Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

Résumé

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Résumé

Les progrès récents de la spectrométrie de masse ont abouti à une analyse protéomique approfondie ainsi qu’à la génération d’ensembles de données robustes et reproductibles. Cependant, malgré les progrès techniques considérables, la préparation d’échantillons à partir d’échantillons biologiques tels que le sang des patients, le LCR et les tissus pose encore des défis considérables. Pour identifier les biomarqueurs, la protéomique tissulaire fournit souvent une source d’échantillon attrayante pour traduire les résultats de la recherche du laboratoire à la clinique. Il peut révéler des biomarqueurs potentiels candidats pour le diagnostic précoce du cancer et des maladies neurodégénératives telles que la maladie d’Alzheimer, la maladie de Parkinson, etc. La protéomique tissulaire produit également une mine d’informations systémiques basées sur l’abondance des protéines et aide à répondre à des questions biologiques intéressantes.

L’analyse protéomique quantitative peut être regroupée en deux grandes catégories : une approche basée sur l’étiquette et une approche sans étiquette. Dans l’approche basée sur l’étiquette, les protéines ou les peptides sont marqués à l’aide d’isotopes stables tels que SILAC (marquage isotopique stable avec des acides aminés en culture cellulaire) ou par des marqueurs chimiques tels que ICAT (marqueurs d’affinité codés isotopiques), TMT (marqueur de masse tandem) ou iTRAQ (marqueur isobare pour la quantification relative et absolue). Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines et en utilisant des étiquettes isobares, plusieurs échantillons peuvent être analysés en une seule expérience. L’approche sans étiquette offre une alternative rentable aux approches basées sur l’étiquette. Des centaines d’échantillons de patients appartenant à une cohorte particulière peuvent être analysés et comparés à d’autres cohortes en fonction des caractéristiques cliniques. Ici, nous avons décrit un flux de travail protéomique quantitatif optimisé pour les échantillons de tissus à l’aide de méthodes de profilage du protéome sans étiquette et basées sur l’étiquette, ce qui est crucial pour les applications dans les sciences de la vie, en particulier les projets basés sur la découverte de biomarqueurs.

Introduction

Les technologies protéomiques ont le potentiel de permettre l’identification et la quantification de marqueurs candidats potentiels qui peuvent aider à la détection et au pronostic de la maladie¹. Les progrès récents dans le domaine de la spectrométrie de masse ont accéléré la recherche clinique au niveau des protéines. Les chercheurs tentent de relever le défi de la pathobiologie compliquée de plusieurs maladies en utilisant la protéomique basée sur la spectrométrie de masse, qui offre maintenant une sensibilité accrue pour l’identification et la quantification des protéines². Une mesure quantitative précise des protéines est cruciale pour comprendre la coopération dynamique et spatiale entre les protéines chez les individus sains et malades³; cependant, une telle analyse à l’échelle du protéome n’est pas facile.

L’une des principales limites du profilage protéomique des échantillons cliniques est la complexité des échantillons biologiques. De nombreux types d’échantillons différents ont été étudiés pour étudier le protéome de la maladie, tels que les lignées cellulaires, le plasma et les tissus^4,5. Les lignées cellulaires sont largement utilisées comme modèles dans des expériences in vitro pour imiter différents stades de la progression de la maladie. Cependant, une limitation majeure avec les lignées cellulaires est qu’elles acquièrent facilement des changements génotypiques et phénotypiques au cours du processus de culture cellulaire⁶. Les fluides corporels tels que le plasma pourraient être une source attrayante pour la découverte de biomarqueurs; cependant, en raison de la forte abondance des protéines et de la plage dynamique de concentration en protéines, la protéomique plasmatique est un peu plus difficile⁷. Ici, les peptides issus des protéines les plus abondantes peuvent supprimer celles dérivées des protéines peu abondantes même si le rapport masse/charge est le même^6. Bien qu’il y ait eu des progrès dans les technologies d’épuisement et de fractionnement au cours des dernières années, obtenir une bonne couverture reste une limitation majeure de la protéomique^{plasmatique 8,9}. L’utilisation de tissus pour l’investigation protéomique de la biologie de la maladie est préférée car les échantillons de tissus sont les plus proches des sites de la maladie et offrent des informations physiologiques et pathologiques élevées pour fournir de meilleures informations sur la biologie de la maladie^10,11.

Dans ce manuscrit, nous avons fourni un protocole simplifié pour la protéomique quantitative des échantillons de tissus. Nous avons utilisé un tampon contenant de l’urée de 8 M pour la préparation du lysate tissulaire car ce tampon est compatible avec les investigations basées sur la spectrométrie de masse. Cependant, il est obligatoire de nettoyer les peptides pour éliminer les sels avant de les injecter dans le spectromètre de masse. Un point important à retenir est de réduire la concentration d’urée à moins de 1 M avant d’ajouter de la trypsine pour la digestion des protéines, car la trypsine présente une faible activité à une concentration d’urée de 8 M. Nous avons expliqué deux approches de la protéomique globale quantitative : la quantification basée sur l’étiquette à l’aide d’iTRAQ (étiquettes isobares pour la quantification relative et absolue) et la quantification sans étiquette (LFQ). La protéomique quantitative basée sur l’iTRAQ est principalement utilisée pour comparer plusieurs échantillons dont l’état biologique varie (p. ex., échantillons normaux par rapport à la maladie ou traités). L’approche utilise des réactifs isobares pour étiqueter les amines primaires N-terminales des peptides^12. Les réactifs iTRAQ contiennent un groupe rapporteur N-méthyl pipérazine, un groupe équilibreur et un groupe ester N-hydroxy succinimide qui réagit avec les amines primaires N-terminales des peptides^13. Les peptides digérés de chaque condition sont marqués avec un réactif iTRAQ particulier. Après le profilage, la réaction est arrêtée et les peptides marqués de différentes conditions sont regroupés dans un seul tube. Ce mélange d’échantillons combinés est analysé par spectromètre de masse pour identification et quantification. Après l’analyse MS/MS, des fragments d’ions rapporteurs de faible masse moléculaire sont générés et les intensités ioniques de ces ions rapporteurs sont utilisées pour la quantification des protéines.

Une autre approche, la quantification sans étiquette, est utilisée pour déterminer le nombre relatif de protéines dans des échantillons complexes sans étiqueter les peptides avec des isotopes stables.

Protocole

Cette étude a été examinée et approuvée par les comités d’examen institutionnels et le comité d’éthique de l’Institut indien de technologie de Bombay (IITB-IEC/2016/026). Les patients/participants ont donné leur consentement écrit pour participer à cette étude.

1. Préparation du lysate tissulaire

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes suivantes sur la glace pour garder les protéases inactives. Assurez-vous que les scalpels et les tubes utilisés sont stériles pour éviter toute contamination croisée.

1. Prenez environ 30 mg de tissu dans un tube battant les billes, ajoutez 200 μL de solution saline tampon phosphate (PBS) et vortexez-la.
   REMARQUE: Dans cette étude, des tissus tumoraux cérébraux humains frais congelés ont été prélevés pour la préparation du lysate. Le protocole peut être utilisé pour tout tissu frais congelé avec quelques changements en fonction du type de tissus (tissus mous ou durs) et de la complexité cellulaire des tissus.
2. Après cela, faites tourner le tube pour déposer le tissu et retirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette. Effectuez un autre lavage PBS s’il reste encore des traces de sang dans les tissus.
3. Ajouter 300 μL de tampon de lyse de l’urée (8 M d’urée, 50 mM tris pH 8,0, 75 mM naCl, 1 mM MgCl₂₎et un cocktail d’inhibiteurs de protéase (PIC) conformément au protocole du fabricant.
   REMARQUE: Le volume du tampon de lyse doit être suffisant pour broyer le tissu pendant le processus de sonication et pour suspendre ce qui est extrait. Trop peu de tampon de lyse peut entraîner une lyse tissulaire inefficace, tandis qu’un tampon de lyse trop important diluera le lysate de protéine.
4. Placez le tube sur de la glace et soniquez le tissu à une amplitude de 40% pendant 2,5 min avec des cycles d’impulsion de 5 s (ON / OFF, respectivement).
5. Ajouter des billes de zirconium aux tubes et homogénéiser le tissu à l’aide d’un batteur de billes pendant 90 s avec 5 min d’incubation sur glace. Répétez cette étape deux fois.
6. Une fois que le tissu est correctement homogénéisé, incuber le tube sur de la glace pendant 10 min.
7. Après incubation, centrifuger l’échantillon à 6 018 x g pendant 15 min à 4 °C pour séparer les débris cellulaires du surnageant.
8. Recueillir le surnageant dans le tube frais étiqueté et le conserver à -80 °C sous forme d’aliquotes jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Quantification des protéines et contrôle de la qualité des lysates tissulaires

1. Quantifier la concentration de protéines dans le lysate tissulaire à l’aide du réactif de Bradford tel que décrit dans le dossier supplémentaire 1.
2. Après la quantification des protéines, faire passer 10 μg de lysate tissulaire sur un gel SDS-PAGE à 12% pour vérifier la qualité du lysate.
   NOTE: Le traitement ultérieur en aval ne doit être effectué que pour les lysates qui effectuent les contrôles de qualité.

3. Digestion enzymatique des protéines

REMARQUE: Les étapes de la digestion enzymatique sont illustrées à la figure 1a.

1. Pour la digestion, prendre 50 μg de protéines et ajouter ddH₂O pour porter le volume à 20 μL.
2. Maintenant, préparez 20 mM de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP) à partir du stock (0,5 M TCEP) en ajoutant 0,8 μL du stock au lysate de protéine pour réduire les liaisons disulfure dans les protéines et incuber l’échantillon à 37 °C pendant 60 min.
3. Préparer 40 mM d’iodoacétamide (IAA) dans du ddH₂O et ajouter 1,6 μL pour alkyler les résidus de cystéine réduits. Incuber dans l’obscurité pendant 10 min à température ambiante.
4. Ajouter un tampon de dilution contenant 25 mM de Tris pH 8,0 et 1 mM de_CaCl2 dans un rapport de 1:8 pour diluer la concentration d’urée à moins de 1 M dans l’échantillon. À ce stade, vérifiez le pH.
   REMARQUE: Si vous utilisez la trypsine comme enzyme de digestion, assurez-vous que la concentration d’urée est inférieure à 1 M.
5. Pour effectuer la digestion, ajoutez de la trypsine à un rapport enzyme/substrat de 1:50. Incuber les tubes à 37 °C dans un bain sec et agité pendant 16 h pour une digestion nocturne.
   REMARQUE: L’enzyme trypsine est une protéase hautement réactive qui est sujette à l’auto-digestion. Prenez des précautions supplémentaires et effectuez l’ajout de trypsine rapidement sur la glace.
6. Après 16 h d’incubation, sécher les peptides digérés dans un concentrateur sous vide.

4. Dessalage des peptides digérés

REMARQUE: Pour effectuer le dessalage des peptides, utilisez des embouts de stade C18.

1. Activez l’embout de l’étage C18 en ajoutant 50 μL de méthanol. Centrifuger la pointe à 1 000 x g pendant 2 min à RT. Jeter le filtrat recueilli au fond du tube. Répétez deux fois.
2. Ajouter 50 μL d’acétonitrile dans de l’acide formique à 0,1 % pour laver la pointe de la scène. Centrifuger le tube à 1 000 x g pendant 2 min à RT. Jeter le filtrat recueilli au fond du tube. Répétez cette étape deux fois.
3. Ajouter 50 μL de 0,1 % (v/v) FA pour équilibrer la colonne. Encore une fois, effectuez la centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min à TA et jetez le filtrat.
4. Reconstituer les peptides digérés séchés dans 50 μL d’acide formique à 0,1 %.
   REMARQUE: Évitez la formation de bulles d’air à l’intérieur des extrémités de la scène lors du passage de l’échantillon. Les pointes de stade ne doivent pas être complètement séchées pendant l’étape de centrifugation, car le séchage peut entraîner une perte de peptides.
5. Ajouter les peptides reconstitués dans la pointe de l’étape activée et faire passer l’échantillon à travers la pointe de l’étape par centrifugation à 1 000 x g pendant 2 min. Répétez cette étape au moins quatre fois. Conserver le débit à 4 °C.
6. Pour laver l’échantillon, ajouter 50 μL d’acide formique à 0,1 % (v/v). Répétez l’étape de centrifugation et jetez le filtrat.
7. Pour l’élution des peptides, ajouter 50 μL d’ACN à 40 % (v/v) dans de l’acide formique à 0,1 % (v/v) et le faire passer à travers la pointe de l’étape par centrifugation. Recueillir le filtrat dans un tube frais. Répétez l’étape avec 50% et 60% d’ACN dans 0,1% d’acide formique et collectez le filtrat dans le même tube frais.
8. Sécher les peptides dessalés recueillis dans le tube frais à l’aide d’un concentrateur sous vide.
   REMARQUE: Les peptides dessalés séchés sont prêts à être injectés, ou ils peuvent être conservés à -20 ° C pendant 6 mois. Pour un stockage à long terme (>6 mois), stockez les peptides à -80 °C.

5. Quantification des peptides dessalés

1. Reconstituer les peptides dessalés séchés dans 0,1% FA.
2. Essuyez la plaque de mesure photométrique avec du tissu non pelucheux à l’aide d’éthanol à 70%.
3. Utilisez 2 μL de 0,1 % FA pour définir le blanc.
4. Ajouter 2 μL d’échantillons reconstitués sur la plaque en répétitions.
5. Placez la plaque dans le spectrophotomètre et mesurez l’absorbance à 205 nm et 280 nm.
6. Calculer l’absorptivité molaire (ε) à l’aide de la formule suivante :
   ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
   REMARQUE: L’absorptivité molaire (ε) est une mesure de la probabilité de la transition électronique ou de la façon dont une espèce absorbe la longueur d’onde particulière du rayonnement qui y est incident. La valeur de ε doit être comprise entre 31 mL mg^-1cm^-1 et 33 mL mg^-1cm^-1. Si la valeur ne se situe pas dans la plage, cela indique que les échantillons ne sont pas correctement digérés.
7. Calculer la concentration peptidique en μg/μL à l’aide de la formule suivante :
   Concentration de peptide = OD nette (205) / 0,051 * ε

6. Quantification sans étiquette (LFQ) des peptides digérés

REMARQUE: Pour une quantification sans étiquette, utilisez les paramètres LC et MS mentionnés dans le fichier supplémentaire 2. Des données à couverture élevée ont été obtenues lorsque trois répliques biologiques du même type d’échantillon ont été exécutées dans le spectromètre de masse.

1. Configuration de la chromatographie liquide
   1. Après la quantification des peptides dessalés, prendre 2 μg de peptides dans un flacon et porter le volume à 10 μL en utilisant 0,1% DE FA. La concentration de peptides dessalés sera de 200 ng/μL.
   2. Ouvrez l’auto-échantillonneur du système de chromatographie liquide (voir Tableau des matériaux)et placez le flacon à l’intérieur de l’échantillonneur automatique.
   3. Utilisez 0,1 % (v/v) d’AF pour équilibrer la pré-colonne et la colonne analytique.
   4. Prenez 1 μg de peptide digéré dessalé du flacon et chargez-le sur la colonne.
   5. Définissez le gradient LC en fonction de la complexité de l’échantillon. Dans cette expérience, le gradient LC a été utilisé pendant 120 minutes pour la quantification sans étiquette des échantillons de tissus.
2. Configuration de la SEP: Avant d’optimiser les tests protéomiques, effectuez un contrôle de la qualité de l’instrument en surveillant certains peptides de l’albumine sérique bovine (BSA) à l’aide de tout logiciel pour l’adéquation du système et en analysant la couverture de BSA (Figure 2A, B). Les paramètres d’acquisition ont été définis dans l’instrument à l’aide du logiciel d’acquisition de données MS (voir Tableau des matériaux).
   1. Ouvrez le logiciel, double-cliquez sur Instrument Set Up et sélectionnez le modèle de peptides-ID avec les paramètres par défaut.
   2. Définissez les paramètres MS à l’aide du fichier supplémentaire 2 et enregistrez-le en tant que nouvelle méthode.
   3. Maintenant, ouvrez le logiciel pour remplir les détails de l’exemple; double-cliquez sur Configuration de la séquenceet remplissez les détails tels que le type d’échantillon, le nom de l’échantillon, l’emplacement d’enregistrement du fichier, le fichier de méthode de l’instrument, le volume d’injection et la position de l’échantillon.
   4. Une fois toutes les informations remplies, sélectionnez la ligne et démarrez l’exécuter.

7. Quantification par étiquette (iTRAQ) des peptides digérés

REMARQUE: La quantification basée sur l’étiquette peut être effectuée à l’aide de différentes étiquettes isobares telles que les réactifs iTRAQ ou TMT, etc. Ici, iTRAQ 4-plex a été utilisé pour le étiquetage de peptides digérés à partir de trois échantillons de tissus. La procédure d’étiquetage iTRAQ 4-plex est mentionnée ci-dessous.

1. Étiquetage des peptides digérés à l’aide de réactifs iTRAQ.
   REMARQUE: Dans cette expérience, des peptides provenant de trois échantillons de tissus sont utilisés. De chaque échantillon de tissu, 80 μg de peptides digérés sont prélevés dans quatre tubes pour le étiquetage avec des réactifs iTRAQ (114, 115, 116 et 117) (voir le dossier supplémentaire 3 pour les paramètres expérimentaux détaillés).
   1. Avant d’utiliser le réactif iTRAQ, porter chaque flacon du réactif à température ambiante (environ 5 min). Donner un bref tour d’environ 30 s pour amener la solution au fond de chaque flacon.
      REMARQUE: Assurez-vous que dans chaque flacon, une solution de 10 à 15 μL doit être présente.
   2. Pour le étiquetage iTRAQ, reconstituer les peptides séchés dans 20 μL de tampon de dissolution fourni dans le kit de étiquetage iTRAQ.
   3. Reconstituer les étiquettes en ajoutant 70 μL d’éthanol à partir du flacon fourni dans le kit et mélanger la solution pendant 30 s et la faire tourner pendant 10 s.
      REMARQUE: Il est conseillé que toutes les étapes soient effectuées conformément aux instructions du fabricant.
   4. Ajouter les étiquettes iTRAQ mélangées de manière homogène (114, 115, 116 et 117) à leurs tubes respectifs contenant des échantillons de peptides et permettre la réaction de étiquetage.
   5. Mélangez les composants de chaque tube en faisant tourbillon du tube pendant 30 s, puis faites tourner le tube pendant 10 s pour ramener le mélange au fond du tube.
      REMARQUE: Vérifiez le pH de la solution à l’aide de papier pH. Le pH doit être supérieur à 8; sinon, additionner jusqu’à 10 μL du tampon de dissolution pour ajuster le pH.
   6. Incuber chaque tube à température ambiante pendant 90 min. À la fin de la réaction, éteindre tout excès d’étiquette non liée dans le tube en ajoutant de l’eau de qualité MS.
   7. Incuber les tubes à température ambiante pendant 30 min à 1 h.
   8. Une fois l’incubation terminée, transférez tout le contenu marqué dans un seul tube et séchez les peptides marqués dans un concentrateur sous vide.
      REMARQUE: Une procédure d’étiquetage similaire peut être suivie pour l’étiquetage TMT.
2. Configuration de la chromatographie liquide
   1. Reconstituer les échantillons en acide formique à 0,1%, ouvrir l’échantillonneur automatique de nano LC et placer les échantillons à l’intérieur de l’échantillonneur automatique. Utilisez les paramètres mentionnés dans le fichier supplémentaire 2 pour la configuration LC.
   2. Définissez le gradient LC en fonction de la complexité de l’échantillon. Un gradient LC de 180 min a été utilisé dans cette expérience pour la quantification basée sur l’étiquette (iTRAQ) des échantillons de tissus.
      REMARQUE: Pour les échantillons moins complexes, un gradient court peut séparer efficacement la plupart des peptides. Cependant, si l’échantillon est très complexe, utilisez un gradient plus long pour une meilleure séparation des peptides.
3. Configuration MS pour la technique iTRAQ
   1. Configurez tous les paramètres MS pour la quantification basée sur l’étiquette de la même manière que celui utilisé pour la quantification sans étiquette, à l’exception de l’énergie de collision, qui a été fixée à 35 % pour la fragmentation MS/MS dans la quantification basée sur l’étiquette.

8. Analyse des données

1. Analyser les fichiers bruts (spectre MS/MS) obtenus à partir du spectromètre de masse LC à l’aide d’un logiciel d’analyse disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: La base de données human reference Proteome d’Uniprot (UP000005640) comprenant 71 785 séquences de protéines a été utilisée pour obtenir des identités de protéines à l’aide des moteurs de recherche Sequest HT et Mascot (v2.6.0). Les paramètres de la quantification sans étiquette et de la quantification basée sur l’étiquette sont décrits dans le fichier supplémentaire 4.

Résultats

Nous avons utilisé deux approches différentes pour la protéomique de découverte : les approches protéomiques sans étiquette et les approches protéomiques basées sur l’étiquette. Le profil protéique des échantillons de tissus sur SDS-PAGE a montré les protéines intactes et a pu être pris en compte pour l’analyse protéomique (Figure 2A). Le contrôle de la qualité de l’instrument a été surveillé à l’intermédiaire d’un logiciel d’adéquation du système...

Discussion

La protéomique tissulaire des échantillons biologiques nous permet d’explorer de nouveaux biomarqueurs potentiels associés à différents stades de progression de la maladie. Il explique également le mécanisme de signalisation et les voies associées à la progression de la maladie. Le protocole décrit pour l’analyse protéomique quantitative des tissus fournit de bonnes données de couverture reproductibles. La plupart des étapes ont été adaptées des instructions du fabricant. Afin d’obtenir des données...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388