마우스 원발성 간세포 분리를 위한 개선된 시간 및 노동력 효율적인 프로토콜

요약

원발성 간세포는 시험관 내에서 간 반응과 신진 대사를 연구하는 데 유용한 도구입니다. 상업적으로 이용가능한 시약을 이용하여, 마우스 원발성 간세포 단리를 위한 개선된 시간- 및 노동-효율적인 프로토콜이 개발되었다.

초록

원발성 간세포는 시험관내 간 연구, 특히 포도당 대사 연구에서 광범위하게 사용된다. 기본 기술은 시간, 노동, 비용 및 원발성 간세포 사용과 같은 다양한 요구에 따라 적용되어 다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜을 초래합니다. 그러나, 원발성 간세포 단리에서의 수많은 단계 및 시간 소모적인 시약 제제는 효율성을 위한 주요한 단점이다. 장단점에 대해 서로 다른 프로토콜을 비교 한 후 각각의 장점을 결합하고 신속하고 효율적인 원발성 간세포 분리 프로토콜을 공식화했습니다. 불과 ~ 35 분 이내에이 프로토콜은 다른 프로토콜만큼 건강한 원발성 간세포를 산출 할 수 있습니다. 또한, 분리된 원발성 간세포를 사용하여 수행된 글루코스 대사 실험은 시험관내 간 대사 연구에서 이러한 프로토콜의 유용성을 검증하였다. 우리는 또한이 연구의 각 단계의 중요성과 목적을 광범위하게 검토하고 분석하여 미래의 연구자가 필요에 따라이 프로토콜을 더욱 최적화 할 수 있도록했습니다.

서문

간은 음식 소화, 혈액 순환 및 해독과 같은 수많은 생명 유지 기능에서 중요한 역할을하기 때문에 척추 동물의 신체에서 가장 중요한 기관 중 하나입니다. 시험관내 배양에서 마우스 원발성 간세포의 사용은 탄수화물 대사 및 간 암종에 대한 연구에서 점점 더 대중화되고 있다. 따라서, 마우스의 선천적 생리적 기능을 유지하면서 원발성 간세포를 분리하기 위한 편리한 방법을 개발하는 것이 중요하다. 포도당 대사의 허브로서의 기능으로 인해 간은 포도당 생산 및 저장의 중심이기도합니다¹. 시험관 내에서 원발성 간세포를 이용한 실험은 대부분의 포도당 대사 연구에 필수적이다. 따라서 수년 동안 다양한 연구 그룹이 마우스 원발성 간세포 분리를위한 프로토콜을 개발했습니다.

마우스 간세포 분리의 일반적인 절차는 먼저 인산염 완충 식염수 (PBS) 또는 행크스 균형 소금 용액 (HBSS)과 같은 이소형 액체로 간에서 혈액을 씻어 낸 다음 콜라게나제 함유 용액을 사용하여 간세포를 해리시키는 것입니다. 이러한 프로토콜은 일반적인 절차를 공유하지만 필요에 따라 시약과 단계가 다릅니다. 그러나 필요한 시약을 준비하고 분리 단계를 수행하는 데는 시간이 걸립니다. 본 프로토콜을 개발할 때, 효율성은 우선 순위로 설정되었으며, 모든 시약은 즉시 사용 가능하고 시장에서 구입할 수 있으며 가능한 한 적은 단계였습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 단리된 원발성 간세포의 순도 및 생존력을 위태롭게 하지 않으면서 마우스로부터 원발성 간세포를 분리하는 빠르고 효율적인 방법을 제공하는 것이다.

프로토콜

모든 절차는 존스 홉킨스 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. C57BL/6 암컷 마우스(8주령)를 본 연구에 사용하였다.

1. 준비:

1. 윌리엄의 E 배지 (GlutaMAX 보충제)를 10 % FBS 및 1 % 항생제 - 항균제 용액과 혼합하여 배양 배지를 만듭니다.
2. 25 mL의 콜라게나제-디스파제 배지 (예를 들어, 간 소화 배지)를 0.45 μm 시린지 필터를 통해 여과하여 입자 파편을 제거하였다.
3. 50 mL의 이중 증류 H2O (_ddH2O), 35 mL의 관류 배지 (예를 들어, 간 관류 배지) (또는 이 프로토콜을 사용하여 처음으로 50 mL), 및 25 mL의 여과된 콜라게나제-디스파제 배지를 45°C 수조에서 30분 동안 가온하였다.
4. 멸균 조직 배양 후드 내에서 50mL 튜브에 10x HBSS 2mL와 Percoll 18mL를 섞어 20mL의 1x Percoll-HBSS를 만들고 얼음 또는 4°C에 보관합니다.
   참고: 1x Percoll-HBSS는 최소 6개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다.
5. 멸균 조직 배양 후드 내에, 30 mL의 세척 배지 (예를 들어, 간세포 세척 배지)를 깨끗한 페트리 접시에 붓고, 얼음 위에 보관한다.
6. 펌핑 튜브를 45°C 수조의 물에 잠급니다. 결과는 실온이 25°C인 경우 가장 신뢰할 수 있습니다.
7. 225 μL의 케타민 HCL, 93.75 μL의 자일라진, 및 1681 μL의 1x PBS를 혼합하여 2 mL의 1x 마취제를 제조하였다.
8. 승인 된 방법을 사용하여 한 마리의 마우스를 마취하십시오. 여기에 마우스를 150 μL의 1x 마취제를 복강내 주사하였다. 완전한 마취를 보장하기 위해 발가락 꼬집음에 대한 반응과 같은 반사 신경의 손실에 대한 테스트를 수행하십시오.
9. 마우스를 네 팔다리로 해부 패드에 고정하거나 방수 테이프 또는 기관의 동물 관리 및 사용 위원회 (또는 이에 상응하는 것)가 승인 한 기타 방법을 사용하여 고정하십시오.
10. 해부를 위해 멸균 된 포셉과 가위를 준비하십시오. 가능한 오염을 피하려면 멸균 후드 내의 모든 단계를 수행하십시오.

2. 절차:

1. 연동 펌프를 사용하여 예열 된_ddH2O를 5 분 동안 4 mL / min의 속도로 펌핑하십시오. 펌핑 튜브를 물에서 예열 된 관류 매체로 바꿉니다.
2. 마취 된 마우스의 복부를 70 % EtOH로 소독하고 가위로 잘라 간, 문맥 정맥 및 열등한 정맥 카바 (IVC)를 노출시킵니다.
3. 연동 펌프를 정지하십시오. 24 G 카테터 (예를 들어, 폐쇄 IV 카테터, 24 G, 0.75 IN)를 IVC에 삽입하십시오. 펌핑을 시작하고 포털 정맥을 열어보십시오.
4. 플러시 된 액체가 맑을 때까지 펌핑을 계속하십시오 (약 3-5 분). 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오. 기포가 IVC에 들어 가지 않도록주의하십시오.
   참고 :이 단계는 간에서 가능한 한 많은 혈액을 씻어내는 것입니다.
5. 펌핑 튜브를 관류 배지에서 콜라게나제-디스파제 배지로 변경한다. 단계 2.6을 수행하는 동안 콜라게나제-디스파아제 배지의 모든 25 mL가 고갈될 때까지 펌핑을 계속한다.
6. 매분마다 포털 정맥을 눌러 액체가 간 구석에 도달하도록하십시오.
   참고 :이 단계에서 혈액의 완전한 손실은 마우스에 치명적입니다. 마우스의 죽음은 실험 후 심장 박동의 부족으로 확인할 수 있습니다. 시설 정책에 따라 시체를 처분하십시오.
7. 담낭 없이 간 전체를 얼음 위의 페트리 접시에 담낭 없이 30 mL 세척 배지로 분리한다.
8. 포셉으로 조각으로 찢어 원발성 간세포를 용액으로 방출하십시오. 이 단계는 세척 배지를 방출 된 원발성 간세포와 작은 간 조각으로 가득 찬 흐린 용액으로 바꿀 것입니다.
9. 단계 2.8에서 흐린 용액을 70 μm 세포 스트레이너를 통해 여과하여 얼음 위에 50 mL 튜브에 20 mL 1x Percoll-HBSS를 넣는다. 튜브를 20 번 뒤집어 혼합하십시오.
10. 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
11. 조직 배양 후드 내에서, 상청액을 흡인한다. 펠렛을 차가운 세척 배지 30 mL로 세척하십시오.
12. 4°C에서 5분 동안 50 x g 에서 원심분리한다.
13. 상청액을 제거하고 펠렛을 조직 배양 후드 내의 25 mL의 배양 배지 (또는 적절한 다른 부피)에 재현탁시켰다.
14. 세포 번호를 계수하고 실험 설계에 따라 원하는 배양 플레이트 상에 세포를 플레이트한다.
    참고: 8주령 마우스 한 마리에서 적절하게 분리한 원발성 간세포는 보통 4개의 6웰 플레이트 또는 4개의 12웰 플레이트에 플레이팅하기에 충분합니다.

결과

효율을 시험하기 위하여, 본원의 일차 간세포 분리 프로토콜이 8주령 암컷 C57BL/6 마우스에 대해 수행되었다. 분리된 원발성 간세포의 부착 및 순도를 시험하였다. 원발성 간세포 분리는 간 약물 효과 및 글루코스 대사, 제약 바이오마커 활성², 인슐린 감수성 및 글루코스 생산과 같은 간 생리학에 대한 매우 다양한 실험에 사용된다. 따라서, 이 프로토콜로 단리된 원발성 간세포의...

토론

다양한 원발성 간세포 분리 프로토콜이 개발되었다. 또한 다양한 요구에 따라 최적화되고 조정되었습니다 (표 1). 분리 프로토콜은 일반적으로 관류 (효소 소화 포함)와 정제의 두 부분으로 구성됩니다.

관류는 생체내 전체 간(2,20,21,22,23) 또는 해부된 간엽^(2...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10