JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

خلايا الكبد الأولية هي أداة قيمة لدراسة استجابة الكبد والتمثيل الغذائي في المختبر. باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، تم تطوير بروتوكول محسن فعال من حيث الوقت والعمالة لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

Abstract

تستخدم خلايا الكبد الأولية على نطاق واسع في أبحاث الكبد في المختبر ، خاصة في دراسات استقلاب الجلوكوز. تم تكييف تقنية أساسية بناء على احتياجات مختلفة ، مثل الوقت والعمالة والتكلفة واستخدام خلايا الكبد الأولية ، مما أدى إلى بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية المختلفة. ومع ذلك ، فإن الخطوات العديدة ومستحضرات الكواشف التي تستغرق وقتا طويلا في عزل خلايا الكبد الأولية هي عيوب رئيسية للكفاءة. بعد مقارنة بروتوكولات مختلفة لإيجابياتها وسلبياتها ، تم الجمع بين مزايا كل منها ، وتم صياغة بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية بسرعة وكفاءة. في غضون 35 دقيقة فقط ، يمكن لهذا البروتوكول أن ينتج الكثير ، إن لم يكن أكثر ، من خلايا الكبد الأولية الصحية مثل البروتوكولات الأخرى. علاوة على ذلك ، أثبتت تجارب استقلاب الجلوكوز التي أجريت باستخدام خلايا الكبد الأولية المعزولة فائدة هذا البروتوكول في دراسات استقلاب الكبد في المختبر . كما قمنا بمراجعة وتحليل أهمية وغرض كل خطوة في هذه الدراسة على نطاق واسع حتى يتمكن الباحثون المستقبليون من تحسين هذا البروتوكول بناء على الاحتياجات.

Introduction

الكبد بمثابة واحد من أهم الأعضاء في الجسم الفقاري بسبب الدور الحيوي الذي يلعبه في العديد من الوظائف الداعمة للحياة مثل هضم الطعام والدورة الدموية وإزالة السموم. استخدام خلايا الكبد الأولية للفئران في ثقافة المختبر تحظى بشعبية متزايدة في دراسات استقلاب الكربوهيدرات وسرطان الكبد. لذلك ، من المهم تطوير طريقة ملائمة لعزل خلايا الكبد الأولية للفأر مع الحفاظ على وظيفتها الفسيولوجية الفطرية. نظرا لوظيفته كمركز لاستقلاب الجلوكوز ، فإن الكبد هو أيضا مركز لإنتاج الجلوكوز وتخزينه1. التجارب مع خلايا الكبد الأولية في المختبر أمر لا بد منه لمعظم دراسات استقلاب الجلوكوز. لذلك ، لسنوات ، طورت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات لعزل خلايا الكبد الأولية للفئران.

الإجراء العام لعزل خلايا الكبد لدى الفئران هو أولا طرد الدم في الكبد بسائل متساوي السمو مثل محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) أو محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) ثم استخدام محلول يحتوي على الكولاجيناز لفصل خلايا الكبد. تشترك هذه البروتوكولات في إجراء عام ولكنها تختلف في الكواشف والخطوات القائمة على الاحتياجات المختلفة. ومع ذلك ، فإن إعداد الكواشف المطلوبة وتنفيذ خطوات العزل يستغرق وقتا. ولدى وضع هذا البروتوكول، وضعت الكفاءة كأولوية، مع جعل جميع الكواشف جاهزة للاستخدام ومتاحة من السوق، وبأقل خطوات ممكنة. الهدف العام من هذا البروتوكول هو توفير طريقة سريعة وفعالة في العمل لعزل خلايا الكبد الأولية عن الفأر ، دون تعريض نقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة وقدرتها على البقاء للخطر.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل لجنة جونز هوبكنز لرعاية الحيوانات واستخدامها. تم استخدام C57BL/6 إناث الفئران (8 أسابيع) في هذه الدراسة.

1. التحضير:

  1. امزج ويليام E Medium (ملحق GlutaMAX) مع محلول FBS بنسبة 10٪ ومحلول مضاد للفطريات بنسبة 1٪ لجعل الثقافة متوسطة.
  2. قم بتصفية 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل (على سبيل المثال ، Liver Digest Medium) من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرومتر لإزالة حطام الجسيمات.
  3. دافئ 50 مل من H 2 O مزدوج المقطر (ddH2O) ، و 35 ملمن وسط التروية (على سبيل المثال ، وسط تروية الكبد) (أو 50 مل في المرة الأولى باستخدام هذا البروتوكول) ، و 25 مل من وسط الكولاجيناز المصفى في حمام مائي 45 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  4. داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، امزج 2 مل من 10x HBSS و 18 مل من Percoll في أنبوب 50 مل لصنع 20 مل 1x Percoll-HBSS والحفاظ على الجليد أو 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ ب 1x Percoll-HBSS عند 4 درجات مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
  5. داخل غطاء زراعة الأنسجة المعقمة، صب 30 مل من وسط الغسيل (على سبيل المثال، وسط غسيل خلايا الكبد) في طبق بتري نظيف، واحتفظ به على الثلج.
  6. اغمر أنبوب الضخ في ماء حمام مائي 45 درجة مئوية. تكون النتائج أكثر موثوقية إذا كانت درجة حرارة الغرفة عند 25 درجة مئوية.
  7. تحضير 2 مل من مخدر 1x عن طريق خلط 225 ميكرولتر من الكيتامين HCL ، 93.75 ميكرولتر من Xylazine ، و 1681 ميكرولتر من 1x PBS.
  8. تخدير فأر واحد باستخدام طريقة معتمدة. هنا تم حقن الفأر داخل الصفاق مع 150 ميكرولتر من 1x التخدير. قم بإجراء اختبارات فقدان ردود الفعل مثل رد الفعل على قرص إصبع القدم لضمان التخدير الكامل.
  9. قم بتثبيت الماوس على ظهره على وسادة التشريح بواسطة أربعة أطراف ، إما عن طريق تثبيت أو استخدام شريط مقاوم للماء أو طرق أخرى معتمدة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات في المؤسسة (أو ما يعادلها).
  10. تحضير ملقط ومقص معقم للتشريح. لتجنب التلوث المحتمل ، قم بإجراء جميع الخطوات داخل غطاء محرك السيارة المعقم.

2. الإجراء:

  1. باستخدام مضخة تمعجية ، ابدأ في ضخ ddH2O المحموم بسرعة 4 مل / دقيقة لمدة 5 دقائق. قم بتغيير أنبوب الضخ من الماء إلى وسط تروية مسخن.
  2. قم بتطهير بطن الفأر المخدر بنسبة 70٪ EtOH وقم بفتحه بمقص لفضح الكبد والوريد البابي والوريد الأجوف السفلي (IVC).
  3. أوقف المضخة التمعجية. أدخل قسطرة 24 جم (على سبيل المثال، قسطرة وريدية مغلقة، 24 جم، 0.75 بوصة) في IVC. ابدأ في الضخ وقطع الوريد البابي مفتوحا.
  4. استمر في الضخ حتى يصبح السائل الذي تم تنظيفه صافيا (حوالي 3-5 دقائق). اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد. احرص على عدم السماح لفقاعات الهواء بالدخول إلى IVC.
    ملاحظة: هذه الخطوة هي طرد أكبر قدر ممكن من الدم من الكبد.
  5. قم بتغيير أنبوب الضخ من وسط التروية إلى وسط الكولاجيناز المنفصل. استمر في الضخ حتى يتم استنفاد كل 25 مل من وسط الكولاجيناز المنفصل أثناء القيام بالخطوة 2.6.
  6. اضغط على الوريد البابي كل دقيقة للسماح للسائل بالوصول إلى كل ركن من أركان الكبد.
    ملاحظة: في هذه المرحلة ، يكون الفقدان الكامل للدم قاتلا للماوس. يمكن تأكيد وفاة الفأر من خلال نقص ضربات القلب بعد التجربة. تخلص من الذبيحة وفقا لسياسات المنشأة.
  7. اعزل الكبد بالكامل بدون مرارة إلى وسط الغسيل 30 مل في طبق بتري على الثلج.
  8. قم بتمزيقه إلى قطع باستخدام ملقط لإطلاق خلايا الكبد الأولية في محلول. هذه الخطوة من شأنها أن تحول وسط الغسيل إلى محلول غائم مليء بخلايا الكبد الأولية التي تم إطلاقها وقطع الكبد الصغيرة.
  9. قم بتصفية المحلول الغائم في الخطوة 2.8 من خلال مصفاة خلية 70 ميكرومتر إلى 20 مل 1x Percoll-HBSS في أنبوب 50 مل على الجليد. اخلط عن طريق عكس الأنبوب 20 مرة.
  10. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  11. داخل غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة ، شفط supernatant. اغسل الكريات ببرودة 30 مل من وسط الغسيل.
  12. جهاز طرد مركزي عند 50 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  13. قم بإزالة السوبرناتانت وإعادة تعليق الكريات في 25 مل من وسط المزرعة (أو الأحجام الأخرى المناسبة) داخل غطاء زراعة الأنسجة.
  14. عد رقم الخلية ولوحة الخلايا على لوحات الثقافة المطلوبة وفقا للتصميم التجريبي.
    ملاحظة: عادة ما تكون خلايا الكبد الأولية المعزولة بشكل صحيح من فأر واحد عمره 8 أسابيع كافية ليتم طلاؤها على أربعة ألواح من 6 آبار أو أربع لوحات من 12 بئرا.

النتائج

من أجل اختبار الكفاءة ، تم إجراء بروتوكول عزل خلايا الكبد الأولية الحالية على الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8 أسابيع. تم اختبار تعلق ونقاء خلايا الكبد الأولية المعزولة. يستخدم عزل خلايا الكبد الأولية لمجموعة واسعة من التجارب على فسيولوجيا الكبد ، مثل تأثيرات الأدوية الكبدية واستقلاب الج?...

Discussion

تم تطوير العديد من بروتوكولات عزل خلايا الكبد الأولية. كما تم الحفاظ عليها على النحو الأمثل وتكييفها بناء على الاحتياجات المختلفة (الجدول 1). تتكون بروتوكولات العزل عموما من جزأين: التروية (بما في ذلك هضم الإنزيم) والتنقية.

يمكن إجراء التروية مع الكبد بأكمله

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (منحة 5R01HD095512-02 إلى S.W.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x PBSGibco10010023
10x HBSSGibco14065-056
12-well PlateFALCON353043Coating not required
6-well PlateFALCON353046Coating not required
anti-AKTCell Signaling2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), StabilizedSigma-AldrichA5955
anti-FOXO1Cell Signaling97635S
anti-GAPDHCell Signaling2118S
anti-p-AKT (S473)Cell Signaling9271L
anti-PEPCKSanta CruzSC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)Cell Signaling84192S
Cell Strainer, 70 µmCELLTREAT229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 INBecton Dickinson383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol redThermoFisher ScientificA1443001
EnzyChrom Glucose Assay KitBioAssay SystemsEBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)HycloneSH30071.03
ForskolinMilliporeSigmaF3917-10MG
GlucagonSigma-AldrichG2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary AntibodyLI-COR926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary AntibodyLI-COR926-32211
GraphPad Prism 8GraphPad SoftwareNA
Hepatocyte Wash MediumGibco17704-024
IBMXCell Signaling13630S
InsulinLillyNDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)Hospira IncNDC 0409-2051-05
L-GlutamineGibco25030081
Liver Digest MediumGibco17703-034Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion MediumGibco17701-038
Pen StrepGibco15140122
PercollGE Healthcare17-0891-01
Peristaltic PumpGilsonMinipuls 2Capable of pumping at 4 mL/min
Petri DishFisherbrand08-757-12
Refrigerated CentrifugeSorvallLegend RTCapable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-LactateSigma-AldrichL7022
Sodium PyruvateGibco11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameterCELLTREAT229745
Syringe, 0.5 mLBecton Dickinson329461
Syringe, 60 mLBecton Dickinson309653
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Tube, 15 mLCorning430052
Tube, 50 mLCorning430290
Water Bath TankCorningCLS6783Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)Gibco32551020
Xylozine (100 mg/mL)Vetone Anased LANDC13985-704-10

References

  1. Han, H. S., Kang, G., Kim, J. S., Choi, B. H., Koo, S. H. Regulation of glucose metabolism from a liver-centric perspective. Experimental and Molecular Medicine. 48, 218 (2016).
  2. Severgnini, M., et al. A rapid two-step method for isolation of functional primary mouse hepatocytes: cell characterization and asialoglycoprotein receptor based assay development. Cytotechnology. 64 (2), 187-195 (2012).
  3. Guidotti, J. E., et al. Liver cell polyploidization: a pivotal role for binuclear hepatocytes. Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19095-19101 (2003).
  4. Morales-Navarrete, H., et al. A versatile pipeline for the multi-scale digital reconstruction and quantitative analysis of 3D tissue architecture. Elife. 4, 11214 (2015).
  5. Bruening, J., et al. Hepatitis C virus enters liver cells using the CD81 receptor complex proteins calpain-5 and CBLB. PLoS Pathogens. 14 (7), 1007111 (2018).
  6. Silvie, O., et al. Hepatocyte CD81 is required for Plasmodium falciparum and Plasmodium yoelii sporozoite infectivity. Nature Medicine. 9 (1), 93-96 (2003).
  7. Crispe, I. N. Hepatocytes as immunological agents. Journal of Immunology. 196 (1), 17-21 (2016).
  8. Liu, N. C., et al. Loss of TR4 orphan nuclear receptor reduces phosphoenolpyruvate carboxykinase-mediated gluconeogenesis. Diabetes. 56 (12), 2901-2909 (2007).
  9. Wang, Z., et al. Gonadotrope androgen receptor mediates pituitary responsiveness to hormones and androgen-induced subfertility. JCI Insight. 5 (17), 127817 (2019).
  10. Santos, S. D., et al. CSF transthyretin neuroprotection in a mouse model of brain ischemia. Journal of Neurochemistry. 115 (6), 1434-1444 (2010).
  11. Pinhu, L., et al. Overexpression of Fas and FasL is associated with infectious complications and severity of experimental severe acute pancreatitis by promoting apoptosis of lymphocytes. Inflammation. 37 (4), 1202-1212 (2014).
  12. Mi, Y., Lin, A., Fiete, D., Steirer, L., Baenziger, J. U. Modulation of mannose and asialoglycoprotein receptor expression determines glycoprotein hormone half-life at critical points in the reproductive cycle. Journal of Biological Chemistry. 289 (17), 12157-12167 (2014).
  13. Tanowitz, M., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 mediates productive uptake of N-acetylgalactosamine-conjugated and unconjugated phosphorothioate antisense oligonucleotides into liver hepatocytes. Nucleic Acids Research. 45 (21), 12388-12400 (2017).
  14. Manczak, M., et al. Neutralization of granulocyte macrophage colony-stimulating factor decreases amyloid beta 1-42 and suppresses microglial activity in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Human Molecular Genetics. 18 (20), 3876-3893 (2009).
  15. Zhang, Y., et al. JAK1-dependent transphosphorylation of JAK2 limits the antifibrotic effects of selective JAK2 inhibitors on long-term treatment. Annals of the Rheumatic Diseases. 76 (8), 1467-1475 (2017).
  16. Shih, S. C., et al. Molecular profiling of angiogenesis markers. American Journal of Pathology. 161 (1), 35-41 (2002).
  17. Liu, G., et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15819-15824 (2009).
  18. Ding, Q., et al. Mice expressing minimally humanized CD81 and occludin genes support Hepatitis C virus uptake in vivo. Journal of Virology. 91 (4), 01799 (2017).
  19. Renshaw, M., et al. Cutting edge: impaired Toll-like receptor expression and function in aging. Journal of Immunology. 169 (9), 4697-4701 (2002).
  20. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  21. Salem, E. S. B., et al. Isolation of primary mouse hepatocytes for nascent protein synthesis analysis by non-radioactive l-azidohomoalanine labeling method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (140), e58323 (2018).
  22. Cabral, F., et al. Purification of Hepatocytes and Sinusoidal Endothelial Cells from Mouse Liver Perfusion. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56993 (2018).
  23. Korelova, K., Jirouskova, M., Sarnova, L., Gregor, M. Isolation and 3D collagen sandwich culture of primary mouse hepatocytes to study the role of cytoskeleton in bile canalicular formation in vitro. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (154), e60507 (2019).
  24. Goncalves, L. A., Vigario, A. M., Penha-Goncalves, C. Improved isolation of murine hepatocytes for in vitro malaria liver stage studies. Malar Journal. 6, 169 (2007).
  25. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplant. 16 (8), 859-865 (2007).
  26. . Hepatocyte media, Thermofisher Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/Hepatocyte_Media_UG.pdf (2021)
  27. Sia, D., Villanueva, A., Friedman, S. L., Llovet, J. M. Liver cancer cell of origin, molecular class, and effects on patient prognosis. Gastroenterology. 152 (4), 745-761 (2017).
  28. Freitas-Lopes, M. A., Mafra, K., David, B. A., Carvalho-Gontijo, R., Menezes, G. B. Differential location and distribution of hepatic immune cells. Cells. 6 (4), 48 (2017).
  29. Schachtrup, C., Le Moan, N., Passino, M. A., Akassoglou, K. Hepatic stellate cells and astrocytes: Stars of scar formation and tissue repair. Cell Cycle. 10 (11), 1764-1771 (2011).
  30. Geerts, A. History, heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Seminars in Liver Disease. 21 (3), 311-335 (2001).
  31. Poisson, J., et al. Liver sinusoidal endothelial cells: Physiology and role in liver diseases. Journal of Hepatology. 66 (1), 212-227 (2017).
  32. Peter, M. E., et al. The CD95 receptor: apoptosis revisited. Cell. 129 (3), 447-450 (2007).
  33. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  34. Willoughby, J. L. S., et al. Evaluation of GalNAc-siRNA conjugate activity in pre-clinical animal models with reduced asialoglycoprotein receptor expression. Molecular Therapy. 26 (1), 105-114 (2018).
  35. Hutchins, N. A., Chung, C. S., Borgerding, J. N., Ayala, C. A., Ayala, A. Kupffer cells protect liver sinusoidal endothelial cells from Fas-dependent apoptosis in sepsis by down-regulating gp130. American Journal of Pathology. 182 (3), 742-754 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved