Detecção de variantes genéticas no gene CALR usando análise de fusão de alta resolução

Resumo

A análise de fusão de alta resolução (HRM) é uma solução sensível e rápida para detecção de variantes genéticas. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes mudando a forma da curva de fusão. Ao pentear o HRM e a agarose gel eletroforesis, diferentes tipos de variantes genéticas, como indels, podem ser identificados.

Resumo

A análise de derretimento de alta resolução (HRM) é um método poderoso para genotipagem e varredura de variações genéticas. A maioria das aplicações de HRM dependem de corantes de DNA saturados que detectam diferenças de sequência, e heterodúplexos que mudam a forma da curva de fusão. Excelente resolução de instrumentos e software especial de análise de dados são necessários para identificar as pequenas diferenças de curva de fusão que identificam uma variante ou genótipo. Diferentes tipos de variantes genéticas com diversas frequências podem ser observadas no gene específico para pacientes com uma doença específica, especialmente câncer e no gene CALR em pacientes com neoplasias mieloproliferativas nômodas negativas da Filadélfia. Alterações de nucleotídeos únicos, inserções e/ou exclusões (indels) no gene de interesse podem ser detectadas pela análise do HRM. A identificação de diferentes tipos de variantes genéticas baseia-se principalmente nos controles utilizados no ensaio qPCR HRM. No entanto, à medida que o comprimento do produto aumenta, a diferença entre curvas de tipo selvagem e heterozigoto torna-se menor, e o tipo de variante genética é mais difícil de determinar. Portanto, quando os indels são a variante genética predominante esperada no gene de interesse, um método adicional como a eletroforese de gel de agarose pode ser usado para o esclarecimento do resultado do HRM. Em alguns casos, um resultado inconclusivo deve ser re-verificado/re-diagnosticado pelo sequenciamento Sanger padrão. Neste estudo retrospectivo, aplicamos o método a pacientes JAK2 V617F negativos com MPN.

Introdução

As variantes genéticas somáticas do gene da calreticulina (CALR)foram reconhecidas em 2013 em pacientes com neoplasias mieloproliferativas (MPN), como trombocythemia essencial e mielófibrose primária^1,2. Desde então, mais de 50 variantes genéticas no gene CALR foram descobertas, induzindo um quadro de 3 +1 (−1+2). As duas variantes genéticas CALR mais frequentes são uma exclusão de 52 bps (NM_004343,3 (CALR):c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), também chamada de mutação tipo 1, e uma inserção de 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), também chamada de mutação tipo 2. Essas duas variantes genéticas representam 80% de todas as variantes genéticas CALR. Os outros foram classificados como tipo 1- like ou tipo 2 – como usando algoritmos baseados na preservação de uma hélice α perto do tipo selvagem CALR⁴. Aqui, apresentamos um dos métodos altamente sensíveis e rápidos para detecção de variantes genéticas CALR, o método de análise de fusão de alta resolução (HRM). Este método permite a detecção rápida de variantes genéticas tipo 1 e tipo 2, que representam a maioria das mutações CALR ⁵. O HRM foi introduzido em combinação com a reação em cadeia de polimerase em tempo real« (qPCR) em 1997 como uma ferramenta para detectar a mutação no fator V Leiden⁶. Em comparação com o sequenciamento Sanger que representa a técnica padrão dourada, o HRM é um método mais sensível e menos específico⁵. O método HRM é um bom método de triagem que permite uma análise rápida de um grande número de amostras com um ótimo custo-benefício⁵. É um método PCR simples realizado na presença de um corante fluorescente e não requer habilidades específicas. Outro benefício é que o procedimento em si não danifica ou destrói a amostra analisada que nos permite reutilizar a amostra para eletroforese ou sequenciamento de Sanger após o procedimento de HRM⁷. A única desvantagem é que às vezes é difícil interpretar os resultados. Além disso, o HRM não detecta a mutação exata em pacientes com mutações não tipo 1 ou tipo 2⁸. Nesses pacientes, deve-se realizar o sequenciamento Sanger(Figura 1).

O HRM baseia-se na amplificação da região específica do DNA na presença de corante fluorescente de DNA saturado, que é incorporado em DNA de dupla cadeia (dsDNA). O corante fluorescente emite luz quando incorporado no dsDNA. Após um aumento progressivo da temperatura, o DSNA se divide em um único DNA encalhado, que pode ser detectado na curva de fusão como uma diminuição repentina da intensidade da fluorescência. A forma da curva de fusão depende da sequência de DNA que é usada para detectar a mutação. Curvas de fusão de amostras são comparadas com curvas de fusão de mutações conhecidas ou tipo selvagem CALR. Curvas de fusão distintas representam uma mutação diferente que não é tipo 1 ou tipo²⁹.

O algoritmo para a detecção de variantes genéticas somáticas no gene CALR por HRM, o método de eletroforese e sequenciamento do gel agarose(Figura 1)foi utilizado e validado no estudo retrospectivo publicado antes do¹⁰.

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Protocolo

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Médica da República da Eslovênia. Todos os procedimentos estavam de acordo com a declaração de Helsinque.

1. Análise quantitativa de PCR (qPCR) e pós-qPCR baseada em fluorescência e análise pós-qPCR pelo HRM

1. Primers resuspend listados na Tabela de Materiais a 100 μM com estéril, RNase e DNase livre H₂O (ver Tabela de Materiais). Faça um primer de concentração de trabalho de 10 μM. Os primers utilizados no protocolo foram publicados antes^{do 2}.
2. Quantitate granulocitos DNA pelo método de coloração de fluorescência seguindo a instrução do fabricante¹¹ (ver Tabela de Materiais). Prepare uma solução de DNA de 20 ng/μL utilizando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9.0 (ver Tabela de Materiais).
   1. Além das amostras de DNA, prepare pelo menos três controles de DNA: dois controles positivos com o NM_004343.3(CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs* 46) (exclusão de 52 bp ou mutação tipo 1) e NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs *47) (inserção de 5 bp ou mutação tipo 2), bem como DNA selvagem e controle negativo como controle não-modelo (NTC).
      NOTA: Antes de realizar a configuração do HRM, confirme se o instrumento qPCR está calibrado para experimentos de HRM.
3. Prepare o qPCR HRM Master Mix de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais) da seguinte forma: 10 μL de 2x qPCR Master Mix com Corante, 0,2 μL de Primer forward de 10 μM, 0,2 μL de Primer reverso de 10 μM, 8,6 μL de estéril, RNase e DNase livre H₂O. Use os primers da Tabela de Materiais. Execute três réplicas para cada amostra de DNA e controle.
   1. Prepare o qPCR HRM Master Mix de acordo com o número de amostras que estão sendo processadas. Inclua volume excedente de pelo menos 10% nos cálculos para fornecer volume excessivo para a perda que ocorre durante as transferências de reagentes.
4. Misture o conteúdo da reação tocando suavemente e invertendo o tubo e o vórtice para 2-3 s. Colete todas as gotículas espalhadas da parede do tubo até o fundo por um breve giro.
5. Prepare uma placa de reação adequada para o instrumento e o experimento HRM (ver Tabela de Materiais). Transfira 19 μL do qPCR HRM Master Mix para os poços apropriados da placa de reação óptica de 96 poços.
6. Pipet 1 μL dos controles negativos, controles positivos e amostras nos poços apropriados da placa de reação óptica. Para o NTC, transfira 1 μL de estéril, RNase e DNase livre H₂O usado para preparar o qPCR HRM Master Mix em vez de DNA.
7. Sele a placa de reação com o filme adesivo óptico. Faça-o firmemente para evitar a evaporação durante a corrida. Verifique se a película adesiva óptica está em todos os poços da placa de reação para garantir a detecção correta da fluorescência.
8. Gire a placa de reação a 780 x g em temperatura ambiente (RT) por 1 minuto. Verifique se o líquido está na parte inferior dos poços na placa de reação. Prossiga para executar o ensaio.
   NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene a placa a 4 °C por não mais de 24h. Deixe a placa armazenada a 4 °C para aquecer ao RT e, em seguida, gire a placa brevemente antes de executá-la.
9. De acordo com a instrução do fabricante, prepare e inicie a corrida para amplificar e derreter o DNA e gerar dados de fluorescência de HRM no instrumento qPCR. No software do sistema de instrumentos, atribua os controles e amostras aos poços apropriados.
10. Para a detecção da variante genética CALR, altere o protocolo padrão de amplificação do instrumento e amplie o DNA usando o seguinte protocolo de ciclismo térmico: 95 °C por 10 minutos, seguido por 50 ciclos de 95 °C para 10 s e 62,5 °C para 60 s.
11. Realize o estágio de curva/dissociação de derretimento (HRM) imediatamente após o qPCR de acordo com as instruções do fabricante¹² da seguinte forma: 95 °C para 10 s, 60 °C por 1 min e, em seguida, uma taxa de rampa de 0,025 °C/s até 95 °C. Mantenha a temperatura a 95 °C para 15 s e a 60 °C para 15 s.
12. A corrida termina automaticamente. Primeiro, revise e verifique o enredo de amplificação(Figura 2).
13. No menu de experimentos do software do sistema de instrumentos, selecione a opção de plot de amplificação. Se nenhum dado for exibido, clique no botão verde Analisar.
    1. Na guia de plot de amplificação, a partir do menu suspenso do tipo de enredo, selecione o plot que exibe os dados de amplificação como as leituras de fluorescência bruta normalizadas para a fluorescência da referência passiva (ΔRn) em função do número de ciclo (ΔRn vs Cycle). No menu suspenso da cor do enredo, selecione Amostrar.
14. No menu suspenso do tipo gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação linear. Mostre o ciclo de início e fim da linha de base no gráfico de amplificação linear selecionando a opção de início da linha de base. Verifique se a linha de base está definida corretamente. O ciclo final deve ser definido alguns ciclos antes do número de ciclo onde um sinal fluorescente significativo é detectado. A linha de base é geralmente definida de 3 a 15 ciclos(Figura 2).
15. No menu suspenso do tipo gráfico, selecione o tipo de gráfico de amplificação log10. Mostre a linha de limiar no gráfico selecionando a opção limiar. Ajuste o limiar de acordo se não estiver definido corretamente. O limiar definido corretamente significa que a linha limiar cruza a fase exponencial das curvas qPCR(Figura 2).
16. Verifique se as curvas normais de amplificação estão em todas as amostras e poços de controle positivos. Verifique se não há amplificação nos poços NTC antes do ciclo 40. Uma parcela de amplificação normal mostra um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35(Figura 2). Exclua os poços amostrais da análise se não houver amplificação na posição do poço.
    NOTA: Se a parcela de amplificação parecer anormal ou o poço NTC indicar a amplificação, identifique e resolva o problema de acordo com o guia de solução de problemas do fabricante.
17. Exclua o outlier com o valor do ciclo de quantificação (Cq) que difere das réplicas por mais de 2 no software do sistema de instrumentos¹². Os outliers podem produzir resultados de HRM errôneos.
18. Nas curvas de derretimento derivado, reveja as regiões/linhas de temperatura pré e pós-derretimento. As regiões pré e pós-derretimento devem estar dentro de uma área plana onde não há grandes picos ou encostas nos níveis fluorescentes(Figura 3). Se necessário, ajuste-o de acordo. Configure a partida e a parada das linhas de temperatura pré e pós-fusão aproximadamente 0,5 °C uma à parte da outra(Figura 3). Reinicie a análise se os parâmetros forem ajustados clicando no botão Analisar.
19. Na guia de plot de diferença, na guia configurações do plot, escolha um dos controles do tipo selvagem (homozigoto) replica-se como o DNA de referência e reinicie a análise clicando no botão Analisar.
20. Na aba curvas de derretimento alinhada, confirme que todos os controles positivos têm o genótipo correto e o NTC não conseguiu amplificar(Figura 4). Na tabela do poço, selecione os poços contendo um controle positivo para destacar a curva de derretimento correspondente nas parcelas de análise. Confirme se a cor da linha corresponde ao genótipo correto. Repita passos para os poços que contenham os outros controles positivos e NTC.
21. Na aba curvas de derretimento alinhada, revise cuidadosamente as telas do plot para as amostras desconhecidas e compare-as com as telas de plot para controles(Figura 4). Na tabela do poço, selecione os poços contendo as réplicas de amostra desconhecida, verifique a cor da curva de derretimento e alinhe-os com os controles em uma sequência ordenada selecionando os poços contendo controles positivos um a um. Repita o processo para todas as amostras desconhecidas.
    NOTA: A amostra desconhecida contém a variante de um dos controles se sua curva de fusão estiver firmemente alinhada a ela. Diferentes grupos de variantes (cores diferentes) poderiam ser exibidos indicando que a amostra desconhecida consiste em uma variante desconhecida, não correspondendo aos controles(Figura 8). Um baixo nível da variante genética somática pode estar presente na amostra do paciente. Isso poderia influenciar a interpretação do resultado do HRM, particularmente no limite de detecção do ensaio(Figura 9). Nestes casos, a cor ou mesmo a forma da linha poderia se assemelhar muito à do genótipo do tipo selvagem.
    1. Quando o resultado for inconclusivo, combine os resultados do HRM com os resultados dos métodos de eletroforese e sequenciamento do gel agarose. Teste novamente a amostra ou solicite e teste novamente uma nova amostra, se necessário.
    2. Revise cuidadosamente o conjunto de dados para replicar curvas e verifique se o alinhamento de cada réplica dentro do grupo está apertado. Exclua a réplica se ela não estiver alinhada firmemente com as outras amostras do grupo (outlier). Teste novamente a amostra se houver mais outliers e os resultados são inconclusivos. Esteja ciente de que a quantidade e a qualidade da amostra de DNA influenciam os resultados do HRM.
22. Analise o resultado da amostra desconhecida na guia Plot 'Diferença'. Repita o procedimento descrito na etapa 1.21 e verifique se os resultados obtidos para a amostra desconhecida são os mesmos.
23. Em seguida, execute os produtos qPCR HRM no gel de agarose.
    NOTA: O protocolo pode ser pausado aqui. Armazene a placa a 4 °C por no máximo 24 horas ou a -20 °C por um período maior, mas não mais do que 7 dias. Deixe a placa armazenada a 4 °C para aquecer ao RT e, em seguida, gire a placa brevemente antes de executá-la. Deixe a placa armazenada a - 20 °C para descongelar e aquecer ao RT, e depois gire a placa brevemente antes de executá-la.

2. Eletroforese de gel agarose

1. Execute os produtos qPCR HRM em um gel pré-fundido de 4% agarose contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente usando o sistema de eletroforese de gel apropriado (ver Tabela de Materiais, Figura 5). Execute apenas uma réplica positiva, negativa, NTC e qPCR HRM.
   NOTA: As luvas devem ser sempre usadas ao manusear géis. Qualquer outro sistema de eletroforese de gel pode cumprir esse propósito se a porcentagem equivalente de agarose, a mancha de ácido nucleico fluorescente e o formato do poço forem escolhidos.
2. Execute o sistema de eletroforese de gel de acordo com o protocolo do fabricante (ver Tabela de Materiais). Retire o gel pré-fundido no da embalagem, remova o pente e insira-o no aparelho de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Carregue o gel dentro de 15 minutos após a abertura do pacote.
3. Diluir uma amostra de 10 μL a 20 μL com h₂O livre de Estéril, RNase e DNase. Carregue cada poço com 20 μL de amostra diluída.
4. Diluir 3 μL de solução padrão de tamanho de DNA a 20 μL com Estéril, RNase e DNase livre H₂O (ver Tabela de Materiais). Carregue o poço M com 20 μL de solução padrão de tamanho de DNA diluída(Figura 6).
5. Encha todos os poços vazios com 20 μL de estéril, RNase e DNase livre H₂O.
6. Selecione imediatamente o programa de acordo com a porcentagem do gel que está sendo executado e defina o tempo de execução no aparelho para 10 minutos.
7. Inicie a eletroforese dentro de 1 min da amostra de carregamento pressionando o botão GO. O tempo de eletroforese pode ser prorrogado se a resolução insuficiente for obtida.
   NOTA: Não exceda o tempo máximo recomendado de execução da eletroforese agarose de acordo com as instruções do fabricante.
8. Quando a eletroforese estiver concluída, visualize o DNA no gel usando uma transilluminação de luz azul ou UV. Visualizar, analisar e armazenar as imagens de eletroforese são feitos principalmente por um imager de gel com sistema de documentação fotográfica(Figura 5).
9. Analisar e interpretar o padrão de gel de produtos qPCR HRM visualizado comparando os resultados da amostra desconhecida com controles positivos(Figura 7 e Figura 8).
10. Se os resultados da amostra desconhecida HRM e da eletroforese do gel indicarem que uma variante genética desconhecida está presente, sequencie o produto qPCR HRM utilizando primers descritos na Tabela de Materiais de acordo com o protocolo descrito¹³.
    ATENÇÃO: Os géis de agarose contendo uma mancha de ácido nucleico fluorescente devem ser adequadamente eliminados pelas normas da instituição.

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Resultados

A região de interesse do DNA amplificado com sucesso com um aumento exponencial da fluorescência que excede o limiar entre os ciclos 15 e 35 e valores muito estreitos do ciclo de quantificação (Cq) em todas as amostras e controles replicados (Figura 2) é um pré-requisito para a identificação confiável de variantes genéticas pela análise do HRM. Isso é conseguido usando uma determinação precisa do DNA com coloração de fluorescência e uma quantidade igual de DNA no experimento...

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Discussão

O derretimento de alta resolução do DNA é uma solução simples para genotipagem e escaneamento de variantes^{genéticas 14}. Depende de diferenças sequenciais que resultam em heteroduplexes que mudam a forma da curva de fusão. Diferentes tipos de variantes genéticas com frequências diversas podem ser observadas no gene específico para um determinado grupo de pacientes com câncer^1,2,15,

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water