組織サンプルの質量分析ベースのショットガンプロテオミクスの包括的ワークフロー

要約

記載されたプロトコルは、ラベルベースとラベルフリー定量の2つのアプローチを用いて、組織サンプルの最適化された定量プロテオミクス分析を提供します。ラベルベースのアプローチは、より正確なタンパク質定量の利点を有する一方で、ラベルフリーアプローチはより費用対効果が高く、コホートの何百ものサンプルを分析するために使用されます。

要約

質量分析の最近の進歩は、堅牢で再現可能なデータセットの生成と共に深いプロテオミクス分析をもたらしました。しかし、かなりの技術的進歩にもかかわらず、患者の血液、CSF、および組織などの生体検体からのサンプル調製は依然としてかなりの課題を抱えています。バイオマーカーを同定するために、組織プロテオミクスはしばしば、研究結果をベンチから診療所に翻訳する魅力的なサンプル源を提供する。これは、アルツハイマー病、パーキンソン病などの癌や神経変性疾患の早期診断のための潜在的な候補バイオマーカーを明らかにすることができます。組織プロテオミクスはまた、タンパク質の豊富に基づいて全身情報の富を生成し、興味深い生物学的な質問に対処するのに役立ちます。

定量的プロテオミクス解析は、ラベルベースとラベルフリーアプローチの2つの大きなカテゴリに分類できます。標識ベースのアプローチでは、タンパク質またはペプチドは、SILAC(細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識)、ICAT(同位体コード化アフィニティータグ)、TMT(タンデム質量タグ)またはiTRAQ(相対および絶対定量のための同位体タグ)などの安定同位体を使用して標識されます。標識ベースのアプローチは、タンパク質をより正確に定量できるという利点を有し、またアイソバリックラベルを用いて、複数のサンプルを1回の実験で分析することができる。ラベルフリーのアプローチは、ラベルベースのアプローチに代わるコスト効率の高い方法です。特定のコホートに属する数百の患者サンプルを分析し、臨床特徴に基づいて他のコホートと比較することができる。ここでは、ライフサイエンス、特にバイオマーカー発見ベースのプロジェクトでの応用に不可欠な、ラベルフリーおよびラベルベースのプロテオームプロファイリング法を用いた組織サンプルの最適化された定量プロテオミクスワークフローについて説明しました。

概要

プロテオミクス技術は、疾患1の検出および予後に役立つ候補マーカーの同定と定量を可能にする可能性を^有する。質量分析の分野における最近の進歩は、タンパク質レベルでの臨床研究を加速しています。研究者たちは、質量分析法ベースのプロテオミクスを用いて、いくつかの疾患の複雑な病態生物学の課題に取り組もうとしており、現在はタンパク質同定と定量化に対する感度の向上を提供している^。タンパク質の正確な定量的測定は、健康な個人と病気の個人のタンパク質間の動的および空間的な協調を理解するために重要である^3;しかし、このようなプロテオーム規模の分析は容易ではありません。

臨床検体のプロテオミクスプロファイリングの大きな制限の1つは、生物学的サンプルの複雑さである。多くの異なる種類のサンプルが、細胞株、血漿、および組織^4、5などのプロテオームの疾患を研究するために調査されてきた。細胞株は、疾患進行の異なる段階を模倣するインビトロ実験のモデルとして広く使用されています。しかしながら、細胞株の1つの大きな制限は、細胞培養⁶の過程で遺伝子と平解な変化を容易に獲得する点である。プラズマなどの体液は、バイオマーカー発見の魅力的な源となる可能性があります。しかし、タンパク質の豊富さとダイナミックレンジのタンパク質濃度により、血漿プロテオミクスは少し難しい⁷.ここで、最も豊富なタンパク質から生まれたペプチドは、質量/電荷比が同じ⁶であっても、低い豊富なタンパク質由来のものを抑制することができる。ここ数年で枯渇と分画技術の進歩がありましたが、良好なカバレッジを得ることは、依然としてプラズマプロテオミクス^8、9の大きな限界です。疾患生物学のプロテオーム学的調査のための組織の使用は、組織サンプルが疾患部位に最も近く、疾患生物学^10,11に対するより良い洞察を提供するために高い生理学的および病理学的情報を提供するので好ましい。

本稿では、組織試料の定量的プロテオミクスの簡易プロトコルを提供しました。このバッファーは質量分析法に基づく調査と互換性があるため、8 M 尿素を含むバッファーを組織のライセート調製に使用しました。しかし、質量分析計に注入する前に、塩を除去するためにペプチドをきれいにすることが必須です。覚えておかねない重要なポイントの1つは、トリプシンが8M尿素濃度で低い活性を示すため、タンパク質消化のためのトリプシンを添加する前に尿素濃度を1M未満に減らすことです。定量的なグローバルプロテオミクスの2つのアプローチ:iTRAQ(相対および絶対定量のためのアイソバリックタグ)とラベルフリー定量(LFQ)を用いたラベルベースの定量法について説明しました。iTRAQベースの定量プロテオミクスは、主に生物学的状態(例えば、正常と疾患または治療されたサンプル)で変化する複数のサンプルを比較するために使用されます。このアプローチは、ペプチド¹²のN末端一次アミンを標識する等圧試薬を利用する。iTRAQ試薬は、1つのN-メチルピペラジンレポーターグループ、バランサ基、およびペプチド¹³のN末端一次アミンと反応する1つのN-ヒドロキシスクッチイミドエステル基を含む。各条件から消化されたペプチドは、特定のiTRAQ試薬で標識される。標識に続いて、反応を停止し、異なる条件からの標識ペプチドを単一のチューブにプールする。この組み合わせサンプル混合物は、同定と定量のために質量分析計によって分析される。MS/MS分析後、低分子質量のレポーターイオン断片が生成され、これらのレポーターイオンのイオン強度がタンパク質の定量化に使用されます。

別のアプローチとして、標識フリー定量法を用いて、安定同位体を有するペプチドを標識することなく、複合体サンプル中のタンパク質の相対数を決定する。

プロトコル

この研究は、インド工科大学ボンベイ校(IITB-IEC/2016/026)の機関審査委員会と倫理委員会によって審査され、承認されました。患者/参加者は、この研究に参加するために書面による同意を提供しました。

1. 組織のライセートの準備

注:氷の上で以下の手順をすべて実行して、プロテアーゼを非アクティブに保ちます。メスと使用されるチューブが無菌であることを確認して、クロスコンタミネーションを避けてください。

1. ビーズの鼓動チューブに~30mgの組織を取り、200μLの1xリン酸緩衝液生理塩分(PBS)と渦を加えます。
   注:この研究では、新鮮な凍結したヒト脳腫瘍組織を、ライセート調製のために採取した。プロトコルは、組織の種類(軟部または硬い組織)および組織の細胞の複雑さに応じていくつかの変化を伴う任意の新鮮な凍結組織に使用することができる。
2. その後、チューブを回転して組織を沈め、ピペットを使用してPBSを慎重に除去します。組織に残っている血液の痕跡がまだある場合は、別のPBS洗浄を行います.
3. メーカーのプロトコルに従って、300 μLの尿素分解バッファー(8 M尿素、50 mM Tris pH 8.0、75 mM NaCl、1 mM MgCl₂₎およびプロテアーゼ阻害剤カクテル(PIC)を加えます。
   注:リシスバッファーの体積は、超音波処理プロセス中に組織を粉砕し、抽出されたものを中断するのに十分でなければなりません。あまりにも少ないリシスバッファーは非効率的な組織のリシスを生じ得、あまりにも多くのリシスバッファーは、タンパク質のリゼートを希釈します。
4. チューブを氷の上に置き、5 sのパルスサイクル(それぞれON/OFF)で2.5分間40%の振幅で組織を超音波処理します。
5. チューブにジルコニウムビーズを加え、氷の上に5分間インキュベーションして90 sのビーズビーターを使用して組織を均質化します。この手順を 2 回繰り返します。
6. 組織が適切に均質化されたら、チューブを氷の上で10分間インキュベートします。
7. インキュベーション後、サンプルを4°Cで15分間6,018 x g で遠心分離し、上清から細胞デブリを分離します。
8. 新鮮なラベル付きチューブに上清を収集し、さらに使用するまでアリコートとして-80°Cで保存します。

2. タンパク質定量と組織ライセートの品質チェック

1. 補足ファイル1に記載されているようにブラッドフォードの試薬を使用して、組織ライセート中のタンパク質濃度を定量化する。
2. タンパク質定量に続いて、12%SDS-PAGEゲルで10μgの組織ライセートを実行し、ライセートの品質を確認します。
   注: さらに下流処理は、ライセートが品質チェックをクリアする場合にのみ実行する必要があります。

3. タンパク質の酵素消化

注: 酵素消化の手順を 図 1aに示します。

1. 消化のために、50 μgのタンパク質を取り、ddH₂Oを加え、容積を20 μLにします。
2. 次に、ストックから20 mM Tris(2-carboxyethyl)ホスフィン(TCEP)を調製し、ストックから0.8μLをタンパク質のリセートに加えてタンパク質中のジスルフィド結合を減少させ、サンプルを37°Cで60分間インキュベートします。
3. 40 mM のヨウドアセトアミド (IAA) を ddH₂O で調製し、1.6 μL を加えて、減少したシステイン残基をアルキル化します。暗闇の中で室温で10分間インキュベートします。
4. 25 mM Tris pH 8.0 および 1 mM CaCl₂ を含む希釈バッファーを 1:8 の比率で加え、尿素濃度をサンプル中の 1 M 未満に希釈します。この時点で、pH を確認します。
   注:消化酵素としてトリプシンを使用する場合は、尿素の濃度が1M未満であることを確認してください。
5. 消化を行うために、1:50の酵素/基質比でトリプシンを加えます。一晩消化のために16時間揺れるドライバスで37°Cでチューブをインキュベートします。
   注意:トリプシン酵素は自己消化しやすい反応性の高いプロテアーゼです。余分な注意を払い、氷の上にトリプシンの追加を迅速に実行します。
6. 16時間のインキュベーションの後、消化されたペプチドを真空濃縮器で乾燥させます。

4. 消化ペプチドの脱塩

注:ペプチドの脱塩を実行するには、C18ステージのヒントを使用してください。

1. 50 μLのメタノールを加えて、C18ステージ先端をアクティブにします。先端を1,000 x g で2分間RTで遠心する。2 回繰り返します。
2. 50 μLのアセトニトリルを0.1%のギ酸に加えて、ステージ先端を洗浄します。チューブを1,000 x g で2分間RTで遠心分離します。この手順を 2 回繰り返します。
3. 50 μL の 0.1% (v/v) FA を追加して、カラムを平衡化します。再度、RTで2分間1,000 x g で遠心を行い、濾液を捨てます。
4. 乾燥した消化したペプチドを0.1%のギ酸の50 μLで再構成する。
   注:サンプルを渡している間、ステージの先端の内部に気泡の形成を避けてください。段階の先端は、乾燥がペプチドの損失につながる可能性がありますので、遠心段階の間に完全に乾燥させるべきではありません。
5. 活性化ステージ先端に再構成されたペプチドを加え、2分間1,000 x g で遠心分離してサンプルをステージ先端に通します。この手順を少なくとも 4 回繰り返します。フロースルーは4°Cで保存してください。
6. サンプルを洗浄するには、50 μLの 0.1%(v/v)のギ酸を加えます。遠心分離のステップを繰り返し、濾液を捨てます。
7. ペプチドの溶出のために、0.1%のギ酸(v/v)の40%(v/v)ACNの50 μLを加え、遠心分離によって段階の先端を通過する。新鮮なチューブに濾液を収集します。50%および60%のACNを0.1%のギク酸で繰り返し、同じ新鮮なチューブに濾液を集める。
8. 真空濃縮器を使用して、新鮮なチューブに集めた脱塩ペプチドを乾燥させます。
   注:乾燥した脱塩ペプチドを注入する準備ができているか、6ヶ月間-20°Cで保存することができます。長期保存(>6ヶ月)の場合は、-80°Cで保存してください。

5. 脱塩ペプチドの定量化

1. 乾燥した脱塩ペプチドを0.1%FAに再構成する。
2. 70%エタノールを使用して、リントフリー組織でフォトメトリック測定プレートを拭きます。
3. 0.1%FAの2 μLを使用してブランクを設定します。
4. 2 μLの再構成サンプルを複製でプレートに追加します。
5. 分光光度計にプレートを置き、205 nmおよび280 nmで吸光度を測定します。
6. 次の式を使用して、モルの吸収率 (ε) を計算します。
   ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
   注:モル吸着率(ε)は、電子転移の確率、または種が入射している特定の波長の放射線をどれだけ吸収するかを測定するものです。εの値は、31 mL mg^-1cm^-1 ~ 33 mL mg^-1cm^-1の範囲内にする必要があります。値が範囲内に収まらない場合は、サンプルが適切に消化されないことを示します。
7. 次の式を使用して、μg/μLでペプチド濃度を計算します。
   ペプチドの濃度 = 純OD (205) / 0.051 * ε

6. 消化ペプチドの無ラベル定量(LFQ)

注: ラベルなしの数量には、 補足ファイル 2に記載されている LC パラメータと MS パラメータを使用します。質量分析計で同じタイプのサンプルの3つの生物学的複製を実行したときに、高いカバレッジデータが得られました。

1. 液体クロマトグラフィーのセットアップ
   1. 脱塩ペプチドを定量した後、バイアル内の2μgのペプチドを取り、0.1%FAを使用して体積を10 μLにします。脱塩ペプチドの濃度は200 ng/μLになります。
   2. 液体クロマトグラフィーシステムのオートサンプラーを開き( 材料表を参照)、バイアルをオートサンプラーの内部に置きます。
   3. 0.1%(v/v)FAを使用して、事前列と分析列を平衡化します。
   4. バイアルから脱塩した消化ペプチドを1μg取り出し、カラムにロードします。
   5. サンプルの複雑さに応じて、LC の勾配を設定します。本実験では、LC勾配を組織試料のラベルフリー定量に120分間使用した。
2. MSセットアップ:プロテオミクスアッセイを最適化する前に、システム適合性のためのソフトウェアを使用してウシ血清アルブミン(BSA)のいくつかのペプチドを監視し、BSAのカバレッジを分析することによって、機器の品質管理チェックを行います(図2A、B)。取得パラメータは MS データ取得ソフトウェアを使用して計測器に設定されました (資料一覧を参照)。
   1. ソフトウェアを開き、 インスツルメントを ダブルクリックし、デフォルトパラメータを持つペプチドIDからテンプレートを選択します。
   2. 補足ファイル 2を使用して MS パラメータを設定し、新しい方法として保存します。
   3. 次に、サンプルの詳細を記入するソフトウェアを開きます。 [シーケンスセットアップ] をダブルクリックし、サンプルタイプ、サンプル名、ファイル保存場所、計測器方法ファイル、注入量、サンプル位置などの詳細を入力します。
   4. すべての情報が入力されたら、行を選択して 、実行を開始します。

7. 消化ペプチドの標識ベース定量(iTRAQ)

メモ:ラベルベースの定量は、iTRAQやTMT試薬などの異なるアイソバリックラベルを使用して行うことができます。ここで、iTRAQ 4-plexは、3つの組織サンプルからの消化されたペプチドの標識化に使用した。iTRAQ 4-plex ラベル付けの手順は、以下に挙げます。

1. iTRAQ試薬を用いた消化ペプチドの標識化
   注:この実験では、3つの組織サンプルからのペプチドが使用されています。各組織サンプルから、80 μgの消化ペプチドを4つのチューブに取り込み、iTRAQ試薬(114、115、116、および117)で標識します(詳細な実験パラメータについては 補足ファイル3 を参照)。
   1. iTRAQ試薬を使用する前に、試薬の各バイアルを室温(約5分)にしてください。各バイアルの底部に溶液を持って来るために約30 sの短いスピンを与えます。
      注:各バイアルに10~15μLの溶液が存在することを確認してください。
   2. iTRAQ標識の場合、iTRAQ標識キットに用意されている溶解バッファーの20 μLで乾燥したペプチドを再構成します。
   3. キットに付属のバイアルから70μLのエタノールを加えてラベルを再構成し、30 sの溶液を混合し、10秒回転させます。
      注:すべての手順は、製造元の指示に従って実行することをお勧めします。
   4. 均質に混合されたiTRAQラベル(114、115、116、および117)をペプチドサンプルを含むそれぞれのチューブに加え、標識反応を起こさせます。
   5. 30 sのチューブをボルテックスして各チューブの成分を混合し、チューブを10 s回転してチューブの底に戻します。
      注:pHペーパーを使用して溶液のpHを確認してください。pH は 8 より大きくする必要があります。ない場合は、pHを調整するために溶解バッファーの10 μLまで追加します。
   6. 各チューブを室温で90分間インキュベートします。反応の最後に、MSグレードの水を加えることによってチューブ内の余分な非結合標識をクエンチする。
   7. 室温で30分から1時間インキュベートします。
   8. インキュベーションが終わったら、標識された内容物をすべて1本のチューブに移し、真空濃縮器で標識ペプチドを乾燥させます。
      メモ:同様のラベル付け手順に従って、TMTラベル付けすることができます。
2. 液体クロマトグラフィーのセットアップ
   1. サンプルを0.1%のギ酸で再構成し、ナノLCのオートサンプラーを開き、オートサンプラーの内部に置きます。LC セットアップの 補足ファイル 2 に記載されているパラメータを使用します。
   2. サンプルの複雑さに応じて、LC の勾配を設定します。この実験では、180 minのLC勾配を組織試料のラベルベース定量(iTRAQ)に使用した。
      注: 複雑性の低いサンプルでは、短い勾配でほとんどのペプチドを効率的に分離できます。しかし、サンプルが非常に複雑な場合は、ペプチドのより良い分離のために長い勾配を使用してください。
3. ITRAQ テクニックの MS セットアップ
   1. ラベルベースの定量で MS/MS フラグメンテーションの 35% に設定された衝突エネルギーを除き、ラベルなしの定量に使用されるのと同じ方法でラベルベースの定量のすべての MS パラメータを設定します。

8. データ分析

1. LC質量分析装置から得られた生の(MS/MSスペクトル)ファイルを、市販の解析ソフトウェアを使用して解析します( 材料表を参照)。
   注:71,785個のタンパク質配列を含むユニプロト(UP000005640)のヒト参照プロテオームデータベースを使用して、セクエストHTとマスコット(v2.6.0)検索エンジンを使用してタンパク質同一性を取得しました。ラベルなしの数量とラベルベースの定量のパラメータについては、 補足ファイル 4を参照してください。

結果

私たちは、発見プロテオミクスには、ラベルフリーとラベルベースのプロテオミクスアプローチの2つの異なるアプローチを使用してきました。SDS-PAGE上の組織サンプルのタンパク質プロファイルは、インタクトなタンパク質を示し、プロテオミクス分析のために考慮することができた(図2A)。装置の品質管理チェックは、システム適合性ソフトウェアを介して監視...

ディスカッション

生物学的サンプルの組織プロテオミクスは、疾患進行の異なる段階に関連する新しい潜在的なバイオマーカーを探求することを可能にする。また、疾患の進行に関連するシグナル伝達および経路のメカニズムについても説明する。組織定量プロテオミクス分析用に記述されたプロトコルは、再現可能な良好なカバレッジデータを提供する。ほとんどの手順は、製造元の指示に従って調整され?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388