高分解能融解解析を用いた CALR 遺伝子の遺伝的変異体検出

要約

高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝的変異体検出のための敏感で迅速なソリューションです。それは、ヘテロ二重鎖が融解曲線の形状を変化させる結果となるシーケンスの違いに依存する。HRMとアガロースゲル電気泳動を組み合わせて、インデルなどの異なる種類の遺伝的変異体を同定することができる。

要約

高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝子型入力や遺伝子変異スキャンのための強力な方法です。ほとんどのHRMアプリケーションは、配列の違いを検出する飽和DNA色素と、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖に依存しています。優れた装置分解能および特殊なデータ解析ソフトウェアは、変異体または遺伝子型を識別する小さな融解曲線の違いを識別するために必要とされます。さまざまな頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、特定の疾患を有する患者、特に癌、およびフィラデルフィア染色体-陰性骨髄増殖性新生物の患者における CALR 遺伝子に特異的な遺伝子で観察することができる。関心のある遺伝子における単一ヌクレオチドの変化、挿入および/または欠失(インデル)は、HRM分析によって検出され得る。異なる種類の遺伝的変異体の同定は、主にqPCR HRMアッセイで使用されるコントロールに基づいています。しかし、製品の長さが長くなるにつれて、野生型とヘテロ接合曲線の差が小さくなり、遺伝的変異体の種類を特定することがより困難になります。したがって、インデルが目的の遺伝子に期待される一般的な遺伝的変異体である場合、アガロースゲル電気泳動などの追加の方法をHRM結果の解明に使用することができる。場合によっては、決定的な結果を、標準のサンガーシーケンシングによって再チェック/再診断する必要があります。本回顧研究では、MPNを有する JAK2 V617F陰性患者にこの方法を適用した。

概要

カレチクリン遺伝子の体細胞遺伝学的変異体(CALR)は、2013年に骨髄増殖性新生物(MPN)の患者(必須血小板血症および原発性骨髄線維症^1,2)で認識された。それ以来、CALR遺伝子の50以上の遺伝的変異体が発見され、+1(−1+2)フレームシフト³を誘導している。2つの最も頻繁なCALR遺伝的変異体は、タイプ1突然変異とも呼ばれる52bp欠失(NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52 p.(leu367Thrfs*46))、および5bp挿入(NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC、p.(Lys385Asnfs*47))、タイプ2突然変異とも呼ばれる。これら2つの遺伝的変異体は、全CALR遺伝的変異体の80%を表す。他のものは、野生型CALR⁴に近いαらせんの保存に基づくアルゴリズムを使用して、タイプ1-likeまたはタイプ2に分類されています。ここでは、CALR遺伝子変異体検出のための高感度かつ迅速な方法の1つ、高分解能融解解析法(HRM)を紹介する。この方法は、CALR突然変異⁵の大部分を表す1型および2型遺伝的変異体の迅速な検出を可能にする。HRMは、因子Vライデン⁶の変異を検出するためのツールとして1997年にリアルタイム»ポリメラーゼ連鎖反応«(qPCR)と組み合わせて導入されました。黄金の標準技術を表すサンガーシーケンシングと比較して、HRMはより敏感で、より特異的でない方法⁵です。HRM法は、多くのサンプルを迅速に分析し、費用便益⁵を実現する優れたスクリーニング方法である。蛍光色素の存在下で行う簡単なPCR法であり、特定のスキルを必要としません。もう一つの利点は、手順自体がHRM手順⁷の後に電気泳動またはサンガーシーケンシングのためにサンプルを再利用することを可能にする分析されたサンプルを損傷または破壊しないことである。唯一の欠点は、結果を解釈することが困難な場合もあるということです。さらに、HRMは、非タイプ1またはタイプ2突然変異⁸を有する患者において正確な突然変異を検出しない。これらの患者では、サンガーシーケンシングを行う必要があります(図1)。

HRMは、飽和DNA蛍光色素の存在下で特異的DNA領域の増幅に基づいており、これは二本鎖DNA(dsDNA)に組み込まれる。蛍光色素は、dsDNAに組み込まれると発光します。徐々に温度が上昇した後、dsDNAは一本鎖DNAに分解し、蛍光強度の急激な低下として融解曲線上で検出することができる。融解曲線の形状は、変異を検出するために使用されるDNA配列に依存する。試料の融解曲線は既知の突然変異または野生型CALRの融解曲線と比較される。明確な融解曲線は、タイプ 1 またはタイプ 2⁹以外の異なる突然変異を表します。

HRMによる CALR 遺伝子における体細胞遺伝学的変異体検出のためのアルゴリズムとしては、アガロースゲル電気泳動およびシーケンシング法(図1)が使用され^、10以前に発表された遡及研究で検証された。

プロトコル

この研究は、スロベニア共和国の医療倫理委員会によって承認されました。すべての手順はヘルシンキ宣言に従っていました。

1. 蛍光ベースの定量リアルタイム PCR (qPCR) および HRM による qPCR 後分析

1. 材料表に記載されているプライマーを無菌、RNaseおよびDNaseフリー_H2Oで100 μMに再懸濁します(材料表を参照)。10 μMの作業濃度プライマーを作ります。プロトコルで使用されるプライマーは²の前に公開されました。
2. 製造者の指示¹¹ に従って蛍光染色法により顆粒球DNAを定量する( 材料表を参照)。10 mM トリスCl、0.5 mM EDTA、pH 9.0を使用して20 ng/μL DNA溶液を調製します( 材料表を参照)。
   1. DNAサンプルに加えて、 少なくとも3つのDNA制御を用意する:NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52、p.(Leu367Thrfs*46)(52bp欠失またはタイプ1突然変異)、およびNM_004343.3(CALR)、c.1154_1155insTTGTC、p.(5bp挿入または2型突然変異)遺伝子変異体、ならびに野生型DNAおよび陰性対照(非NTC)対照として(
      注: HRM のセットアップを実行する前に、qPCR 装置が HRM 実験用に調整されていることを確認してください。
3. メーカーのプロトコルに従ってqPCR HRMマスターミックスを準備する(材料表を参照)は、色素との2x qPCRマスターミックスの10 μL、10 μMフォワードプライマーの0.2 μL、10 μMリバースプライマーの0.2 μL、無菌、RNaseおよびDNaseフリー_H2のプライマーを使用します。DNAサンプルとコントロールごとに3つの複製を実行します。
   1. 処理されるサンプルの数に応じて qPCR HRM マスターミックスを準備します。試薬の転送中に生じる損失に対して余分な体積を提供するために、計算に少なくとも10%の過剰体積を含める。
4. 軽くタップしてチューブを反転し、2~3sの渦を入れ、反応内容物を混ぜます。短いスピンでチューブの壁から底まで、すべての散乱液滴を収集します。
5. 計測器およびHRM実験に適した反応プレートを用意します( 材料表を参照)。qPCR HRMマスターミックスの19 μLを96ウェル光学反応プレートの適切なウェルに移します。
6. 陰性制御、正のコントロール、およびサンプルのピペット1 μLは、光学反応プレートの適切なウェルに入ります。NTCの場合、DNAの代わりにqPCR HRMマスターミックスを調製するために使用される無菌、RNaseおよびDNaseフリーH_2Oの1 μLを移す。
7. 反応板を光学粘着フィルムで密封します。走行中の蒸発を防ぐためにしっかりと行います。光学粘着フィルムが反応板内のすべてのウェルを横切って平面であることを確認し、正しい蛍光検出を確実に行います。
8. 反応板を室温(RT)で780xgで1分間回転させます。 液体が反応板のウェルの底にあることを確認します。アッセイを実行するに進みます。
   注: プロトコルはここで一時停止することができます。プレートは4°Cで24時間以内に保管してください。4°Cに保存されたプレートをRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。
9. メーカーの指示によると、DNAを増幅して溶融させ、qPCR装置でHRM蛍光データを生成するために、実行を準備して開始します。計測器システムソフトウェアで、コントロールとサンプルを適切なウェルに割り当てます。
10. CALR遺伝子変異体検出では、デフォルトの器械増幅プロトコルを変更し、次の熱サイクリングプロトコルを使用してDNAを増幅する:95°C10分間、95°Cの50サイクルが10s、60sで62.5°Cが続きます。
11. 製造元の指示に従ってqPCRの直後にメルト曲線/解離(HRM)ステージを実行します^12: 95 °C 10 s, 60 °C 1 min, 95 °Cまでランプレート 0.025 °C/s. 温度を95°Cで15s、60°Cで15sに保ちます。
12. 実行は自動的に終了します。まず、増幅プロットを確認して確認します(図2)。
13. 計測器システムソフトウェアの実験メニューで、増幅プロットオプションを選択します。データが表示されない場合は、緑の [ 分析] ボタンをクリックします。
    1. 増幅プロットタブで、プロットタイプドロップダウンメニューから、サイクル数の関数としてパッシブ参照(ΔRn)から蛍光に正規化された生蛍光測定値として増幅データを表示するプロットを選択します(ΔRn vs Cycle)。[印刷色] ドロップダウン メニューで、[ サンプル] を選択します。
14. グラフタイプドロップダウンメニューから、線形増幅グラフタイプを選択します。ベースラインの開始と終了のサイクルを、ベースラインの開始オプションを選択して、線形増幅グラフに表示します。ベースラインが正しく設定されていることを確認します。終了サイクルは、重要な蛍光シグナルが検出されるサイクル数の前に数サイクル設定する必要があります。ベースラインは通常、3~15 サイクルに設定されます (図 2)。
15. グラフタイプドロップダウンメニューから、log10増幅グラフタイプを選択します。しきい値オプションを選択して、グラフにしきい値の線を表示します。正しく設定されていない場合は、それに応じてしきい値を調整します。正しく設定されたしきい値は、しきい値の線が qPCR 曲線の指数位相を超えて行くということを意味します (図 2)。
16. 正常な増幅曲線が、すべてのサンプルおよびポジティブコントロールウェルに含まれているかどうかを確認します。サイクル 40 の前に NTC ウェルに増幅がないことを確認します。正常増幅プロットは、サイクル15と35の間の閾値を超える蛍光の指数関数的増加を示す(図2)。ウェル位置に増幅がない場合は、分析からサンプルウェルを除外します。
    注: 増幅プロットが異常に見えるか、NTC が増幅を示している場合は、製造元のトラブルシューティング ガイドに従って問題を特定し、解決します。
17. 計器システムソフトウェア¹²で 2 を超える反復とは異なる定量化サイクル(Cq)値を持つ外れ値を除外します。外れ値は誤ったHRM結果を生じる可能性があります。
18. 派生メルトカーブで、溶融前および後の領域/温度線を確認します。プレ融解領域とポストメルト領域は、蛍光レベルに大きなピークや傾斜がない平坦な領域内にあるべきである(図3)。必要に応じて調整してください。溶融前と後の温度ラインの開始と停止を、互いに約0.5 °C離れた位置に設定します(図3)。パラメータが[分析]ボタンをクリックして調整された場合は、 解析 を再開します。
19. [差異プロット]タブのプロット設定タブで、参照DNAとして複製する野生型制御(ホモ接合体)のいずれかを選択し、[ 解析 ]ボタンをクリックして解析を再開します。
20. 整列メルトカーブタブで、正のコントロールがすべて正しい遺伝子型を持ち、NTCが増幅に失敗したことを確認します(図4)。ウェルテーブルから、正のコントロールを含むウェルを選択して、解析プロット内の対応するメルトカーブをハイライト表示します。線の色が正しい遺伝子型に対応していることを確認します。他の正のコントロールと NTC を含むウェルに対して手順を繰り返します。
21. 整列メルトカーブタブで、未知のサンプルのプロット表示を慎重に確認し、それらをコントロールのプロットディスプレイと比較します(図4)。ウェルテーブルから、未知のサンプル複製を含むウェルを選択し、メルトカーブの色を確認し、正のコントロールを含むウェルを1つずつ選択して、順序付けられた順序でコントロールに合わせます。すべての不明なサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。
    注: 不明なサンプルには、その融解曲線がしっかりと整列している場合、コントロールの 1 つのバリアントが含まれています。異なるバリアントグループ(異なる色)は、未知のサンプルが未知のバリアントで構成されていることを示し、コントロールに対応していないことを示す可能性があります(図8)。体細胞の遺伝的変異体の低レベルは、患者のサンプルに存在することができる。これは、HRM結果の解釈、特にアッセイの検出限界に影響を与える可能性があります(図9)。このような場合、線の色や形状は野生型の遺伝子型の色と似ている可能性があります。
    1. 結果が決定的でない場合は、HRMの結果をアガロースゲル電気泳動およびシーケンシング法の結果と組み合わせます。サンプルを再テストするか、必要に応じて新しいサンプルを要求し、再テストします。
    2. データ セットの複製カーブを慎重に確認し、グループ内の各反復のアライメントが緊密であることを確認します。グループ内の他のサンプルと緊密に整列しない場合は、レプリケートを除外します(外れ値)。さらに外れ値が存在し、結果が決定的でない場合は、サンプルを再テストします。DNAサンプルの量と品質がHRMの結果に影響を与える点に注意してください。
22. [差異プロット]タブで未知のサンプルの結果を分析します。ステップ 1.21 で説明されている手順を繰り返し、不明なサンプルに対して得られた結果が同じであることを確認します。
23. 次に、アガロースゲル上でqPCR HRM製品を実行します。
    注: プロトコルはここで一時停止することができます。プレートは、4°Cで24時間以内、または-20°Cで長期間保管しますが、7日以下です。4°Cに保存されたプレートをRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。20°Cで保存されたプレートを解凍してRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。

2. アガロースゲル電気泳動

1. 適切なゲル電気泳動システムを使用して、蛍光核酸染色を含む4%アガロースプレキャストゲル上でqPCR HRM製品を実行する( 材料表、 図5を参照)。正、負、NTC、サンプルの qPCR HRM レプリケートを 1 つだけ実行します。
   注:手袋は、ゲルを扱うときに常に着用する必要があります。他のゲル電気泳動システムは、同等のアガロース率、蛍光核酸染色および良好なフォーマットが選択された場合、この目的を果たすことができます。
2. メーカーのプロトコルに従ってゲル電気泳動システムを実行します( 材料表を参照)。カセットのプレキャストゲルをパッケージから取り出し、コームを取り外し、メーカーの指示に従って装置に挿入します( 材料表を参照)。
   メモ:パッケージを開けてから15分以内にゲルをロードします。
3. 滅菌、RNaseおよびDNaseフリーH₂Oで10μLのサンプルを20 μLに希釈し、希釈サンプルを20 μLずつずつ積み込みます。
4. 無菌、RNaseおよびDNase_フリーH2 Oで20 μLのDNAサイズ標準溶液の3 μLを希釈します(材料表を参照)。希釈されたDNAサイズ標準溶液の20 μLでMウェルをロードする(図6)。
5. 無菌、RNaseおよびDNaseフリーH₂Oの20 μLで空の井戸を充填します。
6. 直ちに実行されるゲルの割合に応じてプログラムを選択し、装置上での実行時間を10分に設定します。
7. GOボタンを押して、負荷サンプルから1分以内に電気泳動を開始します。分解能が不足すれば、電気泳動時間を延長できます。
   注:メーカーの指示に従って、最大推奨アガロース電気泳動の実行時間を超えないでください。
8. 電気泳動が完了したら、青色光またはUVトランスイルミネーションを使用してゲル内のDNAを可視化します。電気泳動画像の視覚化、解析、保存は、主に写真ドキュメンテーションシステムを備えたゲルイメージャーによって行われます(図5)。
9. 未知のサンプルの結果を正の対照と比較して、可視化されたqPCR HRM製品のゲルパターンを分析し、解釈する(図7および図8)。
10. 未知のサンプルHRMおよびゲル電気泳動結果が未知の遺伝的変異体が存在することを示す場合^、13に記載されたプロトコルに従って材料表に記載のプライマーを用いてqPCR HRM産物を配列する。
    注意:蛍光核酸染色を含むアガロースゲルは、機関ごとに適切に廃棄する必要があります。

結果

循環15と35の間の閾値を超える蛍光の指数関数的増加と、すべての複製されたサンプルおよびコントロールにおける定量サイクルの非常に狭い値(Cq)を有する目的のDNA領域の増幅に成功した(図2)は、HRM分析による遺伝的変異体の確実な同定のための前提条件である。これは、qPCR HRM実験で蛍光染色と同量のDNAを正確に測定することによって達成される(ステップ1.2参照)。

ディスカッション

DNAの高解像度融解は、遺伝子型入力および遺伝的変異体走査¹⁴のための簡単なソリューションである。それは、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖をもたらすシーケンスの違いに依存する。多様な頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、癌^{1、2、15、16、10}の特定のグループに特異的な遺伝子で観?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water