequisito per l'identificazione affidabile delle varianti genetiche mediante analisi HRM. Ciò si ottiene utilizzando una determinazione precisa del DNA con colorazione a fluorescenza e una quantità uguale di DNA nell'esperimento q...

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Discussione

La fusione ad alta risoluzione del DNA è una soluzione semplice per la genotipizzazione e la scansione delle varianti genetiche¹⁴. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per un certo gruppo di pazienti con cancro^1,2,15,...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water