Détection de variantes génétiques dans le gène CALR à l’aide d’une analyse de fusion à haute résolution

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une solution sensible et rapide pour la détection de variantes génétiques. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes modifiant la forme de la courbe de fusion. En peignant la GRH et l’électrophorèse sur gel d’agarose, différents types de variantes génétiques telles que les indels peuvent être identifiés.

Résumé

L’analyse de fusion à haute résolution (HRM) est une méthode puissante pour le génotypage et le balayage de variation génétique. La plupart des applications hrm dépendent de colorants ADN saturés qui détectent les différences de séquence et d’hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Une excellente résolution d’instrument et un logiciel spécial d’analyse des données sont nécessaires pour identifier les petites différences de courbe de fusion qui identifient une variante ou un génotype. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour les patients atteints d’une maladie spécifique, en particulier le cancer et dans le gène CALR chez les patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs négatifs du chromosome Philadelphie. Des changements, des insertions et/ou des délétions (indels) d’un seul nucléotide dans le gène d’intérêt peuvent être détectés par l’analyse HRM. L’identification des différents types de variantes génétiques est principalement basée sur les contrôles utilisés dans le test qPCR HRM. Cependant, à mesure que la longueur du produit augmente, la différence entre les courbes de type sauvage et les courbes hétérozygotes devient plus petite et le type de variante génétique est plus difficile à déterminer. Par conséquent, lorsque les indels sont la variante génétique prévalente attendue dans le gène d’intérêt, une méthode supplémentaire telle que l’électrophorèse sur gel d’agarose peut être utilisée pour clarifier le résultat de la GRH. Dans certains cas, un résultat non concluant doit être revérifié/rediagnostiqué par séquençage de Sanger standard. Dans cette étude rétrospective, nous avons appliqué la méthode à des patients JAK2 V617F négatifs atteints de NPP.

Introduction

Des variantes génétiques somatiques du gène de la calréticuline(CALR)ont été reconnues en 2013 chez des patients atteints de néoplasmes myéloprolifératifs (NPP) tels que la thrombocytémie essentielle et la myélofibrose primaire^1,2. Depuis lors, plus de 50 variantes génétiques du gène CALR ont été découvertes, induisant un décalage de trame +1 (−1+2)^3. Les deux variantes génétiques CALR les plus fréquentes sont une délétion de 52 pb (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52,p. (Leu367Thrfs*46)), également appelée mutation de type 1, et une insertion de 5 pb....

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de la République de Slovénie. Toutes les procédures étaient conformes à la déclaration d’Helsinki.

1. PCR quantitative en temps réel (qPCR) basée sur la fluorescence et analyse post-qPCR par HRM

1. Remettre en suspension les apprêts énumérés dans le tableau des matériaux à 100 μM avec H_2Ostérile, sans RNase et sans DNase (voir tableau des matériaux). Préparez un apprêt de concentration de travail de 10 μM. Les amorces utilisées dans le protocole ont été publiées avant^{le 2}.
2. Quantifier l’ADN des granul....

Résultats

La région d’intérêt de l’ADN amplifié avec une augmentation exponentielle de la fluorescence qui dépasse le seuil entre les cycles 15 et 35 et des valeurs très étroites du cycle de quantification (Cq) dans tous les échantillons et témoins répliqués(Figure 2)est une condition préalable à l’identification fiable des variantes génétiques par analyse HRM. Ceci est réalisé en utilisant une détermination précise de l’ADN avec coloration par fluorescence et une quantité .......

Discussion

La fusion à haute résolution de l’ADN est une solution simple pour le génotypage et le balayage des variantes^{génétiques 14}. Cela dépend des différences de séquence qui entraînent des hétéroduplexes qui modifient la forme de la courbe de fusion. Différents types de variantes génétiques avec des fréquences diverses peuvent être observés dans le gène spécifique pour un certain groupe de patients atteints de cancer^1,2.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water