Flusso di lavoro completo di proteomica shotgun basata su spettrometria di massa di campioni di tessuto

Riepilogo

Il protocollo descritto fornisce un'analisi proteomica quantitativa ottimizzata di campioni di tessuto utilizzando due approcci: la quantificazione basata su etichette e la quantificazione senza etichette. Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine, mentre un approccio senza etichette è più economico e utilizzato per analizzare centinaia di campioni di una coorte.

Abstract

I recenti progressi nella spettrometria di massa hanno portato a un'analisi proteomica profonda insieme alla generazione di set di dati robusti e riproducibili. Tuttavia, nonostante i notevoli progressi tecnici, la preparazione del campione da parte di biocampimenti come il sangue del paziente, il CSF e il tessuto pone ancora sfide considerevoli. Per identificare i biomarcatori, la proteomica tissutale spesso fornisce un'interessante fonte di campioni per tradurre i risultati della ricerca dal banco alla clinica. Può rivelare potenziali biomarcatori candidati per la diagnosi precoce del cancro e delle malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer, il morbo di Parkinson, ecc. La proteomica tissutale produce anche una ricchezza di informazioni sistemiche basate sull'abbondanza di proteine e aiuta ad affrontare interessanti questioni biologiche.

L'analisi proteomica quantitativa può essere raggruppata in due grandi categorie: un approccio basato su etichette e un approccio privo di etichette. Nell'approccio basato sull'etichetta, le proteine o i peptidi sono etichettati utilizzando isotopi stabili come SILAC (etichettatura isotopica stabile con amminoacidi in coltura cellulare) o da tag chimici come ICAT (tag di affinità codificati con isotopi), TMT (tag di massa tandem) o iTRAQ (tag isobarico per la quantificazione relativa e assoluta). Gli approcci basati su etichette hanno il vantaggio di una quantificazione più accurata delle proteine e utilizzando etichette isobariche, è possibile analizzare più campioni in un singolo esperimento. L'approccio senza etichette fornisce un'alternativa economica agli approcci basati sulle etichette. Centinaia di campioni di pazienti appartenenti a una particolare coorte possono essere analizzati e confrontati con altre coorti in base alle caratteristiche cliniche. Qui, abbiamo descritto un flusso di lavoro di proteomica quantitativa ottimizzato per campioni di tessuto utilizzando metodi di profilazione del proteoma privi di etichette e basati su etichette, che è fondamentale per le applicazioni nelle scienze della vita, in particolare i progetti basati sulla scoperta di biomarcatori.

Introduzione

Le tecnologie di proteomica hanno il potenziale per consentire l'identificazione e la quantificazione di potenziali marcatori candidati che possono aiutare nella rilevazione e nella prognosi della malattia¹. I recenti progressi nel campo della spettrometria di massa hanno accelerato la ricerca clinica a livello proteico. I ricercatori stanno cercando di affrontare la sfida della patobiologia complicata di diverse malattie utilizzando la proteomica basata sulla spettrometria di massa, che ora offre una maggiore sensibilità per l'identificazione e la quantificazione delle proteine². Una misurazione quantitativa accurata delle proteine è fondamentale per comprendere la cooperazione dinamica e spaziale tra le proteine in individui sani e malati³; tuttavia, tale analisi su scala proteoma non è facile.

Uno dei principali limiti della profilazione proteomica dei campioni clinici è la complessità dei campioni biologici. Molti diversi tipi di campioni sono stati studiati per studiare il proteoma della malattia, come linee cellulari, plasma e tessuti^4,5. Le linee cellulari sono ampiamente utilizzate come modelli in esperimenti in vitro per imitare diversi stadi di progressione della malattia. Tuttavia, una delle principali limitazioni con le linee cellulari è che acquisiscono facilmente cambiamenti genotipici e fenotipici durante il processo di coltura cellulare⁶. I fluidi corporei come il plasma potrebbero essere una fonte interessante per la scoperta di biomarcatori; tuttavia, a causa delle proteine molto abbondanti e della gamma dinamica di concentrazione proteica, la proteomica plasmatica è un po 'più impegnativa⁷. Qui, i peptidi originati dalle proteine più abbondanti possono sopprimere quelli derivati dalle proteine a bassa abbondanza anche se il rapporto massa/carica è lo stesso⁶. Sebbene ci siano stati progressi nelle tecnologie di esaurimento e frazionamento negli ultimi anni, ottenere una buona copertura rimane ancora una delle principali limitazioni della proteomica^{plasmatica 8,9}. L'uso di tessuti per l'indagine proteomica della biologia della malattia è preferito in quanto i campioni di tessuto sono più prossimali ai siti di malattia e offrono elevate informazioni fisiologiche e patologiche per fornire migliori informazioni sulla biologia della malattia^10,11.

In questo manoscritto, abbiamo fornito un protocollo semplificato per la proteomica quantitativa di campioni di tessuto. Abbiamo utilizzato un tampone contenente 8 M di urea per la preparazione del lisato tissutale in quanto questo tampone è compatibile con le indagini basate sulla spettrometria di massa. Tuttavia, è obbligatorio pulire i peptidi per rimuovere i sali prima di iniettarli nello spettrometro di massa. Un punto importante da ricordare è quello di ridurre la concentrazione di urea a meno di 1 M prima di aggiungere tripsina per la digestione delle proteine poiché la tripsina mostra una bassa attività a 8 M di concentrazione di urea. Abbiamo spiegato due approcci di proteomica globale quantitativa: la quantificazione basata su etichette utilizzando iTRAQ (tag isobarici per la quantificazione relativa e assoluta) e la quantificazione senza etichetta (LFQ). La proteomica quantitativa basata su iTRAQ viene utilizzata principalmente per confrontare più campioni che variano nelle loro condizioni biologiche (ad esempio, campioni normali rispetto a campioni di malattia o trattati). L'approccio utilizza reagenti isobarici per etichettare le ammine primarie N-terminali dei peptidi^12. I reagenti iTRAQ contengono un gruppo reporter N-metil piperazina, un gruppo bilanciatore e un gruppo estere N-idrossi succinimide che reagisce con le ammine primarie N-terminali dei peptidi¹³. I peptidi digeriti da ciascuna condizione sono etichettati con un particolare reagente iTRAQ. Dopo l'etichettatura, la reazione viene interrotta e i peptidi etichettati da diverse condizioni vengono raggruppati in un singolo tubo. Questa miscela di campioni combinati viene analizzata dallo spettrometro di massa per l'identificazione e la quantificazione. Dopo l'analisi MS/MS, vengono generati frammenti ioniche reporter con basse masse molecolari e le intensità ioniche di questi ioni reporter vengono utilizzate per la quantificazione delle proteine.

Un altro approccio, la quantificazione senza etichetta, viene utilizzato per determinare il numero relativo di proteine in campioni complessi senza etichettare peptidi con isotopi stabili.

Protocollo

Questo studio è stato esaminato e approvato dai comitati di revisione istituzionali e dal comitato etico dell'Indian Institute of Technology Bombay (IITB-IEC/2016/026). I pazienti/partecipanti hanno fornito il loro consenso scritto a partecipare a questo studio.

1. Preparazione del lisito tissutale

NOTA: eseguire tutti i seguenti passaggi sul ghiaccio per mantenere inattive le proteasi. Assicurarsi che i bisturi e gli eventuali tubi utilizzati siano sterili per evitare qualsiasi contaminazione incrociata.

1. Prendi ~ 30 mg di tessuto in un tubo che batte le perline, aggiungi 200 μL di 1x soluzione salina tampone fosfato (PBS) e vorticizzala.
   NOTA: In questo studio, sono stati prelevati tessuti tumorali cerebrali umani congelati freschi per la preparazione del lisi. Il protocollo può essere utilizzato per qualsiasi tessuto fresco congelato con alcune modifiche a seconda del tipo di tessuti (tessuti molli o duri) e della complessità cellulare dei tessuti.
2. Successivamente, ruotare il tubo per sistemare il tessuto e rimuovere con cura il PBS usando una pipetta. Eseguire un altro lavaggio PBS se ci sono ancora tracce di sangue lasciate nel tessuto.
3. Aggiungere 300 μL di tampone di lisi dell'urea (8 M urea, 50 mM Tris pH 8,0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) e cocktail inibitore della proteasi (PIC) secondo il protocollo del produttore.
   NOTA: Il volume del tampone di lisi dovrebbe essere sufficiente per macinare il tessuto durante il processo di sonicazione e per sospendere ciò che viene estratto. Troppo poco tampone di lisi può causare una lisi tissutale inefficiente, mentre troppo tampone di lisi diluirà il lisi proteico.
4. Posizionare il tubo sul ghiaccio e sonicare il tessuto ad un'ampiezza del 40% per 2,5 minuti con cicli di impulsi di 5 s (ON / OFF, rispettivamente).
5. Aggiungere perle di zirconio ai tubi e omogeneizzare il tessuto utilizzando un battitore di perle per 90 s con 5 minuti di incubazione su ghiaccio. Ripetere questo passaggio due volte.
6. Una volta che il tessuto è adeguatamente omogeneizzato, incubare il tubo sul ghiaccio per 10 minuti.
7. Dopo l'incubazione, centrifugare il campione a 6.018 x g per 15 minuti a 4 °C per separare i detriti cellulari dal surnatante.
8. Raccogliere il surnatante nel tubo fresco etichettato e conservare a -80 °C come aliquote fino a nuovo utilizzo.

2. Quantificazione delle proteine e controllo di qualità dei llisi tissutali

1. Quantificare la concentrazione proteica nel llisito tissutale utilizzando il reagente di Bradford come descritto nel file supplementare 1.
2. Dopo la quantificazione delle proteine, eseguire 10 μg di llisi tissutale su un gel SDS-PAGE al 12% per verificare la qualità del lisiato.
   NOTA: L'ulteriore trasformazione a valle deve essere effettuata solo per i lasaggiù dei controlli di qualità.

3. Digestione enzimatica delle proteine

NOTA: i passaggi per la digestione enzimatica sono mostrati nella Figura 1a.

1. Per la digestione, prendere 50 μg di proteine e aggiungere ddH₂O per aumentare il volume a 20 μL.
2. Ora, preparare 20 mM di tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP) dal magazzino (0,5 M TCEP) aggiungendo 0,8 μL da stock al lasato proteico per ridurre i legami disolfuro nelle proteine e incubare il campione a 37 ° C per 60 minuti.
3. Preparare 40 mM di iodoacetammide (IAA) in ddH₂O e aggiungere 1,6 μL per alchilare i residui ridotti di cisteina. Incubare al buio per 10 minuti a temperatura ambiente.
4. Aggiungere tampone di diluizione contenente 25 mM Tris pH 8,0 e 1 mM CaCl₂ in un rapporto 1:8 per diluire la concentrazione di urea a meno di 1 M nel campione. A questo punto, controllare il pH.
   NOTA: Se si utilizza la tripsina come enzima digestivo, assicurarsi che la concentrazione di urea sia inferiore a 1 M.
5. Per eseguire la digestione, aggiungere tripsina ad un rapporto enzima/substrato di 1:50. Incubare i tubi a 37 °C in un bagno secco tremante per 16 ore per la digestione notturna.
   NOTA: L'enzima tripsina è una proteasi altamente reattiva che è incline all'autodigestione. Prestare particolare attenzione ed eseguire rapidamente l'aggiunta di tripsina sul ghiaccio.
6. Dopo 16 ore di incubazione, asciugare i peptidi digeriti in un concentratore sottovuoto.

4. Dissaliazione dei peptidi digeriti

NOTA: Per eseguire la dissalo dei peptidi, utilizzare le punte dello stadio C18.

1. Attivare la punta dello stadio C18 aggiungendo 50 μL di metanolo. Centrifugare la punta a 1.000 x g per 2 minuti a RT. Scartare il filtrato raccolto sul fondo del tubo. Ripeti due volte.
2. Aggiungere 50 μL di acetonitrile in acido formico allo 0,1% per lavare la punta del palco. Centrifugare il tubo a 1.000 x g per 2 minuti a RT. Scartare il filtrato raccolto sul fondo del tubo. Ripetere questo passaggio due volte.
3. Aggiungere 50 μL dello 0,1% (v/v) FA per equilibrare la colonna. Ancora una volta, eseguire la centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti a RT e scartare il filtrato.
4. Ricostituire i peptidi essiccati digeriti in 50 μL di acido formico allo 0,1%.
   NOTA: evitare la formazione di bolle d'aria all'interno delle punte dello stadio durante il passaggio del campione. Le punte dello stadio non devono essere completamente asciugate durante la fase di centrifugazione, poiché l'essiccazione può portare alla perdita di peptidi.
5. Aggiungere i peptidi ricostituiti nella punta dello stadio attivato e far passare il campione attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione a 1.000 x g per 2 minuti. Ripetere questo passaggio almeno quattro volte. Conservare il flusso a 4 °C.
6. Per lavare il campione, aggiungere 50 μL di acido formico allo 0,1% (v/v). Ripetere la fase di centrifugazione ed eliminare il filtrato.
7. Per l'eluizione dei peptidi, aggiungere 50 μL di 40% (v/v) ACN in acido formico allo 0,1% (v/v) e passarlo attraverso la punta dello stadio mediante centrifugazione. Raccogliere il filtrato in un tubo fresco. Ripetere il passaggio con il 50% e il 60% di ACN in acido formico allo 0,1% e raccogliere il filtrato nello stesso tubo fresco.
8. Asciugare i peptidi dissalettati raccolti nel tubo fresco utilizzando un concentratore sottovuoto.
   NOTA: I peptidi essiccati dissalato sono pronti per essere iniettati, oppure possono essere conservati a -20 °C per 6 mesi. Per la conservazione a lungo termine (>6 mesi), conservare i peptidi a -80 °C.

5. Quantificazione dei peptidi dissali

1. Ricostituire i peptidi essiccati dissalato in 0,1% FA.
2. Pulire la piastra di misurazione fotometrica con tessuto privo di lanugine utilizzando il 70% di etanolo.
3. Utilizzare 2 μL dello 0,1% FA per impostare lo spazio vuoto.
4. Aggiungere 2 μL di campioni ricostituiti sulla piastra in replica.
5. Posizionare la piastra nello spettrofotometro e misurare l'assorbanza a 205 nm e 280 nm.
6. Calcolare l'assorbibilità molare (ε) utilizzando la seguente formula:
   ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
   NOTA: L'assorbimento molare (ε) è una misura della probabilità della transizione elettronica o di quanto bene una specie assorbe la particolare lunghezza d'onda della radiazione che viene incidente su di essa. Il valore di ε dovrebbe essere compreso tra 31 mL mg^-1cm^-1 a 33 mL mg^-1cm^-1. Se il valore non rientra nell'intervallo, significa che i campioni non vengono digeriti correttamente.
7. Calcolare la concentrazione peptidica in μg/μL utilizzando la seguente formula:
   Concentrazione di peptide = Net OD (205) / 0.051 * ε

6. Quantificazione senza etichetta (LFQ) dei peptidi digeriti

NOTA: per una quantificazione senza etichetta, utilizzare i parametri LC e MS menzionati nel file supplementare 2. Un dato ad alta copertura è stato ottenuto quando tre repliche biologiche dello stesso tipo di campione sono state eseguite nello spettrometro di massa.

1. Configurazione della cromatografia liquida
   1. Dopo la quantificazione dei peptidi desaltati, prendere 2 μg di peptidi in una fiala e portare il volume a 10 μL usando lo 0,1% di FA. La concentrazione di peptidi desaltati sarà di 200 ng/μL.
   2. Aprire l'autocampionatore del sistema di cromatografia liquida (vedere Tabella dei materiali)e posizionare il flaconcino all'interno dell'autocampionatore.
   3. Utilizzare 0,1% (v/v) FA per equilibrare la colonna preliminare e la colonna analitica.
   4. Prendere 1 μg di peptide digerito dissalato dal flaconcino e caricarlo sulla colonna.
   5. Impostate il gradiente LC in base alla complessità del campione. In questo esperimento, il gradiente LC è stato utilizzato per 120 minuti per la quantificazione senza etichetta dei campioni di tessuto.
2. Ms setup: Prima di ottimizzare qualsiasi test proteomico, eseguire un controllo di qualità dello strumento monitorando alcuni peptidi di albumina sierica bovina (BSA) utilizzando qualsiasi software per l'idoneità del sistema e analizzando la copertura di BSA(Figura 2A,B). I parametri di acquisizione sono stati impostati nello strumento utilizzando il software di acquisizione dati MS (vedi Tabella dei materiali).
   1. Aprire il software, fare doppio clic su Instrument Set Up e selezionare il modello da peptides-ID con i parametri predefiniti.
   2. Impostare i parametri MS utilizzando il file supplementare 2 e salvarlo come nuovo metodo.
   3. Ora, apri il software per riempire i dettagli di esempio; Fare doppio clic su Impostazione sequenzae inserire i dettagli quali il tipo di campione, il nome del campione, la posizione di salvataggio del file, il file del metodo dello strumento, il volume di iniezione e la posizione del campione.
   4. Una volta compilate tutte le informazioni, selezionare la riga e avviare Esegui.

7. Quantificazione basata sull'etichetta (iTRAQ) dei peptidi digeriti

NOTA: la quantificazione basata su etichette può essere eseguita utilizzando diverse etichette isobariche come reagenti iTRAQ o TMT, ecc. Qui, iTRAQ 4-plex è stato utilizzato per l'etichettatura di peptidi digeriti da tre campioni di tessuto. La procedura di etichettatura iTRAQ 4-plex è menzionata di seguito.

1. Etichettatura di peptidi digeriti utilizzando reagenti iTRAQ.
   NOTA: In questo esperimento vengono utilizzati peptidi da tre campioni di tessuto. Da ciascun campione di tessuto, 80 μg di peptidi digeriti vengono prelevati in quattro provette per l'etichettatura con reagenti iTRAQ (114, 115, 116 e 117) (vedere il file supplementare 3 per i parametri sperimentali dettagliati).
   1. Prima di utilizzare il reagente iTRAQ, portare ogni flaconcino del reagente a temperatura ambiente (circa 5 minuti). Dare un breve giro di circa 30 s per portare la soluzione sul fondo di ogni flaconcino.
      NOTA: Assicurarsi che in ogni flaconcino siano presenti 10-15 μL di soluzione.
   2. Per l'etichettatura iTRAQ, ricostituire i peptidi essiccati in 20 μL di tampone di dissoluzione fornito nel kit di etichettatura iTRAQ.
   3. Ricostituire le etichette aggiungendo 70 μL di etanolo dal flaconcino fornito nel kit e mescolare la soluzione per 30 s e ruotarla per 10 s.
      NOTA: Si consiglia di eseguire tutti i passaggi secondo le istruzioni del produttore.
   4. Aggiungere le etichette iTRAQ omogeneamente miscelate (114, 115, 116 e 117) alle rispettive provette contenenti campioni di peptidi e consentire la reazione di etichettatura.
   5. Mescolare i componenti di ciascun tubo ruotando il tubo per 30 s, quindi ruotare il tubo per 10 s per riportare la miscela sul fondo del tubo.
      NOTA: Controllare il pH della soluzione utilizzando carta pH. Il pH dovrebbe essere superiore a 8; in caso contrario, aggiungere fino a 10 μL del tampone di dissoluzione per regolare il pH.
   6. Incubare ogni tubo a temperatura ambiente per 90 min. Alla fine della reazione, spegnere qualsiasi etichetta non legata in eccesso nel tubo aggiungendo acqua di grado MS.
   7. Incubare i tubi a temperatura ambiente per 30 minuti a 1 ora.
   8. Una volta terminata l'incubazione, trasferire tutto il contenuto etichettato in un singolo tubo e asciugare i peptidi etichettati in un concentratore sottovuoto.
      NOTA: per l'etichettatura TMT è possibile seguire una procedura di etichettatura simile.
2. Configurazione della cromatografia liquida
   1. Ricostituire i campioni in acido formico allo 0,1%, aprire l'autocampionatore di nano LC e posizionare i campioni all'interno dell'autocampionatore. Utilizzare i parametri menzionati nel file supplementare 2 per l'installazione di LC.
   2. Impostare il gradiente LC in base alla complessità del campione. Il gradiente LC di 180 minuti è stato utilizzato in questo esperimento per la quantificazione basata su etichette (iTRAQ) dei campioni di tessuto.
      NOTA: per campioni meno complessi, il gradiente corto può separare in modo efficiente la maggior parte dei peptidi. Tuttavia, se il campione è molto complesso, utilizzare un gradiente più lungo per una migliore separazione dei peptidi.
3. Configurazione MS per la tecnica iTRAQ
   1. Impostare tutti i parametri MS per la quantificazione basata su etichette nello stesso modo utilizzato per la quantificazione senza etichetta, ad eccezione dell'energia di collisione, che è stata impostata al 35% per la frammentazione MS/MS nella quantificazione basata su etichette.

8. Analisi dei dati

1. Analizzare i file grezzi (spettro MS/MS) ottenuti dallo spettrometro di massa LC utilizzando un software di analisi disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).
   NOTA: Il database Human Reference Proteome di Uniprot (UP000005640) comprendente 71.785 sequenze proteiche è stato utilizzato per ottenere identità proteiche utilizzando i motori di ricerca Sequest HT e Mascot (v2.6.0). I parametri per la quantificazione senza etichetta e la quantificazione basata su etichette sono descritti nel file supplementare 4.

Risultati

Abbiamo utilizzato due diversi approcci per la proteomica di scoperta: approcci di proteomica senza etichetta e basati su etichette. Il profilo proteico dei campioni di tessuto su SDS-PAGE ha mostrato le proteine intatte e potrebbe essere considerato per l'analisi proteomica (Figura 2A). Il controllo di qualità dello strumento è stato monitorato tramite un software di idoneità del sistema e ha mostrato la variazione giornaliera delle prestazioni dello strumento (

Discussione

La proteomica tissutale di campioni biologici ci consente di esplorare nuovi potenziali biomarcatori associati a diversi stadi di progressione della malattia. Spiega anche il meccanismo di segnalazione e le vie associate alla progressione della malattia. Il protocollo descritto per l'analisi proteomica quantitativa dei tessuti fornisce dati riproducibili di buona copertura. La maggior parte dei passaggi sono stati adattati dalle istruzioni del produttore. Per ottenere dati di alta qualità, i seguenti passaggi sono fonda...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388