Flujo de trabajo integral de proteómica de escopeta basada en espectrometría de masas de muestras de tejido

Resumen

El protocolo descrito proporciona un análisis proteómico cuantitativo optimizado de muestras de tejido utilizando dos enfoques: cuantificación basada en etiquetas y sin etiquetas. Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas, mientras que un enfoque sin etiquetas es más rentable y se utiliza para analizar cientos de muestras de una cohorte.

Resumen

Los avances recientes en espectrometría de masas han dado como resultado un análisis proteómico profundo junto con la generación de conjuntos de datos robustos y reproducibles. Sin embargo, a pesar de los considerables avances técnicos, la preparación de muestras a partir de bioespecímenes como la sangre del paciente, el CSF y el tejido todavía plantea desafíos considerables. Para identificar biomarcadores, la proteómica tisular a menudo proporciona una fuente de muestra atractiva para traducir los hallazgos de la investigación del banco a la clínica. Puede revelar posibles biomarcadores candidatos para el diagnóstico precoz del cáncer y enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, etc. La proteómica tisular también produce una gran cantidad de información sistémica basada en la abundancia de proteínas y ayuda a abordar preguntas biológicas interesantes.

El análisis proteómico cuantitativo se puede agrupar en dos grandes categorías: un enfoque basado en etiquetas y un enfoque sin etiquetas. En el enfoque basado en etiquetas, las proteínas o péptidos se etiquetan utilizando isótopos estables como SILAC (etiquetado de isótopos estables con aminoácidos en cultivo celular) o mediante etiquetas químicas como ICAT (etiquetas de afinidad codificadas por isótopos), TMT (etiqueta de masa en tándem) o iTRAQ (etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta). Los enfoques basados en etiquetas tienen la ventaja de una cuantificación más precisa de las proteínas y, utilizando etiquetas isobáricas, se pueden analizar múltiples muestras en un solo experimento. El enfoque sin etiquetas proporciona una alternativa rentable a los enfoques basados en etiquetas. Cientos de muestras de pacientes pertenecientes a una cohorte en particular pueden ser analizadas y comparadas con otras cohortes en función de las características clínicas. Aquí, hemos descrito un flujo de trabajo de proteómica cuantitativa optimizada para muestras de tejido utilizando métodos de perfiles de proteoma sin etiquetas y basados en etiquetas, que es crucial para las aplicaciones en ciencias de la vida, especialmente los proyectos basados en el descubrimiento de biomarcadores.

Introducción

Las tecnologías proteómicas tienen el potencial de permitir la identificación y cuantificación de posibles marcadores candidatos que pueden ayudar en la detección y pronóstico de la enfermedad¹. Los recientes avances en el campo de la espectrometría de masas han acelerado la investigación clínica a nivel de proteínas. Los investigadores están tratando de abordar el desafío de la patobiología complicada de varias enfermedades utilizando proteómica basada en espectrometría de masas, que ahora ofrece una mayor sensibilidad para la identificación y cuantificación de proteínas². La medición cuantitativa precisa de las proteínas es crucial para comprender la cooperación dinámica y espacial entre las proteínas en individuos sanos y enfermos³; sin embargo, tal análisis a escala de proteoma no es fácil.

Una limitación importante del perfil proteómico de las muestras clínicas es la complejidad de las muestras biológicas. Se han investigado muchos tipos diferentes de muestras para estudiar el proteoma de la enfermedad, como líneas celulares, plasma y tejidos^4,5. Las líneas celulares son ampliamente utilizadas como modelos en experimentos in vitro para imitar diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, una limitación importante con las líneas celulares es que adquieren fácilmente cambios genotípicos y fenotípicos durante el proceso de cultivo celular⁶. Los fluidos corporales como el plasma podrían ser una fuente atractiva para el descubrimiento de biomarcadores; sin embargo, debido a las proteínas altamente abundantes y al rango dinámico de concentración de proteínas, la proteómica plasmática es un poco más desafiante⁷. Aquí, los péptidos originados a partir de las proteínas más abundantes pueden suprimir los derivados de las proteínas poco abundantes, incluso si la relación masa/carga es la misma⁶. Aunque ha habido avances en las tecnologías de agotamiento y fraccionamiento en los últimos años, obtener una buena cobertura sigue siendo una limitación importante de la proteómica plasmática^8,9. Se prefiere el uso de tejidos para la investigación proteómica de la biología de la enfermedad, ya que las muestras de tejido son más proximales a los sitios de la enfermedad y ofrecen alta información fisiológica y patológica para proporcionar una mejor comprensión de la biología de la enfermedad^10,11.

En este manuscrito, hemos proporcionado un protocolo simplificado para la proteómica cuantitativa de muestras de tejido. Hemos utilizado un tampón que contiene 8 M de urea para la preparación de lisato tisular, ya que este tampón es compatible con las investigaciones basadas en espectrometría de masas. Sin embargo, es obligatorio limpiar los péptidos para eliminar las sales antes de inyectarlas en el espectrómetro de masas. Un punto importante a recordar es reducir la concentración de urea a menos de 1 M antes de agregar tripsina para la digestión de proteínas, ya que la tripsina exhibe baja actividad a una concentración de urea de 8 M. Hemos explicado dos enfoques de la proteómica global cuantitativa: la cuantificación basada en etiquetas utilizando iTRAQ (etiquetas isobáricas para cuantificación relativa y absoluta) y la cuantificación sin etiquetas (LFQ). La proteómica cuantitativa basada en iTRAQ se utiliza principalmente para comparar múltiples muestras que varían en su condición biológica (por ejemplo, muestras normales versus de enfermedades o tratadas). El enfoque utiliza reactivos isobáricos para etiquetar las aminas primarias N-terminales de los péptidos¹². Los reactivos iTRAQ contienen un grupo reportero N-metil piperazina, un grupo equilibrador y un grupo éster N-hidroxi succinimida que reacciona con aminas primarias N-terminales de péptidos¹³. Los péptidos digeridos de cada afección se etiquetan con un reactivo iTRAQ particular. Después del etiquetado, la reacción se detiene y los péptidos etiquetados de diferentes condiciones se agrupan en un solo tubo. Esta mezcla de muestra combinada se analiza mediante espectrómetro de masas para su identificación y cuantificación. Después del análisis MS/MS, se generan fragmentos de iones reporteros con bajas masas moleculares y se utilizan las intensidades iónicas de estos iones reporteros para la cuantificación de las proteínas.

Otro enfoque, la cuantificación sin etiquetas, se utiliza para determinar el número relativo de proteínas en muestras complejas sin etiquetar péptidos con isótopos estables.

Protocolo

Este estudio fue revisado y aprobado por las juntas de revisión institucional y el comité de ética del Instituto Indio de Tecnología de Bombay (IITB-IEC/2016/026). Los pacientes/participantes dieron su consentimiento por escrito para participar en este estudio.

1. Preparación de lisato tisular

NOTA: Realice todos los pasos siguientes en el hielo para mantener las proteasas inactivas. Asegúrese de que los bisturíes y los tubos utilizados sean estériles para evitar cualquier contaminación cruzada.

1. Tome ~ 30 mg de tejido en un tubo de batido de cuentas, agregue 200 μL de solución salina tampón de fosfato 1x (PBS) y vórtice.
   NOTA: En este estudio, se tomaron tejidos frescos congelados del tumor cerebral humano para la preparación del lisato. El protocolo se puede utilizar para cualquier tejido fresco congelado con algunos cambios dependiendo del tipo de tejidos (tejidos blandos o duros) y la complejidad celular de los tejidos.
2. Después de eso, gire el tubo para asentar el tejido y retire cuidadosamente el PBS con una pipeta. Realice otro lavado de PBS si todavía quedan rastros de sangre en el tejido.
3. Agregue 300 μL de tampón de lisis de urea (8 M de urea, 50 mM Tris pH 8.0, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂₎y cóctel inhibidor de proteasa (PIC) según el protocolo del fabricante.
   NOTA: El volumen del tampón de lisis debe ser suficiente para moler el tejido durante el proceso de sonicación y suspender lo que se extrae. Muy poco tampón de lisis puede resultar en una lisis tisular ineficiente, mientras que demasiado tampón de lisis diluirá el lisato de proteína.
4. Coloque el tubo sobre hielo y sonice el tejido a una amplitud del 40% durante 2,5 min con ciclos de pulso de 5 s (ON/OFF, respectivamente).
5. Agregue perlas de circonio a los tubos y homogeneice el tejido usando un batidor de cuentas durante 90 s con 5 minutos de incubación en hielo. Repita este paso dos veces.
6. Una vez que el tejido esté adecuadamente homogeneizado, incubar el tubo en hielo durante 10 min.
7. Después de la incubación, centrífuga la muestra a 6.018 x g durante 15 min a 4 °C para separar los restos celulares del sobrenadante.
8. Recoger el sobrenadante en el tubo fresco etiquetado y conservar a -80 °C como alícuotas hasta su posterior uso.

2. Cuantificación de proteínas y control de calidad de lisatos tisulares

1. Cuantificar la concentración de proteínas en el lisato tisular utilizando el reactivo de Bradford como se describe en el Archivo Suplementario 1.
2. Después de la cuantificación de la proteína, ejecute 10 μg de lisado tisular en un gel SDS-PAGE al 12% para verificar la calidad del lisato.
   NOTA: El procesamiento posterior posterior debe llevarse a cabo solo para los lisados que compensan los controles de calidad.

3. Digestión enzimática de proteínas

NOTA: Los pasos para la digestión enzimática se muestran en la Figura 1a.

1. Para la digestión, tome 50 μg de proteínas y agregue ddH₂O para compensar el volumen a 20 μL.
2. Ahora, prepare 20 mM Tris (2-carboxietilo) fosfina (TCEP) del stock (0.5 M TCEP) agregando 0.8 μL de stock al lisato de proteína para reducir los enlaces disulfuro en las proteínas e incubar la muestra a 37 ° C durante 60 min.
3. Preparar 40 mM de yodoacetamida (IAA) en ddH₂O y añadir 1,6 μL para alquilar los residuos reducidos de cisteína. Incubar en la oscuridad durante 10 min a temperatura ambiente.
4. Añadir tampón de dilución que contenga 25 mM Tris pH 8.0 y 1 mM CaCl₂ en una proporción de 1:8 para diluir la concentración de urea a menos de 1 M en la muestra. En este punto, verifique el pH.
   NOTA: Si usa tripsina como enzima de digestión, asegúrese de que la concentración de urea sea inferior a 1 M.
5. Para realizar la digestión, agregue tripsina en una proporción enzima/sustrato de 1:50. Incubar los tubos a 37 °C en un baño seco agitado durante 16 h para la digestión durante la noche.
   NOTA: La enzima tripsina es una proteasa altamente reactiva que es propensa a la auto digestión. Tenga especial cuidado y realice la adición de tripsina rápidamente sobre el hielo.
6. Después de 16 h de incubación, seque los péptidos digeridos en un concentrador de vacío.

4. Desalinación de péptidos digeridos

NOTA: Para realizar la desalinación de péptidos, use puntas de etapa C18.

1. Active la punta de la etapa C18 agregando 50 μL de metanol. Centrifugar la punta a 1.000 x g durante 2 min en RT. Desechar el filtrado recogido en la parte inferior del tubo. Repetir dos veces.
2. Añadir 50 μL de acetonitrilo en ácido fórmico al 0,1% para lavar la punta del estadio. Centrifugar el tubo a 1.000 x g durante 2 min en RT. Deseche el filtrado recogido en la parte inferior del tubo. Repita este paso dos veces.
3. Agregue 50 μL de 0.1% (v/v) FA para equilibrar la columna. De nuevo, realice la centrifugación a 1.000 x g durante 2 min en RT y deseche el filtrado.
4. Reconstituir los péptidos digeridos secos en 50 μL de ácido fórmico al 0,1%.
   NOTA: Evite la formación de burbujas de aire dentro de las puntas del escenario mientras pasa la muestra. Las puntas de la etapa no deben secarse completamente durante la etapa de centrifugación, ya que el secado puede provocar la pérdida de péptidos.
5. Agregue los péptidos reconstituidos en la punta de la etapa activada y pase la muestra a través de la punta de la etapa por centrifugación a 1,000 x g durante 2 min. Repita este paso al menos cuatro veces. Almacene el flujo a 4 °C.
6. Para lavar la muestra, agregue 50 μL de ácido fórmico al 0.1% (v / v). Repita el paso de centrifugación y deseche el filtrado.
7. Para la elución de péptidos, agregue 50 μL de 40% (v / v) ACN en ácido fórmico al 0.1% (v / v) y páselo a través de la punta de la etapa por centrifugación. Recoger el filtrado en un tubo fresco. Repita el paso con 50% y 60% de ACN en ácido fórmico al 0,1% y recoja el filtrado en el mismo tubo fresco.
8. Seque los péptidos desalados recogidos en el tubo fresco utilizando un concentrador de vacío.
   NOTA: Los péptidos desalados secos están listos para ser inyectados, o se pueden almacenar a -20 °C durante 6 meses. Para el almacenamiento a largo plazo (>6 meses), guarde los péptidos a -80 °C.

5. Cuantificación de péptidos desalados

1. Reconstituir los péptidos desalados secos en FA al 0,1%.
2. Limpie la placa de medición fotométrica con tejido libre de pelusa con etanol al 70%.
3. Use 2 μL de 0.1% FA para establecer el espacio en blanco.
4. Agregue 2 μL de muestras reconstituidas a la placa en réplicas.
5. Coloque la placa en el espectrofotómetro y mida la absorbancia a 205 nm y 280 nm.
6. Calcule la absorción molar (ε) utilizando la siguiente fórmula:
   ε = 27 / [1 - 3.85 * A280 / A205]
   NOTA: La absorción molar (ε) es una medida de la probabilidad de la transición electrónica o qué tan bien una especie absorbe la longitud de onda particular de la radiación que está siendo incidente en ella. El valor de ε debe estar en el rango de 31 ml mg^-1cm^-1 a 33 ml mg^-1cm^-1. Si el valor no cae en el rango, esto indica que las muestras no se digieren correctamente.
7. Calcule la concentración de péptidos en μg/μL utilizando la siguiente fórmula:
   Concentración de péptido = OD neto (205) / 0.051 * ε

6. Cuantificación sin etiqueta (LFQ) de los péptidos digeridos

NOTA: Para la cuantificación sin etiquetas, utilice los parámetros LC y MS mencionados en el archivo complementario 2. Se obtuvo un dato de alta cobertura cuando se ejecutaron tres réplicas biológicas del mismo tipo de muestra en el espectrómetro de masas.

1. Configuración de cromatografía líquida
   1. Después de la cuantificación de péptidos desalados, tome 2 μg de péptidos en un vial y haga el volumen a 10 μL usando 0.1% FA. La concentración de péptidos desalados será de 200 ng/μL.
   2. Abra el muestreador automático del sistema de cromatografía líquida (consulte la Tabla de materiales)y coloque el vial dentro del muestreador automático.
   3. Utilice 0.1% (v/v) FA para equilibrar la columna previa y la columna analítica.
   4. Tome 1 μg de péptido digerido desatado del vial y cárgelo en la columna.
   5. Establezca el gradiente LC de acuerdo con la complejidad de la muestra. En este experimento, se utilizó el gradiente LC durante 120 minutos para la cuantificación sin etiqueta de las muestras de tejido.
2. Configuración de MS: Antes de optimizar cualquier ensayo de proteómica, realice una verificación de control de calidad del instrumento monitoreando algunos péptidos de albúmina sérica bovina (BSA) utilizando cualquier software para la idoneidad del sistema y analizando la cobertura de BSA(Figura 2A,B). Los parámetros de adquisición se establecieron en el instrumento utilizando el software de adquisición de datos MS (ver Tabla de Materiales).
   1. Abra el software, haga doble clic en Configuración de instrumentos y seleccione la plantilla de peptides-ID con los parámetros predeterminados.
   2. Establezca los parámetros de MS utilizando el archivo suplementario 2 y guárdelo como un nuevo método.
   3. Ahora, abra el software para completar los detalles de la muestra; Haga doble clic en Configuración de secuenciay complete los detalles como el tipo de muestra, el nombre de la muestra, la ubicación de guardado del archivo, el archivo del método del instrumento, el volumen de inyección y la posición de la muestra.
   4. Una vez completada toda la información, seleccione la fila e inicie el botón Ejecutar.

7. Cuantificación basada en etiquetas (iTRAQ) de péptidos digeridos

NOTA: La cuantificación basada en etiquetas se puede realizar utilizando diferentes etiquetas isobáricas como reactivos iTRAQ o TMT, etc. Aquí, iTRAQ 4-plex se utilizó para el etiquetado de péptidos digeridos de tres muestras de tejido. El procedimiento de etiquetado iTRAQ 4-plex se menciona a continuación.

1. Etiquetado de péptidos digeridos utilizando reactivos iTRAQ.
   NOTA: En este experimento, se utilizan péptidos de tres muestras de tejido. De cada muestra de tejido, se toman 80 μg de péptidos digeridos en cuatro tubos para su etiquetado con reactivos iTRAQ (114, 115, 116 y 117) (consulte el Archivo Complementario 3 para los parámetros experimentales detallados).
   1. Antes de usar el reactivo iTRAQ, lleve cada vial del reactivo a temperatura ambiente (aproximadamente 5 min). Dé un breve giro de aproximadamente 30 s para llevar la solución en la parte inferior de cada vial.
      NOTA: Asegúrese de que en cada vial, 10-15 μL de solución debe estar presente.
   2. Para el etiquetado de iTRAQ, reconstituya los péptidos secos en 20 μL de tampón de disolución proporcionado en el kit de etiquetado de iTRAQ.
   3. Reconstituir las etiquetas añadiendo 70 μL de etanol del vial suministrado en el kit y mezclar la solución durante 30 s y girarla durante 10 s.
      NOTA: Es aconsejable que todos los pasos se lleven a cabo según las instrucciones del fabricante.
   4. Agregue las etiquetas iTRAQ mezcladas homogéneamente (114, 115, 116 y 117) a sus respectivos tubos que contienen muestras de péptidos y permita que se produzca la reacción de etiquetado.
   5. Mezcle los componentes de cada tubo vórtice el tubo durante 30 s, y luego gire el tubo durante 10 s para llevar la mezcla de vuelta al fondo del tubo.
      NOTA: Compruebe el pH de la solución con papel de pH. el pH debe ser superior a 8; de lo contrario, agregue hasta 10 μL del tampón de disolución para ajustar el pH.
   6. Incubar cada tubo a temperatura ambiente durante 90 min. Al final de la reacción, sucle cualquier exceso de etiqueta sin encuadernar en el tubo agregando agua de grado MS.
   7. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 30 min a 1 h.
   8. Una vez que termine la incubación, transfiera todo el contenido etiquetado en un solo tubo y seque los péptidos etiquetados en un concentrador de vacío.
      NOTA: Se puede seguir un procedimiento de etiquetado similar para el etiquetado TMT.
2. Configuración de cromatografía líquida
   1. Reconstituya las muestras en ácido fórmico al 0,1%, abra el muestreador automático de nano LC y coloque las muestras dentro del muestreador automático. Utilice los parámetros mencionados en el archivo complementario 2 para la configuración de LC.
   2. Establezca el gradiente LC de acuerdo con la complejidad de la muestra. En este experimento se utilizó un gradiente LC de 180 min para la cuantificación basada en etiquetas (iTRAQ) de las muestras de tejido.
      NOTA: Para muestras menos complejas, el gradiente corto puede separar eficientemente la mayoría de los péptidos. Sin embargo, si la muestra es muy compleja, use un gradiente más largo para una mejor separación de los péptidos.
3. Configuración de MS para la técnica iTRAQ
   1. Configure todos los parámetros de MS para la cuantificación basada en etiquetas de la misma manera que se usa para la cuantificación sin etiquetas, excepto para la energía de colisión, que se estableció en un 35% para la fragmentación de MS / MS en la cuantificación basada en etiquetas.

8. Análisis de datos

1. Analizar los archivos en bruto (espectro MS/MS) obtenidos del espectrómetro de masas LC utilizando un software de análisis disponible comercialmente (ver Tabla de Materiales).
   NOTA: La base de datos Human Reference Proteome de Uniprot (UP000005640) que comprende 71.785 secuencias de proteínas se utilizó para obtener identidades de proteínas utilizando los motores de búsqueda Sequest HT y Mascot (v2.6.0). Los parámetros para la cuantificación sin etiquetas y la cuantificación basada en etiquetas se describen en el archivo complementario 4.

Resultados

Hemos utilizado dos enfoques diferentes para la proteómica de descubrimiento: enfoques proteómicos sin etiquetas y basados en etiquetas. El perfil proteico de muestras de tejido en SDS-PAGE mostró las proteínas intactas y pudo ser considerado para el análisis proteómico(Figura 2A). La verificación de control de calidad del instrumento se monitoreó a través del software de idoneidad del sistema y mostró la variación diaria en el rendimiento del instrumento

Discusión

La proteómica tisular de muestras biológicas nos permite explorar nuevos biomarcadores potenciales asociados con diferentes etapas de la progresión de la enfermedad. También explica el mecanismo de señalización y las vías asociadas con la progresión de la enfermedad. El protocolo descrito para el análisis proteómico cuantitativo de tejidos proporciona buenos datos de cobertura reproducibles. La mayoría de los pasos se han adaptado de las instrucciones del fabricante. Para obtener datos de alta calidad, los sig...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388