A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
يوفر البروتوكول الموصوف تحليلا كميا محسنا لعينات الأنسجة باستخدام نهجين: الكمية الخالية من التسميات والملصقات. وتستند النهج القائمة على التسمية إلى ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات، في حين أن النهج الخالي من الملصقات أكثر فعالية من حيث التكلفة ويستخدم لتحليل مئات العينات من الفوج.
وقد أدت التطورات الأخيرة في قياس الطيف الكتلي إلى تحليل بروتيومي عميق إلى جانب توليد مجموعات بيانات قوية وقابلة للاستنساخ. ومع ذلك ، على الرغم من التقدم التقني الكبير ، فإن إعداد العينة من البكبيمنات الحيوية مثل دم المريض ، CSF ، والأنسجة لا يزال يشكل تحديات كبيرة. لتحديد المؤشرات الحيوية، غالبا ما يوفر بروتيوم الأنسجة مصدر عينة جذاب لترجمة نتائج البحث من مقاعد البدلاء إلى العيادة. يمكن أن تكشف عن المؤشرات الحيوية المرشح المحتملة للتشخيص المبكر للسرطان والأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر، ومرض باركنسون، الخ. تنتج بروتينات الأنسجة أيضا ثروة من المعلومات النظامية استنادا إلى وفرة البروتينات وتساعد على معالجة الأسئلة البيولوجية المثيرة للاهتمام.
يمكن تجميع التحليل الكمي للبروتيوميات في فئتين واسعتين: نهج قائم على التسمية ونهج خال من التسميات. في النهج القائم على التسمية، يتم تسمية البروتينات أو الببتيدات باستخدام نظائر مستقرة مثل SILAC (وضع علامات النظائر المستقرة مع الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا) أو عن طريق العلامات الكيميائية مثل ICAT (علامات التقارب المرمزة بالنظائر)، TMT (علامة الكتلة جنبا إلى جنب) أو iTRAQ (علامة النظائر للكمية النسبية والمطلقة). النهج القائمة على التسمية لديها ميزة كمية أكثر دقة من البروتينات واستخدام تسميات isobaric، يمكن تحليل عينات متعددة في تجربة واحدة. ويوفر النهج الخالي من الملصقات بديلا فعالا من حيث التكلفة للنهج القائمة على الملصقات. يمكن تحليل مئات عينات المرضى المنتمين إلى مجموعة معينة ومقارنتها بالأفواج الأخرى استنادا إلى الميزات السريرية. هنا ، وصفنا سير عمل البروتيوم الكمي الأمثل لعينات الأنسجة باستخدام طرق التنميط البروتيوم الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية ، وهو أمر بالغ الأهمية للتطبيقات في علوم الحياة ، وخاصة المشاريع القائمة على اكتشاف العلامات الحيوية.
تقنيات البروتيوميات لديها القدرة على تمكين تحديد وتحديد كمي من علامات المرشح المحتملة التي يمكن أن تساعد في الكشف عن المرضوتكهناته 1. وقد عجلت التطورات الأخيرة في مجال قياس الطيف الكتلي البحوث السريرية على مستوى البروتين. يحاول الباحثون التصدي لتحدي علم الأحياء المرضية المعقد للعديد من الأمراض باستخدام البروتيوميات القائمة على قياس الطيف الكتلي ، والتي توفر الآن حساسية متزايدة لتحديد البروتين وتحديد كميته2. قياس دقيق كمي للبروتينات أمر بالغ الأهمية لفهم التعاون الديناميكي والمكاني بين البروتينات في الأفراد الأصحاء والمرضى3; ومع ذلك ، فإن مثل هذا التحليل على نطاق واسع البروتيوم ليس سهلا.
أحد القيود الرئيسية للتنميط البروتيني للعينات السريرية هو تعقيد العينات البيولوجية. وقد تم التحقيق في العديد من أنواع مختلفة من العينات لدراسة البروتيوم المرض، مثل خطوط الخلايا والبلازما والأنسجة4،5. وتستخدم خطوط الخلايا على نطاق واسع كنماذج في التجارب المختبرية لمحاكاة مراحل مختلفة من تطور المرض. ومع ذلك, أحد القيود الرئيسية مع خطوط الخلية هو أنها تكتسب بسهولة genotypic والتغيرات phenotypic أثناء عملية زراعة الخلايا6. يمكن أن تكون سوائل الجسم مثل البلازما مصدرا جذابا لاكتشاف العلامات الحيوية؛ ومع ذلك ، نظرا للبروتينات وفيرة للغاية ومجموعة ديناميكية من تركيز البروتين ، البلازما بروتيوميات قليلا أكثر تحديا7. هنا، الببتيدات نشأت من البروتينات الأكثر وفرة يمكن قمع تلك المستمدة من البروتينات وفيرة منخفضة حتى لو كانت نسبة الكتلة / تهمة هو نفسه6. على الرغم من أن هناك تقدما في تقنيات الاستنفاد والتفكك في السنوات القليلة الماضية ، والحصول على تغطية جيدة لا يزال قيدا رئيسيا من بروتيوم البلازما8،9. ويفضل استخدام الأنسجة للتحقيق proteomic من بيولوجيا المرض وعينات الأنسجة هي الأكثر قريبة من مواقع المرض وتقديم معلومات فسيولوجية ومرضية عالية لتوفير رؤى أفضل في بيولوجيا المرض10،11.
في هذه المخطوطة، قدمنا بروتوكولا مبسطا لعلم البروتينات الكمي لعينات الأنسجة. لقد استخدمنا عازلة تحتوي على 8 M اليوريا لإعداد الأنسجة lysate كما هذا العازلة متوافقة مع التحقيقات القائمة على قياس الطيف الكتلي. ومع ذلك ، فإنه إلزامي لتنظيف الببتيدات لإزالة الأملاح قبل حقنها في مطياف الكتلة. نقطة واحدة مهمة أن نتذكر هو تقليل تركيز اليوريا إلى أقل من 1 M قبل إضافة التريبسين لهضم البروتين كما يظهر تريبسين نشاط منخفض في تركيز اليوريا 8 M. لقد شرحنا نهجين من البروتيات العالمية الكمية: القياس الكمي القائم على التسمية باستخدام iTRAQ (علامات إيسوباك للقياس الكمي النسبي والمطلق) والتحديد الكمي الخالي من الملصقات (LFQ). يستخدم البروتيوم الكمي القائم على iTRAQ بشكل رئيسي لمقارنة عينات متعددة تختلف في حالتها البيولوجية (على سبيل المثال ، طبيعي مقابل المرض أو عينات المعالجة). يستخدم هذا النهج الكواشف الإسوباريك لتسمية الأمينات الأولية N-المحطة من الببتيدات12. تحتوي كاشفات iTRAQ على مجموعة مراسل N-methyl piperazine ، ومجموعة موازنة ، ومجموعة إستر N-hydroxy succinimide التي تتفاعل مع الأمينات الأولية N-terminal من الببتيدات13. يتم تسمية الببتيدات المهضومة من كل حالة مع كاشف iTRAQ معين. بعد وضع العلامات ، يتم إيقاف رد الفعل ويتم تجميع الببتيدات المسماة من ظروف مختلفة في أنبوب واحد. يتم تحليل خليط العينة المشترك هذا بواسطة مطياف الكتلة لتحديده وتحديد كمي. بعد تحليل MS / MS ، يتم إنشاء شظايا أيون المراسل ذات الكتل الجزيئية المنخفضة وتستخدم كثافة أيونات المراسل هذه للقياس الكمي للبروتينات.
وثمة نهج آخر، وهو القياس الكمي الخالي من الملصقات، يستخدم لتحديد العدد النسبي للبروتينات في العينات المعقدة دون وضع علامات على الببتيدات ذات النظائر المستقرة.
وقد استعرضت هذه الدراسة ووافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية ولجنة الأخلاقيات التابعة للمعهد الهندي للتكنولوجيا بومباي (IITB-IEC/2016/026). قدم المرضى / المشاركون موافقتهم الخطية للمشاركة في هذه الدراسة.
1. إعداد lysate الأنسجة
ملاحظة: تنفيذ كافة الخطوات التالية على الجليد للحفاظ على proteases غير نشط. تأكد من أن المشرط وأي أنابيب تستخدم معقمة لتجنب أي تلوث متقاطع.
2. تحديد كمية البروتين وفحص جودة الأنسجة lysates
3. الهضم الأنزيمي للبروتينات
ملاحظة: تظهر خطوات الهضم الأنزيمي في الشكل 1أ.
4. إزالة الببتيدات المهضومة
ملاحظة: لتنفيذ تحلية الببتيدات، استخدم نصائح المرحلة C18.
5. تحديد كمي للببتيدات المجففة
6. الكمية الخالية من الملصقات (LFQ) للببتيدات المهضومة
ملاحظة: للحصول على الكمية الخالية من التسمية، استخدم معلمات LC وMS المذكورة في الملف التكميلي 2. وتم الحصول على بيانات تغطية عالية عندما تم تشغيل ثلاث نسخ بيولوجية من نفس النوع من العينة في مطياف الكتلة.
7. الكمية القائمة على التسمية (iTRAQ) من الببتيدات المهضومة
ملاحظة: يمكن إجراء القياس الكمي المستند إلى التسمية باستخدام تسميات إيزوباريك مختلفة مثل كاشفات iTRAQ أو TMT، إلخ. هنا، تم استخدام iTRAQ 4-plex لتسمية الببتيدات المهضومة من ثلاث عينات من الأنسجة. يتم ذكر إجراء وضع العلامات iTRAQ 4-plex أدناه.
8. تحليل البيانات
لقد استخدمنا نهجين مختلفين لاكتشاف بروتيوميات: نهج البروتيوميات الخالية من الملصقات والقائمة على التسمية. وأظهرت ملامح البروتين من عينات الأنسجة على SDS-PAGE البروتينات سليمة ويمكن النظر للتحليل بروتيوميك(الشكل 2A). مراقبة الجودة فحص الصك تم رصدها عن طريق نظام ملاءمة ال?...
بروتيوم الأنسجة من العينات البيولوجية تمكننا من استكشاف المؤشرات الحيوية المحتملة الجديدة المرتبطة بمراحل مختلفة من تطور المرض. كما يشرح آلية الإشارات والمسارات المرتبطة بتطور المرض. يوفر البروتوكول الموصوف لتحليل البروتيوم الكمي للأنسجة بيانات تغطية جيدة قابلة للاستنساخ. وقد تم تكيي?...
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
نعترف بمشروع MHRD-UAY (UCHHATAR AVISHKAR YOJANA)، #34_IITB المشروع إلى مرفق SS و MASSFIITB في IIT Bombay بدعم من إدارة التكنولوجيا الحيوية (BT/PR13114/INF/22/206/2015) لإجراء جميع التجارب المتعلقة بالتصلب المتعدد.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
Acetonitrile (MS grade) | Fisher Scientific | A/0620/21 | |
Bovine Serum Albumin | HiMedia | TC194-25G | |
Calcium chloride | Fischer Scienific | BP510-500 | |
Formic acid (MS grade) | Fisher Scientific | 147930250 | |
Iodoacetamide | Sigma | 1149-25G | |
Isopropanol (MS grade) | Fisher Scientific | Q13827 | |
Magnesium Chloride | Fischer Scienific | BP214-500 | |
Methanol (MS grade) | Fisher Scientific | A456-4 | |
MS grade water | Pierce | 51140 | |
Phosphate Buffer Saline | HiMedia | TL1006-500ML | |
Protease inhibitor cocktail | Roche Diagnostics | 11873580001 | |
Sodium Chloride | Merck | DF6D661300 | |
TCEP | Sigma | 646547 | |
Tris Base | Merck | 648310 | |
Trypsin (MS grade) | Pierce | 90058 | |
Bradford Reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
Urea | Merck | MB1D691237 | |
Supplies | |||
Hypersil Gold C18 column | Thermo | 25002-102130 | |
Micropipettes | Gilson | F167380 | |
Stage tips | MilliPore | ZTC18M008 | |
Zirconia/Silica beads | BioSpec products | 11079110z | |
Equipment | |||
Bead beater (Homogeniser) | Bertin Minilys | P000673-MLYS0-A | |
Microplate reader (spectrophotometer) | Thermo | MultiSkan Go | |
pH meter | Eutech | CyberScan pH 510 | |
Probe Sonicator | Sonics Materials, Inc | VCX 130 | |
Shaking Drybath | Thermo | 88880028 | |
Orbitrap Fusion mass spectrometer | Thermo | FSN 10452 | |
Nano LC | Thermo | EASY-nLC1200 | |
Vacuum concentrator | Thermo | Savant ISS 110 | |
Software | |||
Proteome Discoverer | Thrermo | Proteome Discoverer 2.2.0.388 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved