Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une solution sensible et rapide pour la détection de variantes génétiques. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes modifiant la forme de la courbe de fusion. En peignant la GRH et l’électrophorèse sur gel d’agarose, différents types de variantes génétiques telles que les indels peuvent être identifiés.

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de variation génétique. La plupart des applications hrm dépendent de colorants ADN saturés qui détectent les différences de séquence et d’hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Une excellente résolution d’instrument et un logiciel spécial d’analyse des données sont nécessaires pour identifier les petites différences de courbe de fusion qui identifient une variante ou un génotype. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour les patients atteints d’une maladie spécifique, en particulier le cancer et dans le gène CALR chez les patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs négatifs du chromosome Philadelphie. Des changements, des insertions et/ou des délétions (indels) d’un seul nucléotide dans le gène d’intérêt peuvent être détectés par l’analyse HRM. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les contrôles utilisés dans le test qPCR HRM. Cependant, à mesure que la longueur du produit augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et le type de variante génétique est plus difficile à déterminer. Par conséquent, lorsque les indels sont la variante génétique prévalente attendue dans le gène d’intérêt, une méthode supplémentaire telle que l’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour clarifier le résultat de la GRH. Dans certains cas, un résultat non concluant doit être revérifié/rediagnostiqué par séquençage de Sanger standard. Dans cette étude rétrospective, nous avons appliqué la méthode à des patients JAK2 V617F négatifs atteints de NPP.

Introduction

Des variantes génétiques somatiques du gène de la calréticuline(CALR)ont été reconnues en 2013 chez des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs (NPP) tels que la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primaire^1,2. Depuis lors, plus de 50 variantes génétiques du gène CALR ont été découvertes, induisant un décalage de trame +1 (−1+2)^3. Les deux variantes génétiques CALR les plus fréquentes sont une délétion de 52 pb (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52,p. (Leu367Thrfs*46)), également appelée mutation de type 1, et une insertion de 5 pb (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs*47)), également appelée mutation de type 2. Ces deux variantes génétiques représentent 80 % de toutes les variantes génétiques du CALR. Les autres ont été classés comme de type 1 ou de type 2 en utilisant des algorithmes basés sur la préservation d’une hélice α proche du type sauvage CALR^4. Nous présentons ici l’une des méthodes très sensibles et rapides pour la détection des variantes génétiques CALR, la méthode d’analyse de fusion à haute résolution (HRM). Cette méthode permet la détection rapide des variantes génétiques de type 1 et de type 2, qui représentent la majorité des mutations CALR ^5. La GRH a été introduite en combinaison avec la « réaction en chaîne par polymérase » (qPCR) en temps réel en 1997 en tant qu’outil de détection de la mutation dans le facteur V de Leiden^6. Par rapport au séquençage de Sanger qui représente la technique de référence, la GRH est une méthode plus sensible et moins spécifique^5. La méthode HRM est une bonne méthode de criblage qui permet une analyse rapide d’un grand nombre d’échantillons avec un grand rapport coût-bénéfice⁵. Il s’agit d’une méthode pcr simple réalisée en présence d’un colorant fluorescent et ne nécessitant pas de compétences spécifiques. Un autre avantage est que la procédure elle-même n’endommage ni ne détruit l’échantillon analysé, ce qui nous permet de réutiliser l’échantillon pour l’électrophorèse ou le séquençage de Sanger après la procédure HRM⁷. Le seul inconvénient est qu’il est parfois difficile d’interpréter les résultats. De plus, HRM ne détecte pas la mutation exacte chez les patients présentant des mutations non de type 1 ou de type 2⁸. Chez ces patients, un séquençage de Sanger doit être effectué (Figure 1).

La GRH est basée sur l’amplification de la région spécifique de l’ADN en présence d’un colorant fluorescent saturé d’ADN, qui est incorporé dans l’ADN double brin (dsDNA). Le colorant fluorescent émet de la lumière lorsqu’il est incorporé dans l’ADNds. Après une augmentation progressive de la température, l’ADNds se décompose en ADN simple brin, qui peut être détecté sur la courbe de fusion comme une diminution soudaine de l’intensité de fluorescence. La forme de la courbe de fusion dépend de la séquence d’ADN utilisée pour détecter la mutation. Les courbes de fusion des échantillons sont comparées aux courbes de fusion de mutations connues ou de type sauvage CALR. Les courbes de fusion distinctes représentent une mutation différente qui n’est pas de type 1 ou de type 2⁹.

L’algorithme de détection de la variante génétique somatique dans le gène CALR par GRH, électrophorèse sur gel d’agarose et méthode de séquençage (Figure 1) a été utilisé et validé dans l’étude rétrospective publiée avant^{le 10.}

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de la République de Slovénie. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration d’Helsinki.

1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) basée sur la fluorescence et analyse post-qPCR par HRM

1. Remettre en suspension les apprêts énumérés dans le tableau des matériaux à 100 μM avec H_2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir tableau des matériaux). Préparez un apprêt de concentration de travail de 10 μM. Les amorces utilisées dans le protocole ont été publiées avant^{le 2}.
2. Quantifier l’ADN des granulocytes par la méthode de coloration par fluorescence en suivant les instructions¹¹ du fabricant (voir tableau des matériaux). Préparer une solution d’ADN de 20 ng/μL en utilisant 10 mM de Tris-Cl, 0,5 mM d’EDTA, pH 9,0 (voir tableau des matériaux).
   1. En plus des échantillons d’ADN, préparez au moins trois témoins d’ADN : deux témoins positifs avec la NM_004343.3 (CALR) : c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs*46) (délétion de 52 pb ou mutation de type 1), et NM_004343.3(CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs*47) (insertion de 5 pb ou mutation de type 2), ainsi que l’ADN de type sauvage et le contrôle négatif en tant que contrôle non-gabarit (NTC).
      REMARQUE: Avant d’effectuer la configuration HRM, vérifiez que l’instrument qPCR est étalonné pour les expériences HRM.
3. Préparez qPCR HRM Master Mix selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux)comme suit : 10 μL de 2x qPCR Master Mix with Dye, 0,2 μL de 10 μM Forward Primer, 0,2 μL de 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL de H 2 O stérile, sans RNase et sans DNase. Utilisez les amorces de la Table des matériaux. Exécutez trois répliques pour chaque échantillon d’ADN et contrôle.
   1. Préparez le qPCR HRM Master Mix en fonction du nombre d’échantillons traités. Inclure un volume excédentaire d’au moins 10 % dans les calculs afin de fournir un volume excédentaire pour la perte qui se produit lors des transferts de réactifs.
4. Mélanger le contenu de la réaction en tapotant doucement et en inversant le tube et en vortexant pendant 2-3 s. Collectez toutes les gouttelettes dispersées de la paroi du tube vers le bas par un bref tour.
5. Préparer une plaque de réaction appropriée pour l’instrument et l’expérience hrm (voir Tableau des matériaux). Transférer 19 μL du mélange maître qPCR HRM vers les puits appropriés de la plaque de réaction optique de 96 puits.
6. Pipeter 1 μL des témoins négatifs, des témoins positifs et des échantillons dans les puits appropriés de la plaque de réaction optique. Pour le CNT, transférer 1 μL de H2O stérile, sansRNase et sans DNase utilisé pour préparer le mélange maître HRM qPCR au lieu de l’ADN.
7. Scellez la plaque de réaction avec le film adhésif optique. Faites-le fermement pour éviter l’évaporation pendant la course. Vérifiez que le film adhésif optique est plan sur tous les puits de la plaque de réaction pour assurer une détection correcte de la fluorescence.
8. Faire tourner la plaque de réaction à 780 x g à température ambiante (RT) pendant 1 minute. Vérifiez que le liquide se trouve au fond des puits dans la plaque de réaction. Procédez à l’exécution du test.
   REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver la plaque à 4 °C pendant 24 h au maximum. Laissez la plaque stockée à 4 °C chauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de la faire fonctionner.
9. Selon les instructions du fabricant, préparez et commencez la course pour amplifier et faire fondre l’ADN et générer des données de fluorescence HRM dans l’instrument qPCR. Dans le logiciel du système d’instruments, affectez les commandes et les échantillons aux puits appropriés.
10. Pour la détection de variantes génétiques CALR, modifiez le protocole d’amplification de l’instrument par défaut et amplifiez l’ADN en utilisant le protocole de cycle thermique suivant : 95 °C pendant 10 minutes, suivi de 50 cycles de 95 °C pendant 10 s et 62,5 °C pendant 60 s.
11. Effectuer l’étape de courbe de fusion/dissociation (HRM) immédiatement après la qPCR selon les instructions du fabricant¹² comme suit : 95 °C pendant 10 s, 60 °C pendant 1 min, puis une vitesse de rampe de 0,025 °C/s jusqu’à 95 °C. Maintenir la température à 95 °C pendant 15 s et à 60 °C pendant 15 s.
12. L’exécution se termine automatiquement. Tout d’abord, examinez et vérifiez le diagramme d’amplification (Figure 2).
13. Dans le menu d’expérience du logiciel du système d’instruments, sélectionnez l’option de tracé d’amplification. Si aucune donnée n’est affichée, cliquez sur le bouton vert Analyser.
    1. Dans l’onglet Diagramme d’amplification, dans le menu déroulant Type de diagramme, sélectionnez le tracé qui affiche les données d’amplification sous forme de lectures de fluorescence brute normalisées à la fluorescence de la référence passive (ΔRn) en fonction du nombre de cycles (ΔRn vs Cycle). Dans le menu déroulant Couleur du tracé, sélectionnez Exemple.
14. Dans le menu déroulant Type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification linéaire. Affichez le cycle de début et de fin de la ligne de base sur le graphique d’amplification linéaire en sélectionnant l’option de début de la ligne de base. Vérifiez que la configuration de référence est correctement définie. Le cycle de fin doit être réglé quelques cycles avant le numéro de cycle où un signal fluorescent important est détecté. La ligne de base est généralement définie de 3 à 15 cycles(Figure 2).
15. Dans le menu déroulant Type de graphique, sélectionnez le type de graphique d’amplification log10. Affichez la ligne de seuil sur le graphique en sélectionnant l’option de seuil. Ajustez le seuil en conséquence s’il n’est pas défini correctement. Le seuil correctement défini signifie que la ligne de seuil traverse la phase exponentielle des courbes qPCR (Figure 2).
16. Vérifier que les courbes d’amplification normales se trouvent dans tous les puits d’échantillonnage et de contrôle positif. Vérifiez qu’il n’y a pas d’amplification dans les puits NTC avant le cycle 40. Un diagramme d’amplification normale montre une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35(Figure 2). Exclure les puits d’échantillonnage de l’analyse s’il n’y a pas d’amplification dans la position du puits.
    REMARQUE: Si le diagramme d’amplification semble anormal ou si le puits NTC indique l’amplification, identifiez et résolvez le problème conformément au guide de dépannage du fabricant.
17. Exclure la valeur aberrante avec la valeur du cycle de quantification (Cq) qui diffère des réplications de plus de 2 dans le logiciel du système^{d’instruments 12}. Les valeurs aberrantes peuvent produire des résultats erronés en matière de GRH.
18. Dans les courbes de fusion dérivées, passez en revue les régions/lignes de température avant et après fusion. Les régions pré- et post-fusion doivent se trouver dans une zone plate où il n’y a pas de grands pics ou de pentes dans les niveaux fluorescents (Figure 3). Si nécessaire, ajustez-le en conséquence. Configurer le démarrage et l’arrêt des lignes de température pré- et post-fusion à environ 0,5 °C l’une de l’autre (Figure 3). Redémarrez l’analyse si les paramètres sont ajustés en cliquant sur le bouton Analyser.
19. Dans l’onglet du graphique de différence, dans l’onglet Paramètres du tracé, choisissez l’un des contrôles de type sauvage (homozygote) qui se réplique comme ADN de référence et redémarrez l’analyse en cliquant sur le bouton Analyser.
20. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, vérifiez que tous les témoins positifs ont le génotype correct et que le NTC n’a pas réussi à amplifier (Figure 4). Dans le tableau des puits, sélectionnez les puits contenant un contrôle positif pour mettre en évidence la courbe de fusion correspondante dans les diagrammes d’analyse. Vérifiez que la couleur de la ligne correspond au génotype correct. Répétez les étapes pour les puits contenant les autres témoins positifs et le CNT.
21. Dans l’onglet Courbes de fusion alignées, examinez attentivement les affichages de tracé pour les échantillons inconnus et comparez-les aux affichages de tracé pour les contrôles (Figure 4). Dans le tableau des puits, sélectionnez les puits contenant les répliques d’échantillons inconnues, vérifiez la couleur de la courbe de fusion et alignez-les sur les commandes dans une séquence ordonnée en sélectionnant les puits contenant des contrôles positifs un par un. Répétez le processus pour tous les échantillons inconnus.
    REMARQUE : L’échantillon inconnu contient la variante de l’une des commandes si sa courbe de fusion est étroitement alignée sur celle-ci. Différents groupes de variantes (couleurs différentes) peuvent être affichés indiquant que l’échantillon inconnu est constitué d’une variante inconnue, ne correspondant pas aux contrôles (Figure 8). Un faible niveau de la variante génétique somatique peut être présent dans l’échantillon du patient. Cela pourrait influencer l’interprétation du résultat de la GRH, en particulier à la limite de détection du test(figure 9). Dans ces cas, la couleur ou même la forme de la ligne pourrait ressembler beaucoup à celle du génotype de type sauvage.
    1. Lorsque le résultat n’est pas concluant, combinez les résultats de la GRH avec les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose et des méthodes de séquençage. Retestez l’échantillon ou la demande et retestez un nouvel échantillon si nécessaire.
    2. Examinez attentivement l’ensemble de données pour les courbes de réplication et vérifiez que l’alignement de chaque réplication au sein du groupe est serré. Exclure la réplique si elle ne s’aligne pas étroitement avec les autres échantillons du groupe (valeur aberrante). Retestez l’échantillon si d’autres valeurs aberrantes sont présentes et que les résultats ne sont pas concluants. Sachez que la quantité et la qualité de l’échantillon d’ADN influencent les résultats de la GRH.
22. Analysez le résultat de l’échantillon inconnu dans l’onglet Graphique de différence. Répétez la procédure décrite à l’étape 1.21 et vérifiez que les résultats obtenus pour l’échantillon inconnu sont les mêmes.
23. Ensuite, exécutez les produits qPCR HRM sur le gel d’agarose.
    REMARQUE: Le protocole peut être mis en pause ici. Conservez la plaque à 4 °C pendant 24 heures au maximum ou à -20 °C pendant une période plus longue mais pas plus de 7 jours. Laissez la plaque stockée à 4 °C chauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de la faire fonctionner. Laissez la plaque stockée à - 20 °C décongeler et réchauffer à RT, puis faites tourner brièvement la plaque avant de l’exécuter.

2. Électrophorèse sur gel d’agarose

1. Exécuter les produits qPCR HRM sur un gel préfabriqué d’agarose à 4 % contenant une coloration fluorescente d’acide nucléique à l’aide du système d’électrophorèse sur gel approprié (voir tableau des matériaux, figure 5). Exécutez une seule réplication HRM positive, négative, NTC et échantillon qPCR.
   REMARQUE: Les gants doivent toujours être portés lors de la manipulation de gels. Tout autre système d’électrophorèse sur gel peut remplir cet objectif si le pourcentage équivalent d’agarose, la coloration d’acide nucléique fluorescent et le format de puits sont choisis.
2. Exécutez le système d’électrophorèse sur gel selon le protocole du fabricant (voir Tableau des matériaux). Retirez le gel préfabriqué dans la cassette de l’emballage, retirez le peigne et insérez-le dans l’appareil conformément aux instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
   REMARQUE: Chargez le gel dans les 15 minutes suivant l’ouverture de l’emballage.
3. Diluer un échantillon de 10 μL à 20 μL avec_duH2O stérile, sans RNase et sans DNase. Chargez chaque puits avec 20 μL d’échantillon dilué.
4. Diluer 3 μL de solution étalon de taille d’ADN à 20 μL avec_H2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir Tableau des matériaux). Charger le puits M avec 20 μL de solution étalon diluée de taille d’ADN (Figure 6).
5. Remplissez tous les puits vides avec 20 μL de H2Ostérile, sans RNase et sans DNase.
6. Sélectionnez immédiatement le programme en fonction du pourcentage du gel en cours d’exécution et réglez la durée d’exécution de l’appareil à 10 minutes.
7. Démarrez l’électrophorèse dans les 1 min suivant le chargement de l’échantillon en appuyant sur le bouton GO. Le temps d’électrophorèse peut être prolongé si une résolution insuffisante est obtenue.
   REMARQUE: Ne pas dépasser la durée maximale recommandée de l’électrophorèse de l’agarose conformément aux instructions du fabricant.
8. Lorsque l’électrophorèse est terminée, visualisez l’ADN dans le gel à l’aide d’une lumière bleue ou d’une transillumination UV. La visualisation, l’analyse et le stockage des images d’électrophorèse sont principalement effectués par un imageur de gel avec système de documentation photographique (Figure 5).
9. Analyser et interpréter le modèle de gel visualisé des produits qPCR HRM en comparant les résultats de l’échantillon inconnu à des témoins positifs(Figure 7 et Figure 8).
10. Si l’échantillon inconnu de résultats de GRH et d’électrophorèse sur gel indique qu’une variante génétique inconnue est présente, séquencer le produit de GRH qPCR à l’aide d’amorces décrites dans le tableau des matériaux selon le protocole décrit¹³.
    ATTENTION : Les gels d’agarose contenant une coloration d’acide nucléique fluorescent doivent être éliminés correctement conformément aux règlements de l’établissement.

Résultats

La région d’intérêt de l’ADN amplifié avec une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification (Cq) dans tous les échantillons et témoins répliqués(Figure 2)est une condition préalable à l’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM. Ceci est réalisé en utilisant une détermination précise de l’ADN avec coloration par fluorescence et une quantité ...

Discussion

La fusion à haute résolution de l’ADN est une solution simple pour le génotypage et le balayage des variantes^{génétiques 14}. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour un certain groupe de patients atteints de cancer^1,2...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water