Um protocolo aprimorado de tempo e trabalho-eficiente para o isolamento primário do hepatocito do rato

Resumo

Hepatócitos primários são uma ferramenta valiosa para estudar a resposta hepática e o metabolismo in vitro. Utilizando reagentes disponíveis comercialmente, foi desenvolvido um protocolo aprimorado de tempo e trabalho eficiente para o isolamento primário do hepatócito do rato.

Resumo

Hepatócitos primários são usados extensivamente em pesquisas in vitro hepáticas, especialmente em estudos de metabolismo de glicose. Uma técnica base foi adaptada com base em diferentes necessidades, como tempo, trabalho, custo e uso primário de hepatócitos, resultando em vários protocolos primários de isolamento hepatócito. No entanto, os numerosos passos e os preparativos demorados de reagentes no isolamento primário do hepatocitado são grandes desvantagens para a eficiência. Depois de comparar diferentes protocolos para seus prós e contras, as vantagens de cada um foram combinadas, e um protocolo rápido e eficiente de isolamento hepatócito primário foi formulado. Dentro de apenas ~35 min, este protocolo poderia produzir tanto, se não mais, hepatócitos primários saudáveis como outros protocolos. Além disso, os experimentos de metabolismo de glicose realizados usando os hepatócitos primários isolados validaram a utilidade deste protocolo em estudos in vitro de metabolismo hepático. Também revisamos e analisamos extensivamente a importância e o propósito de cada etapa deste estudo para que os futuros pesquisadores possam otimizar ainda mais esse protocolo com base nas necessidades.

Introdução

O fígado serve como um dos órgãos mais importantes no corpo de vertebrados devido ao papel vital que desempenha em inúmeras funções de suporte à vida, como digestão alimentar, circulação sanguínea e desintoxicação. O uso de hepatócitos primários de camundongos na cultura vitro é cada vez mais popular em estudos de metabolismo de carboidratos e carcinoma hepático. Por isso, é importante desenvolver um método conveniente para o isolamento primário do hepatocito do camundongo, mantendo sua função fisiológica inata. Devido à sua função como um centro do metabolismo da glicose, o fígado também é central para a produção e armazenamento^{de glicose 1}. Experimentos com hepatócitos primários in vitro são imperdíveis para a maioria dos estudos de metabolismo de glicose. Portanto, durante anos, vários grupos de pesquisa desenvolveram protocolos para o isolamento primário do hepatocite do rato.

O procedimento geral do isolamento do hepatocito do camundongo é primeiro liberar sangue no fígado com um líquido isotomótico, como salina tamponada com fosfato (PBS) ou Solução de Sal Balanceado (HBSS) da Hanks e, em seguida, usar solução contendo colagem para dissociar hepatócitos. Esses protocolos compartilham um procedimento geral, mas diferem em reagentes e passos baseados em diferentes necessidades. No entanto, preparar reagentes necessários e realizar passos de isolamento levam tempo. No desenvolvimento do presente protocolo, a eficiência foi definida como prioridade, com todos os reagentes prontos para uso e disponíveis no mercado, e o menor número possível de etapas. O objetivo geral deste protocolo é fornecer um método rápido e eficiente para isolar hepatócitos primários do rato, sem comprometer a pureza e viabilidade primária isolada.

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais johns Hopkins. Neste estudo, foram utilizados camundongos C57BL/6 fêmeas (8 semanas de idade).

1. Preparação:

1. Misture o William's E Medium (GlutaMAX Supplement) com 10% de FBS e 1% solução antibiótico-antimíctica para tornar a cultura média.
2. Filtrar 25 mL de meio de colagenase-dispase (por exemplo, Liver Digest Medium) através de um filtro de seringa de 0,45 μm para remover detritos de partículas.
3. Quente 50 mL de H₂O destilado duplo (ddH₂O), 35 mL de médio de perfusão (por exemplo, Médio de Perfusão de Fígado) (ou 50 mL pela primeira vez usando este protocolo), e 25 mL de meio de colagenase-dispase filtrado em um banho de água de 45 °C por 30 min.
4. Dentro de uma capa de cultura tecidual estéril, misture 2 mL de HBSS 10x e 18 mL de Percoll em um tubo de 50 mL para fazer 20 mL 1x Percoll-HBSS e manter no gelo ou 4 °C.
   NOTA: 1x Percoll-HBSS pode ser mantido a 4 °C por pelo menos 6 meses.
5. Dentro de uma capa de cultura de tecido estéril, despeje 30 mL de meio de lavagem (por exemplo, Hepatocyte Wash Medium) em uma placa de Petri limpa, e mantenha no gelo.
6. Submerse o tubo de bombeamento na água de um banho de água de 45 °C. Os resultados são mais confiáveis se a temperatura ambiente estiver em 25 °C.
7. Prepare 2 mL de anestésicos 1x misturando 225 μL de Cetamina HCL, 93,75 μL de Xilazina e 1681 μL de 1x PBS.
8. Anestesiar um rato usando um método aprovado. Aqui o rato foi injetado intraperitonealmente com 150 μL de anestésicos 1x. Realize os testes para perda de reflexos, como reação ao beliscão do dedo do dedo para garantir anestesia total.
9. Fixar o mouse de costas na almofada de dissecção por quatro membros, fixando ou usando fita adesiva à prova d'água ou outros métodos aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da instituição (ou equivalentes).
10. Prepare fórceps esterilizados e tesouras para dissecção. Para evitar uma possível contaminação, conduza todas as etapas dentro de um capô estéril.

2. Procedimento:

1. Usando uma bomba peristáltica, comece a bombear ddH₂O aquecido a uma velocidade de 4 mL/min por 5 min. Mude o tubo de bombeamento da água para um meio de perfusão aquecido.
2. Desinfete o abdômen do camundongo anestesiado com 70% de EtOH e corte aberto com uma tesoura para expor o fígado, a veia portal e a veia inferior (IVC).
3. Pare a bomba peristáltica. Insira um cateter de 24 G (por exemplo, Cateter IV Fechado, 24 G, 0,75 IN) no IVC. Comece a bombear e corte a veia do portal aberta.
4. Continue bombeando até que o líquido liberado esteja limpo (em torno de 3-5 min). Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado. Tenha cuidado para não deixar bolhas de ar entrarem no IVC.
   NOTA: Este passo é para remover o máximo de sangue possível do fígado.
5. Altere o tubo de bombeamento do meio de perfusão para o meio de colagenase-dispase. Continue bombeando até que todos os 25 mL do meio de colagenase-dispase sejam esgotados enquanto fazem a etapa 2.6.
6. Pressione a veia do portal a cada minuto para deixar o líquido alcançar cada canto do fígado.
   NOTA: Nesta fase, a perda completa de sangue é fatal para o rato. A morte do rato pode ser confirmada por falta de batimentos cardíacos após o experimento. Descarte a carcaça de acordo com as políticas de instalação.
7. Isole todo o fígado sem vesícula biliar ao meio de lavagem de 30 mL na placa de Petri no gelo.
8. Rasgá-lo em pedaços com fórceps para liberar hepatócitos primários em solução. Esta etapa transformaria o meio de lavagem em uma solução nublada cheia de hepatócitos primários liberados e pequenos pedaços de fígado.
9. Filtre a solução nublada na etapa 2.8 através de um coador de células de 70 μm no Percoll-HBSS de 20 mL em um tubo de 50 mL no gelo. Misture invertendo o tubo 20 vezes.
10. Centrifugar a 300 x g por 10 min a 4 °C.
11. Dentro da capa da cultura tecidual, aspire o supernante. Lave a pelota com 30 mL frio de meio de lavagem.
12. Centrifugar a 50 x g por 5 min a 4 °C.
13. Remova o supernatante e resuspense a pelota em 25 mL do meio de cultura (ou outros volumes apropriados) dentro da capa da cultura tecidual.
14. Conte o número da célula e emplaque as células nas placas de cultura desejadas de acordo com o projeto experimental.
    NOTA: Hepatócitos primários devidamente isolados de um rato de 8 semanas de idade são geralmente suficientes para serem banhados em quatro placas de 6 poços ou quatro placas de 12 poços.

Resultados

Para testar a eficiência, foi realizado o presente protocolo primário de isolamento do hepatocito em camundongos C57BL/6 femininos de 8 semanas. O apego e a pureza dos hepatócitos primários isolados foram testados. O isolamento primário do hepatócito é usado para uma grande variedade de experimentos em fisiologia hepática, como efeitos hepáticos de drogas e metabolismo de glicose, atividade biomarcadora farmacêutica², sensibilidade à insulina e produção de glicose. Portanto, as ativid...

Discussão

Vários protocolos primários de isolamento de hepatocitas foram desenvolvidos. Eles também foram mantidos otimizados e adaptados com base em diferentes necessidades (Tabela 1). Os protocolos de isolamento são geralmente compostos de duas partes: perfusão (incluindo digestão enzimápica) e purificação.

A perfusão pode ser realizada com todo o fígado in vivo 2,20,21,22,23 ou com lóbulos hepáticos diss...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10