Обнаружение генетических вариантов в гене CALR с использованием анализа плавления с высоким разрешением

Резюме

Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является чувствительным и быстрым решением для обнаружения генетических вариантов. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к тому, что гетеродуплексы изменяют форму кривой плавления. Путем расчесывания HRM и электрофореза агарозного геля можно идентифицировать различные типы генетических вариантов, таких как индели.

Аннотация

Анализ плавления с высоким разрешением (HRM) является мощным методом генотипирования и сканирования генетических вариаций. Большинство применений HRM зависят от насыщения красителей ДНК, которые обнаруживают различия последовательностей, и гетеродуплексов, которые изменяют форму кривой плавления. Отличное разрешение прибора и специальное программное обеспечение для анализа данных необходимы для выявления небольших различий кривой плавления, которые идентифицируют вариант или генотип. Различные типы генетических вариантов с различными частотами могут наблюдаться в гене, специфичном для пациентов с конкретным заболеванием, особенно раком, и в гене CALR у пациентов с филадельфийскими хромосомно-отрицательными миелопролиферативными новообразованиями. Однонуклеотидные изменения, вставки и/или делеции (indels) в интересующем гене могут быть обнаружены с помощью анализа HRM. Идентификация различных типов генетических вариантов в основном основана на контроле, используемом в анализе qPCR HRM. Однако по мере увеличения длины продукта разница между кривыми дикого типа и гетерозигот становится меньше, а тип генетического варианта определить сложнее. Поэтому, где индели являются преобладающим генетическим вариантом, ожидаемым в интересующем гене, для уточнения результата HRM может быть использован дополнительный метод, такой как электрофорез агарозного геля. В некоторых случаях неубедительный результат должен быть повторно проверен / повторно диагностирован стандартным секвенированием Сэнгера. В этом ретроспективном исследовании мы применили метод к JAK2 V617F-отрицательным пациентам с MPN.

Введение

Соматические генетические варианты в гене калретикулина(CALR)были признаны в 2013 году у пациентов с миелопролиферативными новообразованиями (MPN), такими как эссенциальная тромбоцитемия и первичный миелофиброз^1,2. С тех пор было обнаружено более 50 генетических вариантов в гене CALR, индуцирующих сдвиг кадра +1 (−1+2)^3. Двумя наиболее частыми генетическими вариантами CALR являются делеция 52 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46)), также называемая мутацией типа 1, и вставка 5 bp (NM_004343,3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47)), также называемая мутацией типа 2. Эти два генетических варианта составляют 80% всех генетических вариантов CALR. Другие были классифицированы как тип 1-подобный или тип 2-подобный с использованием алгоритмов, основанных на сохранении α спирали, близкой к дикому типу CALR^4. Здесь мы представляем один из высокочувствительных и быстрых методов обнаружения генетических вариантов CALR, метод анализа плавления с высоким разрешением (HRM). Этот метод позволяет быстро обнаружить генетические варианты типа 1 и типа 2, которые представляют собой большинство мутаций CALR ^5. HRM был введен в сочетании с «полимеразной цепной реакцией» в реальном времени (qPCR) в 1997 году как инструмент для обнаружения мутации в факторе V Лейдена^6. По сравнению с секвенированием Сэнгера, которое представляет собой технику золотого стандарта, HRM является более чувствительным и менее специфическим методом^5. Метод HRM является хорошим методом скрининга, который позволяет проводить быстрый анализ большого количества образцов с большой экономической выгодой⁵. Это простой метод ПЦР, выполняемый в присутствии флуоресцентного красителя и не требующий специфических навыков. Еще одно преимущество заключается в том, что сама процедура не повреждает и не разрушает анализируемый образец, что позволяет нам повторно использовать образец для электрофореза или секвенирования Сэнгера после процедуры HRM^7. Единственным недостатком является то, что иногда трудно интерпретировать результаты. Кроме того, HRM не обнаруживает точную мутацию у пациентов с мутациями не типа 1 или типа 2^8. У этих пациентов следует выполнять секвенирование Сэнгера(рисунок 1).

HRM основан на амплификации специфической области ДНК в присутствии насыщенного ДНК флуоресцентного красителя, который включен в двухцепочечную ДНК (dsDNA). Флуоресцентный краситель излучает свет при включении в дцДНК. После прогрессивного повышения температуры дцДНК распадается на одноцепочечную ДНК, которая может быть обнаружена на кривой плавления как внезапное снижение интенсивности флуоресценции. Форма кривой плавления зависит от последовательности ДНК, которая используется для обнаружения мутации. Кривые плавления образцов сравниваются с кривыми плавления известных мутаций или CALR дикого типа. Отчетливые кривые плавления представляют собой другую мутацию, которая не относится к типу 1 или^{типу 2 9.}

Алгоритм обнаружения соматических генетических вариантов в гене CALR методом HRM, электрофореза агарозного геля и секвенирования(Рисунок 1)был использован и валидирован в ретроспективном исследовании, опубликованном до^10.

протокол

Исследование было одобрено Комитетом по медицинской этике Республики Словении. Все процедуры соответствовали Хельсинкской декларации.

1. Флуоресцентный количественный анализ ПЦР в реальном времени (qPCR) и пост-qPCR с помощью HRM

1. Повторное суспендирование грунтовок, перечисленных в Таблице материалов, до 100 мкМ со стерильными, РНКазными и ДНКазными свободными_Н2О(см. Таблицу материалов). Сделайте грунтовку рабочей концентрации 10 мкМ. Грунтовки, используемые в протоколе, были опубликованы до².
2. Количественное определение ДНК гранулоцитов методом флуоресцентного окрашивания в соответствии с инструкцией^{производителя 11} (см. Таблицу материалов). Готовят раствор ДНК 20 нг/мкл, используя 10 мМ Tris-Cl, 0,5 мМ ЭДТА, рН 9,0 (см. Таблицу материалов).
   1. В дополнение к образцам ДНК, подготовьте по крайней мере три контрольных элемента ДНК: два положительных контроля с NM_004343,3(CALR):c.1099_1150del52, p. (Leu367Thrfs * 46) (делеция 52 bp или мутация типа 1) и NM_004343,3(CALR):c.1154_1155insTTGTC, p. (Lys385Asnfs * 47) (вставка 5 bp или мутация типа 2) генетический вариант, а также ДНК дикого типа и отрицательный контроль в качестве нешаблонного (NTC) контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед выполнением настройки HRM убедитесь, что прибор qPCR откалиброван для экспериментов HRM.
3. Приготовьте qPCR HRM Master Mix по протоколу производителя (см. Таблицу материалов)следующим образом: 10 мкл 2x qPCR Master Mix с красителем, 0,2 мкл 10 мкМ Прямой грунтовки, 0,2 мкл обратной грунтовки 10 мкМ, 8,6 мкл стерильной, РНКазы и ДНКазы свободной_H2O.Используйте грунтовки из Таблицы материалов. Запустите три реплики для каждого образца ДНК и контроля.
   1. Подготовьте qPCR HRM Master Mix в соответствии с количеством обрабатываемых образцов. Включить избыточный объем не менее 10% в расчеты, чтобы обеспечить избыточный объем для потерь, возникающих при переносе реагентов.
4. Перемешайте реакционное содержимое, осторожно постукивая и переворачивая трубку и вихря в течение 2-3 с. Соберите все разбросанные капли от стенки трубки до дна коротким вращением.
5. Подготовьте реакционную пластину, подходящую для прибора и эксперимента HRM (см. Таблицу материалов). Перенос 19 мкл qPCR HRM Master Mix в соответствующие скважины 96-луночной оптической реакционной пластины.
6. Пипетировать 1 мкл отрицательных контрольных, положительных контрольных и проб в соответствующие скважины оптической реакционной пластины. Для NTC перенесите 1 мкл стерильной, свободной от РНКазы и ДНКазы_H2O, используемой для приготовления qPCR HRM Master Mix вместо ДНК.
7. Запечатайте реакционную пластину оптической клейкой пленкой. Делайте это твердо, чтобы предотвратить испарение во время пробега. Убедитесь, что оптическая клейкая пленка находится на плоскости по всем скважинам реакционной пластины, чтобы обеспечить правильное обнаружение флуоресценции.
8. Раскрутите реакционную пластину при 780 х г при комнатной температуре (RT) в течение 1 минуты. Убедитесь, что жидкость находится на дне скважин в реакционной пластине. Приступайте к выполнению анализа.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить пластину при температуре 4 °C не более 24 ч. Дайте пластине, хранящейся при 4 °C, нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском.
9. В соответствии с инструкцией производителя подготовьте и начните запуск для амплификации и расплавления ДНК и получения данных флуоресценции HRM в приборе qPCR. В программном обеспечении приборной системы назначьте элементы управления и пробы соответствующим скважинам.
10. Для обнаружения генетического варианта CALR измените протокол амплификации прибора по умолчанию и амплируйте ДНК, используя следующий протокол теплового цикла: 95 ° C в течение 10 минут, а затем 50 циклов 95 ° C в течение 10 с и 62,5 ° C в течение 60 с.
11. Выполняют стадию кривой/диссоциации расплава (HRM) сразу после qPCR в соответствии с инструкциями^{производителя 12} следующим образом: 95 °C в течение 10 с, 60 °C в течение 1 мин, а затем скорость рампы 0,025 °C/с до 95 °C. Держите температуру при 95 °C в течение 15 с и при 60 °C в течение 15 с.
12. Запуск заканчивается автоматически. Сначала просмотрите и проверьте график усиления(рисунок 2).
13. В меню эксперимента программного обеспечения приборной системы выберите опцию графика усиления. Если данные не отображаются, нажмите зеленую кнопку Анализ.
    1. На вкладке графика усиления в раскрывающемся меню тип диаграммы выберите график, который отображает данные усиления в виде необработанных показаний флуоресценции, нормализованных до флуоресценции от пассивного эталона (ΔRn) в зависимости от числа цикла (ΔRn vs Cycle). В раскрывающемся меню цвет графика выберите Образец.
14. В раскрывающемся меню тип графика выберите тип графика линейного усиления. Отображение базового начального и конечного цикла на графике линейного усиления путем выбора параметра начала базовой линии. Убедитесь, что базовый план задан правильно. Конечный цикл должен быть установлен за несколько циклов до номера цикла, в котором обнаруживается значительный флуоресцентный сигнал. Базовая линия обычно устанавливается от 3 до 15 циклов(рисунок 2).
15. В раскрывающемся меню Тип диаграммы выберите тип диаграммы усиления log10. Отобразите пороговую линию на графике, выбрав параметр порога. Отрегулируйте пороговое значение соответствующим образом, если оно установлено неправильно. Правильно установленное пороговое значение означает, что пороговая линия пересекает экспоненциальную фазу кривых qPCR(рисунок 2).
16. Убедитесь, что нормальные кривые усиления находятся во всех пробных и положительных контрольных скважинах. Убедитесь, что в скважинах NTC нет усиления перед циклом 40. График нормального усиления показывает экспоненциальное увеличение флуоресценции, которое превышает порог между циклами 15 и 35(рисунок 2). Исключить пробные скважины из анализа, если в позиции скважины нет усиления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если график усиления выглядит ненормальным или NTC хорошо указывает на усиление, определите и решите проблему в соответствии с руководством по поиску и устранению неисправностей производителя.
17. Исключить выброс со значением цикла количественной оценки (Cq), которое отличается от реплик более чем на 2 в программном обеспечении приборной системы^12. Выбросы могут привести к ошибочным результатам HRM.
18. В кривых производного расплава просмотрите области/температурные линии до и после расплава. Области до и после расплава должны находиться в пределах плоской области, где нет больших пиков или склонов в флуоресцентных уровнях(рисунок 3). При необходимости отрегулируйте его соответствующим образом. Установите старт и остановку температурных линий до и после расплава примерно на расстоянии 0,5 °C друг от друга(рисунок 3). Перезапустите анализ, если параметры настроены, нажав на кнопку Анализ.
19. На вкладке «Разностный график» на вкладке настроек графика выберите один из элементов управления дикого типа (гомозигота), реплицируемых в качестве эталонной ДНК, и перезапустите анализ, нажав кнопку «Анализировать».
20. На вкладке Выровненные кривые расплава подтвердите, что все положительные элементы управления имеют правильный генотип, а NTC не удалось усилить(рисунок 4). Из таблицы скважин выберите скважины, содержащие положительный контроль, чтобы выделить соответствующую кривую расплава на графиках анализа. Убедитесь, что цвет линии соответствует правильному генотипу. Повторите шаги для скважин, содержащих другие положительные контрольные элементы и NTC.
21. На вкладке Выровненные кривые расплава внимательно просмотрите отображение графиков для неизвестных образцов и сравните их с отображением графиков для элементов управления(рисунок 4). Из таблицы скважин выберите скважины, содержащие неизвестные реплики образцов, проверьте цвет кривой расплава и выровняйте их с контрольными элементами в упорядоченной последовательности, выбрав скважины, содержащие положительные контрольные значения один за другим. Повторите этот процесс для всех неизвестных образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Неизвестный образец содержит вариант одного из элементов управления, если его кривая плавления плотно выровнена с ним. Могут отображаться различные группы вариантов (разные цвета), указывающие на то, что неизвестный образец состоит из неизвестного варианта, не соответствующего элементам управления(рисунок 8). Низкий уровень соматического генетического варианта может присутствовать в образце пациента. Это может повлиять на интерпретацию результата HRM, особенно на пределе обнаружения анализа(рисунок 9). В этих случаях цвет или даже форма линии могут очень напоминать цвет генотипа дикого типа.
    1. Когда результат окажется неубедительным, объедините результаты HRM с результатами электрофореза агарозного геля и методов секвенирования. Повторно протестируйте образец или запрос и при необходимости повторно протестируйте новый образец.
    2. Внимательно просмотрите набор данных для реплицированных кривых и убедитесь, что выравнивание каждой реплики внутри группы является жестким. Исключите репликат, если он не выровнен плотно с другими образцами в группе (выброс). Повторно протестируйте образец, если присутствует больше выбросов, и результаты неубедительны. Имейте в виду, что количество и качество образца ДНК влияют на результаты HRM.
22. Проанализируйте результат для неизвестного образца на вкладке Разностная диаграмма. Повторите процедуру, описанную в шаге 1.21, и убедитесь, что результаты, полученные для неизвестного образца, совпадают.
23. Затем запустите продукты qPCR HRM на агарозном геле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить. Хранить пластину при температуре 4 °C не более 24 часов или при -20 °C в течение более длительного периода времени, но не более 7 дней. Дайте пластине, хранящейся при 4 °C, нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском. Дайте пластине, хранящейся при -20 °C, оттаять и нагреться до RT, а затем ненадолго вращайте пластину перед запуском.

2. Электрофорез агарозного геля

1. Запускайте продукты qPCR HRM на 4% агарозном предварительно литом геле, содержащем флуоресцентное пятно нуклеиновой кислоты, используя соответствующую систему гелевого электрофореза (см. Таблицу материалов, рисунок 5). Запустите только одну положительную, отрицательную реплика NTC и образец qPCR HRM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перчатки всегда следует носить при обращении с гелями. Любая другая система гелевого электрофореза может выполнить эту задачу, если выбран эквивалентный процент агарозы, окрашивание флуоресцентной нуклеиновой кислоты и формат скважины.
2. Запустите систему гелевого электрофореза в соответствии с протоколом производителя (см. Таблицу материалов). Извлеките из упаковки готовый гель в кассете, извлеките гребень и вставьте его в аппарат согласно инструкции производителя (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите гель в течение 15 минут после вскрытия упаковки.
3. Разбавить образец от 10 мкл до 20 мкл стерильным, свободным от РНКазы и ДНКазы_Н2О. Загрузите каждую скважину 20 мкл разбавленного образца.
4. Разбавляют 3 мкл стандартного раствора ДНК до 20 мкл стерильным, РНКазой и ДНКазой свободным_Н2О(см. Таблицу материалов). Загрузите скважину М 20 мкл разбавленного стандартного раствора ДНК(рисунок 6).
5. Заполните любые пустые колодцы 20 мкл стерильной, свободной от РНКазы и ДНКазы_H2O.
6. Сразу же выберите программу в соответствии с процентом запускаемого геля и установите время работы на аппарате на 10 минут.
7. Запустите электрофорез в течение 1 минуты после загрузки образца, нажав кнопку GO. Время электрофореза может быть увеличено, если получено недостаточное разрешение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте максимальное рекомендуемое время работы электрофореза агарозы в соответствии с инструкциями производителя.
8. Когда электрофорез завершен, визуализируйте ДНК в геле с помощью синего света или УФ-трансиллюминации. Визуализация, анализ и хранение изображений электрофореза в основном выполняются гелевым тепловизором с системой фотодокументации(рисунок 5).
9. Анализ и интерпретация визуализированного геля продуктов qPCR HRM путем сравнения результатов неизвестного образца с положительными контрольными элементами(рисунок 7 и рисунок 8).
10. Если неизвестный образец HRM и результаты гелевого электрофореза указывают на наличие неизвестного генетического варианта, секвенируйте продукт qPCR HRM с использованием праймеров, описанных в Таблице материалов в соответствии с протоколом, описанным^13.
    ВНИМАНИЕ: Агарозные гели, содержащие флуоресцентное пятно нуклеиновой кислоты, должны быть надлежащим образом утилизированы в соответствии с правилами учреждения.

Результаты

Успешно амплифицированная область ДНК, представляющая интерес с экспоненциальным увеличением флуоресценции, которая превышает порог между циклами 15 и 35 и очень узкими значениями цикла количественной оценки (Cq) во всех реплицированных образцах и контрольных группах(Рисуно...

Обсуждение

Расплавление ДНК с высоким разрешением является простым решением для генотипирования и сканирования генетических вариантов^14. Это зависит от различий последовательностей, которые приводят к гетеродуплексам, которые изменяют форму кривой плавления. Различные типы генети...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
E-Gel EX 4% Agarose	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G401004
Fuorometer 3.0 QUBIT	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q33216
Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	G6465EU
MeltDoctor HRM MasterMix 2X	Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific	4415440	Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4346907
MicroAmp Optical adhesive film	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4311971
NuGenius	Syngene	NG-1045	Gel documentation systems
Primer CALRex9 Forward	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCAAGGCCCTGAGGTGT'3 (High-Purity, Salt-Free)
Primer CALRex9 Reverse	Eurofins Genomics		Sequence: 5'GGCCTCAGTCCAGCCCTG'3 (High-Purity, Salt-Free)
QIAamp DNA Mini Kit	QIAGEN	51306	DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.
Qubit Assay Tubes	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32856
QUBIT dsDNA HS assay	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	Q32854
Trackit 100bp DNA Ladder	Invitrogen, Thermo Fischer Scientific	10488058	Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.
ViiA7 Real-Time PCR System	Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific	4453534
Water nuclease free	VWR, Life Science	436912C	RNase, DNase and Protease free water