זרימת עבודה מקיפה של פרוטאומיקת רובה ציד מבוססת ספקטרומטריה של דגימות רקמה

Summary

הפרוטוקול המתואר מספק ניתוח פרוטאומי כמותי ממוטב של דגימות רקמה באמצעות שתי גישות: כמות מבוססת תווית וללא תווית. לגישות מבוססות תוויות יש יתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים, בעוד שגישה נטולת תוויות חסכונית יותר ומשמשת לניתוח מאות דגימות של קבוצה.

Abstract

ההתקדמות האחרונה בספקטרומטריית מסה הביאה לניתוח פרוטאומי עמוק יחד עם יצירת ערכות נתונים חזקות ושחזוריות. עם זאת, למרות ההתקדמות הטכנית ניכרת, הכנת מדגם מ biospecimens כגון דם המטופל, CSF, ורקמות עדיין מציב אתגרים ניכרים. לזיהוי סמנים ביולוגיים, פרוטאומיקה של רקמות מספקת לעתים קרובות מקור מדגם אטרקטיבי לתרגום ממצאי המחקר מהספסל למרפאה. זה יכול לחשוף סמנים ביולוגיים מועמד פוטנציאלי לאבחון מוקדם של סרטן ומחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון, וכו '. פרוטאומייקה של רקמות גם מניבה שפע של מידע מערכתי המבוסס על שפע החלבונים ומסייעת לענות על שאלות ביולוגיות מעניינות.

ניתן לקבץ ניתוח פרוטאומיה כמותית לשתי קטגוריות רחבות: גישה מבוססת תוויות וגישה נטולת תוויות. בגישה המבוססת על תוויות, חלבונים או פפטידים מסומנים באמצעות איזוטופים יציבים כגון SILAC (תיוג איזוטופ יציב עם חומצות אמינו בתרבות התאים) או על ידי תגים כימיים כגון ICAT (תגי זיקה מקודדים איזוטופ), TMT (תג מסה דו-מושבי) או iTRAQ (תג איזוברי לכמות יחסית ומוחלטת). גישות מבוססות תוויות יש את היתרון של כמות מדויקת יותר של חלבונים באמצעות תוויות איזובריות, דגימות מרובות ניתן לנתח בניסוי אחד. הגישה נטולת התוויות מספקת חלופה חסכונית לגישות מבוססות תוויות. ניתן לנתח ולהשוות מאות דגימות מטופלים השייכות לקבוצה מסוימת ולהשוותן לקבוצות אחרות המבוססות על תכונות קליניות. כאן, תיארנו זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ממוטבת עבור דגימות רקמה באמצעות שיטות פרופיל פרוטאום ללא תוויות ומבוססות תוויות, החיוניות ליישומים במדעי החיים, במיוחד פרויקטים מבוססי גילוי סמנים ביולוגיים.

Introduction

טכנולוגיות פרוטאומיקס יש פוטנציאל לאפשר זיהוי וכימות של סמנים מועמד פוטנציאליים שיכולים לסייע באיתור וחיזוי של המחלה¹. ההתקדמות האחרונה בתחום ספקטרומטריית המסה האיצה את המחקר הקליני ברמת החלבון. חוקרים מנסים להתמודד עם האתגר של פתוביולוגיה מסובכת של מספר מחלות באמצעות פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית, אשר מציעה כעת רגישות מוגברת לזיהוי וכימות חלבונים². מדידה כמותית מדויקת של חלבונים חיונית להבנת שיתוף הפעולה הדינמי והמרחבי בין חלבונים אצל אנשים בריאים וחולים³; עם זאת, ניתוח כזה בקנה מידה רחב פרוטאום אינו קל.

מגבלה מרכזית אחת של פרופיל פרוטאומי של דגימות קליניות היא המורכבות של דגימות ביולוגיות. סוגים רבים ושונים של דגימות נחקרו כדי לחקור את פרוטאום המחלה, כגון קווי תאים, פלזמה, ורקמות^4,5. קווי תאים נמצאים בשימוש נרחב כמודלים בניסויי במבחנה כדי לחקות שלבים שונים של התקדמות המחלה. עם זאת, מגבלה מרכזית אחת עם קווי תאים היא שהם רוכשים בקלות שינויים גנוטיפיים ופנוטיפיים במהלך התהליך של תרבית התא⁶. נוזלי גוף כגון פלזמה יכולים להיות מקור אטרקטיבי לגילוי סמן ביולוגי; עם זאת, בשל חלבונים שופעים מאוד ואת הטווח הדינמי של ריכוז חלבון, פרוטאומיקה פלזמה הוא קצת יותר מאתגר⁷. כאן, פפטידים שמקורם בחלבונים הנפוצים ביותר יכולים לדכא את אלה שמקורם בחלבונים השופעים הנמוכים גם אם יחס המסה /מטען זהה ל^-6. למרות שהיו התקדמות בטכנולוגיות דלדול ופירוק בשנים האחרונות, קבלת כיסוי טוב עדיין נותר מגבלה גדולה של פרוטאומיקס^{פלזמה 8,9}. השימוש ברקמות לחקירה פרוטאומית של ביולוגיה של המחלה עדיף שכן דגימות רקמה הן הקרובות ביותר לאתרי המחלה ומציעות מידע פיזיולוגי ופתולוגי גבוה כדי לספק תובנות טובות יותר על ביולוגיית המחלה^10,11.

בכתב יד זה, סיפקנו פרוטוקול פשוט יותר עבור פרוטאומיקה כמותית של דגימות רקמה. השתמשנו במאגר המכיל 8 M אוריאה להכנת ליסאט רקמה כמו חוצץ זה תואם עם חקירות מבוססות ספקטרומטריית מסה. עם זאת, חובה לנקות את הפפטידים כדי להסיר מלחים לפני הזרקת אותם לתוך ספקטרומטר המסה. נקודה חשובה לזכור היא להפחית את ריכוז אוריאה לפחות מ 1 M לפני הוספת טריפסין לעיכול חלבון כמו טריפסין תערוכות פעילות נמוכה בריכוז 8 M אוריאה. הסברנו שתי גישות של פרוטאומיקה גלובלית כמותית: כימות מבוסס תווית באמצעות iTRAQ (תגים איזובריים לכימות יחסית ומוחלטת) וכימות ללא תוויות (LFQ). הפרוטאומיקה הכמותית המבוססת על iTRAQ משמשת בעיקר להשוואת דגימות מרובות המשתנות במצבן הביולוגי (למשל, נורמלי לעומת מחלה או דגימות מטופלות). הגישה משתמשת ריאגנטים איזובריים כדי לתייג את אמינים ראשיים N-terminal של פפטידים¹². ריאגנטים iTRAQ מכילים קבוצת כתבים N-מתיל פיפראזין אחת, קבוצת מאזן, וקבוצת אסתר תמציתית N-הידרוקסית שמגיבה עם אמינים ראשוניים N-terminal של פפטידים¹³. פפטידים מעוכלים מכל תנאי מסומנים עם ריאגנט iTRAQ מסוים. לאחר התיוג, התגובה נעצרת ו מתויג פפטידים מתנאים שונים מחולקים לתוך צינור אחד. תערובת מדגם משולבת זו מנותחת על ידי ספקטרומטר מסה לזיהוי וכימות. לאחר ניתוח MS / MS, רסיסי יונים עיתונאיים עם מסות מולקולריות נמוכות נוצרים ועוצמות היונים של יונים עיתונאיים אלה משמשות לכימות החלבונים.

גישה נוספת, כימות ללא תוויות משמש כדי לקבוע את המספר היחסי של חלבונים בדגימות מורכבות מבלי לסמן פפטידים עם איזוטופים יציבים.

Protocol

מחקר זה נבדק ואושר על ידי ועדות בדיקה מוסדיות וועדת האתיקה של המכון ההודי לטכנולוגיה בומביי (IITB-IEC/2016/026). המטופלים/המשתתפים סיפקו את הסכמתם בכתב להשתתף במחקר זה.

1. הכנת ליסאט רקמות

הערה: בצע את כל השלבים הבאים על הקרח כדי לשמור על הפרוטאזים לא פעילים. ודא אזמלים וכל הצינורות המשמשים הם סטריליים כדי למנוע כל זיהום צולב.

1. קח ~ 30 מ"ג של רקמה בצינור להכות חרוזים, להוסיף 200 μL של 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) מערבולת זה.
   הערה: במחקר זה, רקמות גידול אנושי קפוא טרי נלקחו להכנת lysate. הפרוטוקול יכול לשמש עבור כל רקמה קפואה טרייה עם כמה שינויים בהתאם לסוג של רקמות (רקמות רכות או קשות) ומורכבות הסלולר של הרקמות.
2. לאחר מכן, לסובב את הצינור כדי ליישב את הרקמה ולהסיר בזהירות את PBS באמצעות pipette. בצע שטיפת PBS נוספת אם עדיין נותרו עקבות של דם ברקמה.
3. הוסף 300 μL של חוצץ תמוגה אוריאה (8 M אוריאה, 50 mM טריס pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂) וקוקטייל מעכב פרוטאז (PIC) לפי פרוטוקול היצרן.
   הערה: הנפח של מאגר תמה צריך להיות מספיק כדי לטחון את הרקמה במהלך תהליך sonication ולהשעות את מה שחולץ. חיץ תמה קטן מדי עלול לגרום תמה רקמות לא יעיל, בעוד חוצץ תמן יותר מדי ידלל את החלבון lysate.
4. מניחים את הצינור על קרח sonicate הרקמה ב משרעת של 40% במשך 2.5 דקות עם מחזורי דופק של 5 s (ON/OFF, בהתאמה).
5. מוסיפים חרוזי זירקוניום לצינורות ומרגיזים את הרקמה באמצעות מקצף חרוזים במשך 90 s עם 5 דקות דגירה על קרח. חזור על שלב זה פעמיים.
6. ברגע שהרקמה הומוגנית כראוי, לדגור על הצינור על קרח במשך 10 דקות.
7. לאחר הדגירה, צנטריפוגה הדגימה ב 6,018 x g במשך 15 דקות ב 4 °C (70 °F) כדי להפריד את פסולת התא מן supernatant.
8. לאסוף את supernatant בצינור שכותרתו טרי ולאחסן ב -80 °C כמו aliquots עד לשימוש נוסף.

2. כימות חלבונים ובדיקת איכות של ליסאטים של רקמות

1. לכמת את ריכוז החלבון ברקמות lysate באמצעות ריאגנט של ברדפורד כמתואר בקובץ המשלים 1.
2. לאחר כימות החלבון, הפעל 10 מיקרוגרם של ריסאט רקמות על ג'ל SDS-PAGE 12% כדי לבדוק את איכות lysate.
   הערה: עיבוד במורד הזרם חייב להתבצע רק עבור lysates ניקוי בדיקות האיכות.

3. עיכול אנזימטי של חלבונים

הערה: השלבים לעיכול אנזימטי מוצגים באיור 1a.

1. לעיכול, לקחת 50 מיקרוגרם של חלבונים ולהוסיף ddH₂O כדי לפצות על הנפח ל 20 μL.
2. עכשיו, להכין 20 mM טריס (2-carboxyethyl) פוספין (TCEP) מן המניה (0.5 M TCEP) על ידי הוספת 0.8 μL מהמלאי לחלבון ליסאט כדי להפחית את קשרים דיסולפידים בחלבונים ולדגום על המדגם ב 37 °C (60 דקות).
3. הכן 40 mM iodoacetamide (IAA) ב ddH₂O ולהוסיף 1.6 μL כדי alkylate שאריות ציסטאין מופחת. דגירה בחושך במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
4. הוסף מאגר דילול המכיל 25 mM Tris pH 8.0 ו 1 mM CaCl₂ ביחס 1:8 כדי לדלל את ריכוז אוריאה לפחות מ 1 M במדגם. בשלב זה, לבדוק את ה- pH.
   הערה: אם משתמשים טריפסין כאנזים עיכול, ודאו שריכוז האוריאה הוא פחות מ-1 מ'.
5. כדי לבצע עיכול, להוסיף טריפסין ביחס אנזים/מצע של 1:50. לדגור על הצינורות ב 37 °C (50 °F) באמבטיה יבשה רועדת במשך 16 שעות לעיכול לילה.
   הערה: אנזים טריפסין הוא פרוטאז תגובתי מאוד נוטה לעיכול עצמי. קח טיפול נוסף ולבצע את התוספת של טריפסין במהירות מעל הקרח.
6. לאחר 16 שעות של דגירה, יבשו את הפפטידים המעוכלים ברכז ואקום.

4. התפלת פפטידים מעוכלים

הערה: כדי לבצע התפלה של פפטידים, השתמש בעצות שלב C18.

1. הפעל את קצה שלב C18 על-ידי הוספת 50 μL של מתנול. צנטריפוגה הקצה ב 1,000 x g במשך 2 דקות ב RT. להשליך את הסינון שנאסף בתחתית הצינור. חזור פעמיים.
2. הוסף 50 μL של acetonitrile ב 0.1% חומצה פורמית לשטוף את קצה הבמה. צנטריפוגה הצינור ב 1,000 x g במשך 2 דקות ב RT. להשליך את הסינון שנאסף בתחתית הצינור. חזור על שלב זה פעמיים.
3. הוסף 50 μL של 0.1% (v/v) FA כדי לכלול את העמודה. שוב, לבצע את centrifugation ב 1,000 x g במשך 2 דקות ב RT ולהשליך את הסינון.
4. ליישב מחדש את הפפטידים המיובשים ב 50 μL של 0.1% חומצה פורמית.
   הערה: הימנע היווצרות בועת אוויר בתוך טיפים שלב בעת העברת המדגם. טיפים שלב לא צריך להיות מיובש לחלוטין במהלך שלב centrifugation, כמו ייבוש יכול להוביל לאובדן פפטיד.
5. מוסיפים את הפפטידים המחודשים לקצה הבמה המופעל ומעבירים את המדגם דרך קצה הבמה על ידי צנטריפוגה ב-1,000 x גרם למשך 2 דקות. חזור על שלב זה לפחות ארבע פעמים. לאחסן את הזרימה דרך ב 4 °C (5 °F).
6. כדי לשטוף את המדגם, להוסיף 50 μL של 0.1% (v/v) חומצה פורמית. חזור על שלב צנטריפוגה ובטל את הסינון.
7. עבור elution של פפטידים, להוסיף 50 μL של 40% (v/ v) ACN ב 0.1% חומצה פורמית (v/ v) ולהעביר אותו דרך קצה הבמה על ידי צנטריפוגה. לאסוף את הסינון בצינור טרי. חזור על השלב עם 50% ו 60% ACN ב 0.1% חומצה פורמית ולאסוף את הסינון באותו צינור טרי.
8. יבשו את הפפטידים המותפלים שנאספו בצינור הטרי באמצעות רכז ואקום.
   הערה: הפפטידים המותפלים היבשים מוכנים להזרקה, או שניתן לאחסן אותם ב -20 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים. לאחסון לטווח ארוך (>6 חודשים), יש לאחסן את הפפטידים ב-80 °C (80 °F).

5. כימות פפטידים מותפלים

1. תרכיבו מחדש את הפפטידים המותפלים המיובשים ב-FA של 0.1%.
2. נגב את לוח המדידה הפוטומטרי עם רקמה נטולת מוך באמצעות 70% אתנול.
3. השתמש ב- 2 μL של 0.1% FA כדי להגדיר את הריק.
4. הוסף 2 μL של דגימות מחדש על הלוח ב replicates.
5. מניחים את הצלחת בספקטרופוטומטר ומודדים את הספיגה ב-205 ננומטר ו-280 ננומטר.
6. חשב ספיגת טוחנת (ε) באמצעות הנוסחה הבאה:
   ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
   הערה: ספיגת טוחנת (ε) היא מדד להסתברות של המעבר האלקטרוני או עד כמה מין סופג את אורך הגל המסוים של קרינה כי הוא להיות אירוע על זה. הערך של ε צריך להיות בטווח של 31 מ"ל מ"ג^-1ס"מ^-1 עד 33 מ"ל מ"ג^-1ס"מ^-1. אם הערך אינו נופל בטווח, הדבר מציין שהדגימות אינן מתעכלות כראוי.
7. חשב את ריכוז הפפטיד ב- μg/μL באמצעות הנוסחה הבאה:
   ריכוז פפטיד = נטו OD (205) / 0.051 * ε

6. כמות ללא תוויות (LFQ) של הפפטידים המעוכלים

הערה: עבור כמות ללא תוויות, השתמש בפרמטרים של LC ו- MS המוזכרים בקובץ המשלים 2. נתוני כיסוי גבוה הושגו כאשר שלושה שכפולים ביולוגיים מאותו סוג של המדגם פורסמו בספקטרומטר המסה.

1. הגדרת כרומטוגרפיה נוזלית
   1. לאחר כימות פפטידים מותפלים, לקחת 2 מיקרוגרם של פפטידים בוויאליה ולהפיק את הנפח ל 10 μL באמצעות 0.1% FA. הריכוז של פפטידים מותפלים יהיה 200 ננוגרם / μL.
   2. פתח את הדגימה האוטומטית של מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית (ראה טבלה של חומרים) והנח את ה- vial בתוך הדגימה האוטומטית.
   3. השתמש ב- 0.1% (v/v) FA כדי לכלול את העמודה שלפני העמודה והאנליטית.
   4. קח 1 מיקרוגרם של פפטיד מעוכל מותפל מהחינתון וטען אותו על העמוד.
   5. הגדר את מעבר הצבע LC בהתאם למורכבות המדגם. בניסוי זה, שיפוע LC שימש במשך 120 דקות עבור כמות ללא תווית של דגימות הרקמה.
2. הגדרת MS: לפני אופטימיזציה של כל בדיקות proteomics, לבצע בדיקת בקרת איכות של המכשיר על ידי ניטור כמה פפטידים של אלבומין סרום בקר (BSA) באמצעות כל תוכנה להתאמת המערכת וניתוח כיסוי של BSA (איור 2A,B). פרמטרי הרכישה הוגדרו במכשיר באמצעות תוכנת רכישת הנתונים של MS (ראה טבלת חומרים).
   1. פתח את התוכנה, לחץ פעמיים על הגדרת מכשיר ובחר את התבנית מתוך פפטידים-ID עם פרמטרי ברירת מחדל.
   2. הגדר את הפרמטרים של MS באמצעות קובץ משלים 2 ושמור אותו כשיטה חדשה.
   3. עכשיו, לפתוח את התוכנה כדי למלא את הפרטים לדוגמה; לחץ פעמיים על הגדרת הרצף, ומלא את הפרטים כגון סוג לדוגמה, שם לדוגמה, מיקום שמירת קובץ, קובץ שיטת מכשיר, עוצמת ההזרקה ומיקום המדגם.
   4. לאחר מילוי כל המידע, בחר את השורה והתחל את הפעל.

7. כמות מבוססת תווית (iTRAQ) של פפטידים מעוכלים

הערה: כימות מבוסס תווית יכול להתבצע באמצעות תוויות איזובריות שונות כגון iTRAQ או ריאגנטים TMT, וכו '. כאן, iTRAQ 4-plex שימש לתיוג של פפטידים מעוכלים משלוש דגימות רקמה. ההליך של תיוג iTRAQ 4-plex מוזכר להלן.

1. תיוג של פפטידים מעוכלים באמצעות ריאגנטים iTRAQ.
   הערה: בניסוי זה, פפטידים משלוש דגימות רקמה משמשים. מכל דגימת רקמה, 80 מיקרוגרם של פפטידים מעוכלים נלקחים בארבעה צינורות לתיוג עם ריאגנטים iTRAQ (114, 115, 116, ו 117) (ראה קובץ משלים 3 עבור הפרמטרים הניסיוניים המפורטים).
   1. לפני השימוש ריאגנט iTRAQ, להביא כל מקטורינה של ריאגנט לטמפרטורת החדר (כ 5 דקות). תן ספין קצר של כ 30 s להביא את הפתרון בתחתית כל חתול.
      הערה: ודא כי בכל ממתקין, פתרון 10-15 μL צריך להיות נוכח.
   2. לתיוג iTRAQ, יש תגדירו מחדש את הפפטידים היבשים ב-20 מיקרו-אל של מאגר פירוק המסופק בערכת התוויות של iTRAQ.
   3. ליישב מחדש את התוויות על ידי הוספת 70 μL של אתנול מן המשחקון המסופק בערכה ולערבב את הפתרון עבור 30 s ולסובב אותו עבור 10 s.
      הערה: מומלץ כי כל השלבים להתבצע בהתאם להוראות היצרן.
   4. הוסף את תוויות iTRAQ המעורבות באופן הומוגני (114, 115, 116 ו- 117) לצינורות המתאימים שלהם המכילים דגימות פפטיד ולאפשר את תגובת התיוג להתרחש.
   5. מערבבים את הרכיבים של כל צינור על ידי מערבולת הצינור במשך 30 s, ולאחר מכן לסובב את הצינור במשך 10 s כדי להחזיר את התערובת לתחתית הצינור.
      הערה: בדוק את ה- pH של הפתרון באמצעות נייר pH. pH צריך להיות גדול מ 8; אם לא, הוסף עד 10 μL של מאגר הפירוק כדי להתאים את ה- pH.
   6. לדגור על כל צינור בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות. בסוף התגובה, להרוות כל תווית לא מאוגדת עודף בצינור על ידי הוספת מים כיתה MS.
   7. לדגור על הצינורות בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד 1 שעה.
   8. לאחר שהדגירה נגמרת, מעבירים את כל התוכן המסומן לצינור אחד ומייבשים את הפפטידים המסומנים ברכז ואקום.
      הערה: ניתן לעקוב אחר הליך תיוג דומה עבור תיוג TMT.
2. הגדרת כרומטוגרפיה נוזלית
   1. ליישב מחדש את הדגימות 0.1% חומצה פורמית, לפתוח את הדגימה האוטומטית של ננו LC, ולהניח את הדגימות בתוך דגימת אוטומטית. השתמש בפרמטרים המוזכרים בקובץ המשלים 2 עבור הגדרת LC.
   2. הגדר את מעבר הצבע LC בהתאם למורכבות המדגם. שיפוע LC של 180 דקות שימש בניסוי זה עבור כמות מבוססת תווית (iTRAQ) של דגימות הרקמה.
      הערה: עבור דוגמאות פחות מורכבות, שיפוע קצר יכול להפריד ביעילות את רוב הפפטידים. עם זאת, אם המדגם מורכב מאוד, השתמש בשיפוע ארוך יותר להפרדה טובה יותר של פפטידים.
3. הגדרת MS עבור טכניקת iTRAQ
   1. הגדר את כל הפרמטרים של MS עבור כמות מבוססת תווית באותו אופן המשמש עבור הכמות נטולת התוויות למעט אנרגיית ההתנגשות, שהוגדרה ל- 35% עבור פיצול MS/MS בכמות המבוססת על תווית.

8. ניתוח נתונים

1. נתח את הקבצים הגולמיים (ספקטרום MS/MS) שהתקבלו בספקטרומטר מסת LC באמצעות תוכנת ניתוח זמינה מסחרית (ראה טבלת חומרים).
   הערה: מסד הנתונים של פרוטאום הייחוס האנושי של Uniprot (UP000005640) הכולל 71,785 רצפי חלבונים שימש להשגת זהויות חלבון באמצעות מנועי החיפוש Sequest HT וקמע (v2.6.0). הפרמטרים עבור כמות ללא תוויות וכמות מבוססת תווית מתוארים בקובץ המשלים 4.

תוצאות

השתמשנו בשתי גישות שונות לגילוי פרוטאומיקס: גישות פרוטאומיות ללא תוויות ומבוססות תוויות. פרופיל החלבון של דגימות רקמות ב-SDS-PAGE הראה את החלבונים השלמים וניתן לשקול אותו לניתוח פרוטאומי(איור 2A). בדיקת בקרת האיכות של המכשיר הייתה מנוטרת באמצעות תוכנת התאמת מערכת והיא הר?...

Discussion

פרוטאומייקה של רקמות של דגימות ביולוגיות מאפשרת לנו לחקור סמנים ביולוגיים פוטנציאליים חדשים הקשורים לשלבים שונים של התקדמות המחלה. זה גם מסביר את מנגנון האיתות והמסלולים הקשורים להתקדמות המחלה. הפרוטוקול המתואר לניתוח פרוטאומי כמותי של רקמות מספק נתוני כיסוי טובים לשחזור. רוב השלבים הו...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388