Un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e fatica per l'isolamento degli epatociti primari del topo

Riepilogo

Gli epatociti primari sono uno strumento prezioso per studiare la risposta epatica e il metabolismo in vitro. Utilizzando reagenti disponibili in commercio, è stato sviluppato un protocollo migliorato efficiente in termini di tempo e lavoro per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

Abstract

Gli epatociti primari sono ampiamente utilizzati nella ricerca in vitro sul fegato, specialmente negli studi sul metabolismo del glucosio. Una tecnica di base è stata adattata in base a diverse esigenze, come tempo, manodopera, costi e utilizzo di epatociti primari, con conseguente vari protocolli di isolamento degli epatociti primari. Tuttavia, i numerosi passaggi e le lunghe preparazioni di reagenti nell'isolamento degli epatociti primari sono i principali svantaggi per l'efficienza. Dopo aver confrontato diversi protocolli per i loro pro e contro, i vantaggi di ciascuno sono stati combinati ed è stato formulato un protocollo di isolamento degli epatociti primari rapido ed efficiente. Entro soli ~ 35 minuti, questo protocollo potrebbe produrre tanto, se non di più, epatociti primari sani come altri protocolli. Inoltre, gli esperimenti sul metabolismo del glucosio eseguiti utilizzando gli epatociti primari isolati hanno convalidato l'utilità di questo protocollo negli studi in vitro sul metabolismo epatico. Abbiamo anche ampiamente esaminato e analizzato il significato e lo scopo di ogni fase di questo studio in modo che i futuri ricercatori possano ottimizzare ulteriormente questo protocollo in base alle esigenze.

Introduzione

Il fegato funge da uno degli organi più importanti nel corpo dei vertebrati a causa del ruolo vitale che svolge in numerose funzioni di supporto vitale come la digestione del cibo, la circolazione sanguigna e la disintossicazione. L'uso di epatociti primari di topo in coltura in vitro è sempre più popolare negli studi sul metabolismo dei carboidrati e sul carcinoma epatico. Pertanto, è importante sviluppare un metodo conveniente per l'isolamento degli epatociti primari del topo mantenendo la sua funzione fisiologica innata. Grazie alla sua funzione di hub del metabolismo del glucosio, il fegato è anche centrale per la produzione e lo stoccaggio del glucosio¹. Gli esperimenti con epatociti primari in vitro sono un must per la maggior parte degli studi sul metabolismo del glucosio. Pertanto, per anni, vari gruppi di ricerca hanno sviluppato protocolli per l'isolamento degli epatociti primari del topo.

La procedura generale di isolamento degli epatociti di topo consiste nel scovare prima il sangue nel fegato con un liquido isosmotico come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e quindi utilizzare la soluzione contenente collagenasi per dissociare gli epatociti. Questi protocolli condividono una procedura generale, ma differiscono in reagenti e passaggi in base alle diverse esigenze. Tuttavia, la preparazione dei reagenti richiesti e l'esecuzione delle fasi di isolamento richiedono tempo. Nello sviluppo del presente protocollo, l'efficienza è stata fissata come priorità, con tutti i reagenti pronti all'uso e disponibili sul mercato e il minor numero possibile di passaggi. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire un metodo rapido ed efficiente per isolare gli epatociti primari dal topo, senza compromettere la purezza e la vitalità degli epatociti primari isolati.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dal Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. C57BL/6 topi femmina (8 settimane) sono stati utilizzati in questo studio.

1. Preparazione:

1. Mescolare William's E Medium (GlutaMAX Supplement) con 10% FBS e 1% di soluzione antibiotico-antimicotica per rendere il terreno di coltura.
2. Filtrare 25 mL di collagenasi-dispasi (ad es. Liver Digest Medium) attraverso un filtro a siringa da 0,45 μm per rimuovere i detriti particellari.
3. Riscaldare 50 mL di H₂O a doppio distillato (ddH₂O), 35 mL di mezzo di perfusione (ad esempio, mezzo di perfusione epatica) (o 50 mL al primo utilizzo di questo protocollo) e 25 mL di collagenasi-dispasi filtrata in un bagno d'acqua a 45 °C per 30 minuti.
4. All'interno di una cappa di coltura tissutale sterile, mescolare 2 mL di 10x HBSS e 18 mL di Percoll in un tubo da 50 mL per produrre 20 mL 1x Percoll-HBSS e mantenere sul ghiaccio o 4 °C.
   NOTA: 1x Percoll-HBSS può essere conservato a 4 °C per almeno 6 mesi.
5. All'interno di una cappa di coltura di tessuto sterile, versare 30 ml di mezzo di lavaggio (ad esempio, Hepatocyte Wash Medium) in una capsula di Petri pulita e tenere sul ghiaccio.
6. Immergere il tubo di pompaggio nell'acqua di un bagno d'acqua a 45 °C. I risultati sono più affidabili se la temperatura ambiente è a 25 °C.
7. Preparare 2 mL di 1x anestetici mescolando 225 μL di ketamina HCL, 93,75 μL di xilazina e 1681 μL di 1x PBS.
8. Anestetizzare un mouse utilizzando un metodo approvato. Qui il topo è stato iniettato per via intraperitoneale con 150 μL di 1x anestetici. Eseguire i test per la perdita di riflessi come la reazione al pizzicamento delle dita dei piedi per garantire un'anestesia completa.
9. Fissare il mouse sulla schiena sul pad di dissezione con quattro arti, bloccando o utilizzando nastro impermeabile o altri metodi approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'istituzione (o equivalenti).
10. Preparare pinze e forbici sterilizzate per la dissezione. Per evitare possibili contaminazioni, eseguire tutti i passaggi all'interno di un cappuccio sterile.

2. Procedura:

1. Utilizzando una pompa peristaltica, iniziare a pompare ddH₂O riscaldato ad una velocità di 4 ml / min per 5 minuti. Cambiare il tubo di pompaggio dall'acqua a un mezzo di perfusione riscaldato.
2. Disinfettare l'addome del topo anestetizzato con il 70% di EtOH e tagliare con una forbice per esporre il fegato, la vena porta e la vena cava inferiore (IVC).
3. Arrestare la pompa peristaltica. Inserire un catetere da 24 G (ad esempio, catetere IV chiuso, 24 G, 0,75 IN) in IVC. Inizia a pompare e taglia la vena porta aperta.
4. Continuare a pompare fino a quando il liquido svuotato è limpido (circa 3-5 minuti). Premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato. Fare attenzione a non lasciare che le bolle d'aria entrino nell'IVC.
   NOTA: Questo passaggio è quello di scovare più sangue possibile dal fegato.
5. Cambiare il tubo di pompaggio dal mezzo di perfusione al mezzo di collagenasi-dispasi. Continuare a pompare fino a quando tutti i 25 mL del mezzo collagenasi-dispasi sono esauriti mentre si esegue il passaggio 2.6.
6. Premere la vena porta ogni minuto per lasciare che il liquido raggiunga ogni angolo del fegato.
   NOTA: In questa fase, la completa perdita di sangue è fatale per il topo. La morte del topo può essere confermata da una mancanza di battito cardiaco dopo l'esperimento. Smaltire la carcassa secondo le politiche della struttura.
7. Isolare l'intero fegato senza cistifellea al mezzo di lavaggio da 30 ml nella capsula di Petri sul ghiaccio.
8. Strapparlo a pezzi con una pinza per rilasciare gli epatociti primari in soluzione. Questo passaggio trasformerebbe il mezzo di lavaggio in una soluzione torbida piena di epatociti primari rilasciati e piccoli pezzi di fegato.
9. Filtrare la soluzione torbida nel passaggio 2.8 attraverso un filtro cellulare da 70 μm nel Percoll-HBSS da 20 mL 1x in un tubo da 50 mL su ghiaccio. Mescolare invertendo il tubo 20 volte.
10. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 °C.
11. All'interno del cappuccio di coltura dei tessuti, aspirare il surnatante. Lavare il pellet con 30 ml di mezzo di lavaggio a freddo.
12. Centrifugare a 50 x g per 5 min a 4 °C.
13. Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet in 25 ml del terreno di coltura (o di altri volumi appropriati) all'interno della cappa di coltura del tessuto.
14. Contare il numero di cellule e placcare le cellule sulle piastre di coltura desiderate secondo il disegno sperimentale.
    NOTA: gli epatociti primari correttamente isolati da un topo di 8 settimane sono di solito sufficienti per essere placcati su quattro piastre a 6 pozzetti o quattro piastre a 12 pozzetti.

Risultati

Al fine di testare l'efficienza, l'attuale protocollo di isolamento degli epatociti primari è stato eseguito su topi C57BL/6 di 8 settimane. Sono stati testati l'attaccamento e la purezza degli epatociti primari isolati. L'isolamento primario degli epatociti viene utilizzato per un'ampia varietà di esperimenti sulla fisiologia epatica, come gli effetti dei farmaci epatici e il metabolismo del glucosio, l'attività dei biomarcatori farmaceutici², la sensibilità all'insulina e la produzione di gl...

Discussione

Sono stati sviluppati vari protocolli primari di isolamento degli epatociti. Inoltre sono stati mantenuti ottimizzati e adattati in base alle diverse esigenze (Tabella 1). I protocolli di isolamento sono generalmente composti da due parti: perfusione (compresa la digestione enzimatica) e purificazione.

La perfusione può essere eseguita con l'intero fegato in vivo 2,20,21,22,23 o con lobi epatici sezionati

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10