Комплексный рабочий процесс протеомики образцов тканей на основе масс-спектрометрии

Резюме

Описанный протокол обеспечивает оптимизированный количественный протеомический анализ образцов тканей с использованием двух подходов: на основе меток и свободного количественного определения меток. Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном анализе белков, в то время как подход без маркировки является более экономически эффективным и используется для анализа сотен образцов когорты.

Аннотация

Последние достижения в области масс-спектрометрии привели к глубокому протеомическому анализу наряду с созданием надежных и воспроизводимых наборов данных. Однако, несмотря на значительные технические достижения, подготовка образцов из биообразцов, таких как кровь пациента, ликвор и ткани, по-прежнему создает значительные проблемы. Для выявления биомаркеров тканевая протеомика часто обеспечивает привлекательный источник образцов для перевода результатов исследований со стенда в клинику. Он может выявить потенциальные биомаркеры-кандидаты для ранней диагностики рака и нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и т. Д. Тканевая протеомика также дает богатую системную информацию, основанную на обилии белков, и помогает решать интересные биологические вопросы.

Количественный анализ протеомики можно сгруппировать в две широкие категории: подход, основанный на маркировке, и подход без меток. В подходе, основанном на маркировке, белки или пептиды мечятся с использованием стабильных изотопов, таких как SILAC (маркировка стабильных изотопов аминокислотами в клеточной культуре) или химическими метками, такими как ICAT (метки аффинности с кодированием изотопов), TMT (тандемная массовая метка) или iTRAQ (изобарическая метка для относительного и абсолютного количественного определения). Подходы, основанные на этикетках, имеют преимущество в более точном количественном обозначении белков и использовании изобарических меток, несколько образцов могут быть проанализированы в одном эксперименте. Подход без маркировки обеспечивает экономически эффективную альтернативу подходам, основанным на маркировке. Сотни образцов пациентов, принадлежащих к определенной когорте, могут быть проанализированы и сопоставлены с другими когортами на основе клинических особенностей. Здесь мы описали оптимизированный рабочий процесс количественной протеомики для образцов тканей с использованием методов профилирования протеомов без этикеток и на основе этикеток, что имеет решающее значение для приложений в науках о жизни, особенно в проектах, основанных на обнаружении биомаркеров.

Введение

Технологии протеомики обладают потенциалом для идентификации и количественной оценки потенциальных маркеров-кандидатов, которые могут помочь в выявлении и прогнозировании заболевания^1. Последние достижения в области масс-спектрометрии ускорили клинические исследования на уровне белка. Исследователи пытаются решить проблему сложной патобиологии нескольких заболеваний с помощью протеомики на основе масс-спектрометрии, которая теперь предлагает повышенную чувствительность для идентификации и количественной оценки белка^2. Точное количественное измерение белков имеет решающее значение для понимания динамического и пространственного сотрудничества между белками у здоровых и больных людей^3; однако такой анализ в масштабах всего протеома непрост.

Одним из основных ограничений протеомного профилирования клинических образцов является сложность биологических образцов. Для изучения протеома заболевания было исследовано много различных типов образцов, таких как клеточные линии, плазма и^{ткани 4,5.} Клеточные линии широко используются в качестве моделей в экспериментах in vitro для имитации различных стадий прогрессирования заболевания. Однако одним из основных ограничений клеточных линий является то, что они легко приобретают генотипические и фенотипические изменения в процессе клеточной культуры^6. Жидкости организма, такие как плазма, могут быть привлекательным источником для открытия биомаркеров; однако из-за большого количества белков и динамического диапазона концентрации белка протеомика плазмы немного сложнее^7. Здесь пептиды, полученные из наиболее распространенных белков, могут подавлять те, которые получены из низкообильного количества белков, даже если соотношение масса/заряд равно^6. Хотя в последние несколько лет были достигнуты успехи в технологиях истощения и фракционирования, получение хорошего охвата по-прежнему остается основным ограничением плазменной протеомики^8,9. Использование тканей для протеомного исследования биологии заболевания является предпочтительным, поскольку образцы тканей наиболее близки к местам заболевания и предлагают высокую физиологическую и патологическую информацию, чтобы обеспечить лучшее понимание биологии заболевания^10,11.

В этой рукописи мы предоставили упрощенный протокол количественной протеомики образцов тканей. Мы использовали буфер, содержащий 8 М мочевины для приготовления тканевого лисата, поскольку этот буфер совместим с исследованиями на основе масс-спектрометрии. Однако обязательно очищают пептиды для удаления солей перед введением их в масс-спектрометр. Одним из важных моментов, который следует помнить, является снижение концентрации мочевины до менее чем 1 М перед добавлением трипсина для переваривания белка, поскольку трипсин проявляет низкую активность при концентрации мочевины 8 М. Мы объяснили два подхода к количественной глобальной протеомике: количественную оценку на основе меток с использованием iTRAQ (изобарические метки для относительной и абсолютной количественной оценки) и количественную оценку без меток (LFQ). Количественная протеомика на основе iTRAQ в основном используется для сравнения нескольких образцов, различающихся по их биологическому состоянию (например, нормальные и больные или обработанные образцы). Подход использует изобарические реагенты для маркировки N-концевые первичные амины^{пептидов 12.} Реагенты iTRAQ содержат одну репортерную группу N-метилпиперазина, группу балансировщика и одну группу эфира N-гидроксисукцинимида, которая реагирует с N-концевыми первичными аминами^{пептидов 13.} Переваренные пептиды из каждого состояния маркируются определенным реагентом iTRAQ. После маркировки реакция останавливается и меченые пептиды из разных условий объединяются в одну трубку. Эта комбинированная смесь образцов анализируется масс-спектрометром для идентификации и количественной оценки. После анализа MS/MS генерируются фрагменты репортерных ионов с низкими молекулярными массами и для количественной оценки белков используются интенсивности ионов-репортеров.

Другой подход, количественная оценка без меток, используется для определения относительного числа белков в сложных образцах без маркировки пептидов стабильными изотопами.

протокол

Это исследование было рассмотрено и одобрено институциональными наблюдательными советами и комитетом по этике Индийского технологического института Бомбея (IITB-IEC/2016/026). Пациенты/участники предоставили свое письменное согласие на участие в этом исследовании.

1. Препарат тканевого лисата

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все следующие шаги на льду, чтобы сохранить протеазы неактивными. Убедитесь, что скальпели и любые используемые трубки стерильны, чтобы избежать перекрестного загрязнения.

1. Возьмите ~ 30 мг ткани в бисяющей трубке, добавьте 200 мкл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) и вихрь его.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании для приготовления лизата были взяты свежезамороженные ткани опухоли головного мозга человека. Протокол может быть использован для любой свежезамороженных тканей с некоторыми изменениями в зависимости от типа тканей (мягкие или твердые ткани) и клеточной сложности тканей.
2. После этого раскрутите трубку, чтобы оседать ткань и аккуратно удалите PBS с помощью пипетки. Выполните еще одну промывку PBS, если в ткани все еще остались следы крови.
3. Добавьте 300 мкл буфера лизиса мочевины (8 М мочевины, 50 мМ Tris pH 8,0, 75 мМ NaCl, 1 мМ MgCl₂₎и коктейль ингибитора протеазы (PIC) в соответствии с протоколом производителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера лизиса должен быть достаточным для измельчения ткани во время процесса обработки ультразвуком и приостановки того, что извлекается. Слишком малый буфер лизиса может привести к неэффективному лизису тканей, в то время как слишком большой буфер лизиса будет разбавлять лизат белка.
4. Поместите трубку на лед и обжаряйте ткань ультразвуком на амплитуде 40% в течение 2,5 мин с импульсными циклами 5 с (ON/OFF соответственно).
5. Добавьте шарики циркония в пробирки и гомогенизируйте ткань с помощью бисерной колотушек в течение 90 с с 5-минутной инкубацией на льду. Повторите этот шаг дважды.
6. Как только ткань будет адекватно гомогенизирована, инкубируют трубку на льду в течение 10 минут.
7. После инкубации центрифугируют образец при 6,018 х г в течение 15 мин при 4°С, чтобы отделить клеточный мусор от супернатанта.
8. Соберите супернатант в свежую маркированную тубу и храните при -80 °C в виде аликвот до дальнейшего использования.

2. Количественная оценка белка и проверка качества тканевых лизатов

1. Количественно оценить концентрацию белка в тканевом лизате с помощью реагента Брэдфорда, как описано в дополнительном файле 1.
2. После количественной оценки белка запустите 10 мкг тканевого лизата на 12% геля SDS-PAGE, чтобы проверить качество лизата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшая переработка должна осуществляться только для лизатов, прощающих проверку качества.

3. Ферментативное переваривание белков

ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы ферментативного пищеварения показаны на рисунке 1а.

1. Для пищеварения возьмите 50 мкг белков и добавьте ddH₂O, чтобы восполнить объем до 20 мкл.
2. Теперь приготовьте 20 мМ трис (2-карбоксиэтил)фосфина (TCEP) из запаса (0,5 М TCEP), добавив 0,8 мкл из запаса в белковый лизат для уменьшения дисульфидных связей в белках и инкубировать образец при 37 °C в течение 60 мин.
3. Готовят 40 мМ йодоацетамида (ИАА) в ddH₂O и добавляют 1,6 мкл к алкилату восстановленных остатков цистеина. Инкубировать в темноте в течение 10 мин при комнатной температуре.
4. Добавьте буфер разбавления, содержащий 25 мМ Tris pH 8,0 и 1 мМ_CaCl2 в соотношении 1:8, чтобы разбавить концентрацию мочевины до менее 1 М в образце. На этом этапе проверьте pH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании трипсина в качестве фермента пищеварения убедитесь, что концентрация мочевины составляет менее 1 М.
5. Для выполнения пищеварения добавляют трипсин в соотношении фермент/субстрат 1:50. Инкубировать пробирки при 37 °C в встряхивающих сухих ваннах в течение 16 ч для ночного пищеварения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент трипсина является высокореактивной протеазой, которая склонна к самоперевариванию. Проявите особую осторожность и быстро направьйте трипсина по льду.
6. После 16 ч инкубации высушите переваренные пептиды в вакуумном концентраторе.

4. Обессоливание переваренные пептиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения обессоливания пептидов используйте наконечники стадии C18.

1. Активируйте наконечник стадии C18, добавив 50 мкл метанола. Центрифугировать наконечник при 1000 х г в течение 2 мин при РТ. Выбросьте фильтрат, собранный на дне трубки. Повторите дважды.
2. Добавьте 50 мкл ацетонитрила в 0,1% муравьиной кислоты, чтобы промыть кончик стадии. Центрифугировать трубку при 1000 х г в течение 2 мин при РТ. Выбросьте фильтрат, собранный в нижней части трубки. Повторите этот шаг дважды.
3. Добавьте 50 мкл 0,1% (v/v) FA, чтобы уравновешивать столбец. Опять же, выполните центрифугирование при 1000 х г в течение 2 мин при РТ и выбросьте фильтрат.
4. Восстановить высушенные переваренные пептиды в 50 мкл 0,1% муравьиной кислоты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков воздуха внутри кончиков ступени при прохождении образца. Наконечники стадии не должны быть полностью высушены на этапе центрифугирования, так как сушка может привести к потере пептида.
5. Добавьте восстановленные пептиды в кончик активированной стадии и пропустите образец через наконечник ступени путем центрифугирования при 1000 х г в течение 2 мин. Повторите этот шаг не менее четырех раз. Хранить проточную обработку при 4 °C.
6. Для промывки образца добавляют 50 мкл 0,1% (v/v) муравьиной кислоты. Повторите этап центрифугирования и выбросьте фильтрат.
7. Для элюирования пептидов добавляют 50 мкл 40% (v/v) ACN в 0,1% муравьиной кислоты (v/v) и пропускают его через кончик стадии путем центрифугирования. Соберите фильтрат в свежую пробирку. Повторите этап с 50% и 60% ACN в 0,1% муравьиной кислоты и соберите фильтрат в ту же свежую пробирку.
8. Высушите обессоленные пептиды, собранные в свежей трубке, с помощью вакуумного концентратора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высушенные обессоленные пептиды готовы к инъекции или могут храниться при -20 °C в течение 6 месяцев. Для длительного хранения (>6 месяцев) хранить пептиды при -80 °C.

5. Количественная оценка обессоливания пептидов

1. Восстановить высушенные обессоленные пептиды в 0,1% FA.
2. Протрите фотометрическую измерительную пластину безворсовой тканью, используя 70% этанола.
3. Используйте 2 мкл 0,1% FA для установки заготовки.
4. Добавьте 2 мкл восстановленных образцов на пластину в репликах.
5. Поместите пластину в спектрофотометр и измерьте поглощение при 205 нм и 280 нм.
6. Рассчитайте молярную абсорбцию (ε) по следующей формуле:
   ε = 27 / [1 - 3,85 * A280 / A205]
   ПРИМЕЧАНИЕ: Моляровая поглощающая способность (ε) является мерой вероятности электронного перехода или того, насколько хорошо вид поглощает конкретную длину волны излучения, которое на него падает. Значение ε должно быть в пределах от 31 мл мг^-1см^-1 до 33 мл мг^-1см^-1. Если значение не попадает в диапазон, это указывает на то, что образцы неправильно усваиваются.
7. Рассчитать концентрацию пептида в мкг/мкл по следующей формуле:
   Концентрация пептида = Чистый OD (205) / 0,051 * ε

6. Количественное обозначение перевариваемых пептидов без меток (LFQ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для количественного определения без меток используйте параметры LC и MS, упомянутые в дополнительном файле 2. Данные о высоком покрытии были получены, когда в масс-спектрометре были запущены три биологические реплики одного и того же типа образца.

1. Настройка жидкостной хроматографии
   1. После количественной оценки обессоленных пептидов берут 2 мкг пептидов во флаконе и составляют объем до 10 мкл с использованием 0,1% FA. Концентрация обессоленных пептидов составит 200 нг/мкл.
   2. Откройте автопроборник жидкостной хроматографической системы (см. Таблицу материалов)и поместите флакон внутрь автосамплера.
   3. Используйте 0,1% (v/v) FA для уравновешителя предварительного столбца и аналитического столбца.
   4. Возьмите 1 мкг обессоленного перевареного пептида из флакона и загрузите его на колонку.
   5. Установите градиент LC в соответствии со сложностью образца. В этом эксперименте градиент LC использовался в течение 120 мин для количественного определения образцов тканей без маркировки.
2. Установка MS: Прежде чем оптимизировать любые протеомные анализы, выполните проверку качества прибора путем мониторинга некоторых пептидов бычих сывороточных альбуминов (BSA) с использованием любого программного обеспечения для пригодности системы и анализа покрытия BSA(рисунок 2A,B). Параметры сбора были установлены в приборе с помощью программного обеспечения для сбора данных MS (см. Таблицу материалов).
   1. Откройте программное обеспечение, дважды щелкните на Instrument Set Up и выберите шаблон из пептидов-ID с параметрами по умолчанию.
   2. Задайте параметры MS с помощью дополнительного файла 2 и сохраните его как новый метод.
   3. Теперь откройте программное обеспечение, чтобы заполнить детали образца; Дважды щелкните параметр Настройка последовательностии введите такие сведения, как тип образца, имя образца, место сохранения файла, файл метода инструмента, объем внедрения и положение образца.
   4. Как только вся информация будет заполнена, выделите строку и запустите Выполнить.

7. Количественное обозначение перевариваемых пептидов на основе этикеток (iTRAQ)

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка на основе этикеток может быть выполнена с использованием различных изобарических этикеток, таких как реагенты iTRAQ или TMT и т.д. Здесь iTRAQ 4-plex использовался для маркировки перевариваемых пептидов из трех образцов тканей. Процедура маркировки iTRAQ 4-plex описана ниже.

1. Маркировка перевариваемых пептидов с использованием реагентов iTRAQ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте используются пептиды из трех образцов тканей. Из каждого образца ткани берется 80 мкг переваренные пептиды в четырех пробирках для маркировки реагентами iTRAQ (114, 115, 116 и 117) (подробные экспериментальные параметры см. в Дополнительном файле 3).
   1. Перед использованием реагента iTRAQ доведите каждый флакон реагента до комнатной температуры (примерно 5 мин). Дайте короткое вращение примерно 30 с, чтобы привести раствор на дно каждого флакона.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что в каждом флаконе должно присутствовать 10-15 мкл раствора.
   2. Для маркировки iTRAQ повторно воссоздайте высушенные пептиды в 20 мкл буфера растворения, предусмотренного в наборе для маркировки iTRAQ.
   3. Восстанавливают этикетки, добавляя 70 мкл этанола из флакона, предусмотренного в наборе, и смешивают раствор в течение 30 с и вращают его в течение 10 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Желательно, чтобы все этапы были выполнены в соответствии с инструкциями производителя.
   4. Добавьте однородно смешанные этикетки iTRAQ (114, 115, 116 и 117) к соответствующим пробиркам, содержащим образцы пептидов, и позвольте реакции маркировки провести.
   5. Смешайте компоненты каждой трубки, вихря трубку в течение 30 с, а затем вращайте трубку в течение 10 с, чтобы вернуть смесь на дно трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте pH раствора с помощью pH-бумаги. pH должен быть больше 8; если нет, добавьте до 10 мкл буфера растворения для регулировки pH.
   6. Инкубировать каждую трубку при комнатной температуре в течение 90 мин. В конце реакции закалите любую избыточную несвязанный этикетку в трубке, добавив воду класса MS.
   7. Инкубировать пробирки при комнатной температуре в течение 30 мин до 1 ч.
   8. Как только инкубация закончится, переложите все меченое содержимое в одну трубку и высушите меченые пептиды в вакуумном концентраторе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичная процедура маркировки может быть выполнена для маркировки TMT.
2. Настройка жидкостной хроматографии
   1. Воссоздайте образцы в 0,1% муравьиной кислоты, откройте автосэмплер нано LC и поместите образцы внутрь автосамплера. Используйте параметры, указанные в дополнительном файле 2 для установки LC.
   2. Установите градиент LC в соответствии со сложностью образца. Градиент LC 180 мин был использован в этом эксперименте для количественного определения на основе этикеток (iTRAQ) образцов тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для менее сложных образцов короткий градиент может эффективно разделять большинство пептидов. Однако, если образец очень сложный, используйте более длинный градиент для лучшего разделения пептидов.
3. Настройка MS для техники iTRAQ
   1. Настройте все параметры MS для количественного определения на основе меток так же, как это используется для количественного определения без меток, за исключением энергии столкновения, которая была установлена на 35% для фрагментации MS / MS в количественном выражении на основе меток.

8. Анализ данных

1. Анализ исходных (MS/MS spectrum) файлов, полученных с помощью LC-масс-спектрометра, с помощью коммерчески доступного аналитического программного обеспечения (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: База данных Human Reference Proteome от Uniprot (UP000005640), содержащая 71 785 последовательностей белков, использовалась для получения идентификаторов белков с помощью поисковых систем Sequest HT и Mascot (v2.6.0). Параметры для количественного определения без меток и квитования на основе меток описаны в дополнительном файле 4.

Результаты

Мы использовали два разных подхода для открытия протеомики: безмечаточный и основанный на этикетках подходы к протеомике. Белковый профиль образцов тканей на SDS-PAGE показал интактные белки и может быть рассмотрен для протеомного анализа(рисунок 2A). Контроль качества при...

Обсуждение

Тканевая протеомика биологических образцов позволяет исследовать новые потенциальные биомаркеры, связанные с различными стадиями прогрессирования заболевания. Это также объясняет механизм передачи сигналов и пути, связанные с прогрессированием заболевания. Описанный протокол кол?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Acetonitrile (MS grade)	Fisher Scientific	A/0620/21
Bovine Serum Albumin	HiMedia	TC194-25G
Calcium chloride	Fischer Scienific	BP510-500
Formic acid (MS grade)	Fisher Scientific	147930250
Iodoacetamide	Sigma	1149-25G
Isopropanol (MS grade)	Fisher Scientific	Q13827
Magnesium Chloride	Fischer Scienific	BP214-500
Methanol (MS grade)	Fisher Scientific	A456-4
MS grade water	Pierce	51140
Phosphate Buffer Saline	HiMedia	TL1006-500ML
Protease inhibitor cocktail	Roche Diagnostics	11873580001
Sodium Chloride	Merck	DF6D661300
TCEP	Sigma	646547
Tris Base	Merck	648310
Trypsin (MS grade)	Pierce	90058
Bradford Reagent	Bio-Rad	5000205
Urea	Merck	MB1D691237
Supplies
Hypersil Gold C18 column	Thermo	25002-102130
Micropipettes	Gilson	F167380
Stage tips	MilliPore	ZTC18M008
Zirconia/Silica beads	BioSpec products	11079110z
Equipment
Bead beater (Homogeniser)	Bertin Minilys	P000673-MLYS0-A
Microplate reader (spectrophotometer)	Thermo	MultiSkan Go
pH meter	Eutech	CyberScan pH 510
Probe Sonicator	Sonics Materials, Inc	VCX 130
Shaking Drybath	Thermo	88880028
Orbitrap Fusion mass spectrometer	Thermo	FSN 10452
Nano LC	Thermo	EASY-nLC1200
Vacuum concentrator	Thermo	Savant ISS 110
Software
Proteome Discoverer	Thrermo	Proteome Discoverer 2.2.0.388