Un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris

Résumé

Les hépatocytes primaires sont un outil précieux pour étudier la réponse hépatique et le métabolisme in vitro. En utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, un protocole amélioré d’efficacité en termes de temps et de main-d’œuvre pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris a été développé.

Résumé

Les hépatocytes primaires sont largement utilisés dans la recherche in vitro sur le foie, en particulier dans les études sur le métabolisme du glucose. Une technique de base a été adaptée en fonction de différents besoins, tels que le temps, la main-d’œuvre, le coût et l’utilisation primaire des hépatocytes, ce qui a donné lieu à divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires. Cependant, les nombreuses étapes et les préparations de réactifs fastidieuses dans l’isolement des hépatocytes primaires sont des inconvénients majeurs pour l’efficacité. Après avoir comparé différents protocoles pour leurs avantages et leurs inconvénients, les avantages de chacun ont été combinés et un protocole d’isolement hépatocytaire primaire rapide et efficace a été formulé. En seulement ~ 35 minutes, ce protocole pourrait produire autant, sinon plus, d’hépatocytes primaires sains que d’autres protocoles. De plus, des expériences sur le métabolisme du glucose réalisées à l’aide des hépatocytes primaires isolés ont validé l’utilité de ce protocole dans les études in vitro sur le métabolisme hépatique. Nous avons également examiné et analysé de manière approfondie l’importance et le but de chaque étape de cette étude afin que les futurs chercheurs puissent optimiser davantage ce protocole en fonction des besoins.

Introduction

Le foie est l’un des organes les plus importants du corps des vertébrés en raison du rôle vital qu’il joue dans de nombreuses fonctions vitales telles que la digestion des aliments, la circulation sanguine et la désintoxication. L’utilisation de la culture in vitro d’hépatocytes primaires de souris est de plus en plus populaire dans les études sur le métabolisme des glucides et le carcinome hépatique. Par conséquent, il est important de développer une méthode pratique pour l’isolement des hépatocytes primaires de souris tout en maintenant sa fonction physiologique innée. En raison de sa fonction de plaque tournante du métabolisme du glucose, le foie est également au cœur de la production et du stockage du glucose¹. Les expériences avec des hépatocytes primaires in vitro sont indispensables à la plupart des études sur le métabolisme du glucose. Par conséquent, pendant des années, divers groupes de recherche ont développé des protocoles pour l’isolement des hépatocytes primaires chez la souris.

La procédure générale d’isolement des hépatocytes de souris consiste d’abord à rincer le sang dans le foie avec un liquide isosmotique tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS), puis à utiliser une solution contenant de la collagénase pour dissocier les hépatocytes. Ces protocoles partagent une procédure générale, mais diffèrent par des réactifs et des étapes en fonction de différents besoins. Cependant, la préparation des réactifs requis et l’exécution des étapes d’isolement prennent du temps. Lors de l’élaboration du protocole actuel, l’efficacité a été une priorité, avec tous les réactifs prêts à l’emploi et disponibles sur le marché, et le moins d’étapes possible. L’objectif global de ce protocole est de fournir une méthode rapide et efficace en main-d’œuvre pour isoler les hépatocytes primaires de la souris, sans compromettre la pureté et la viabilité des hépatocytes primaires isolés.

Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Johns Hopkins Animal Care and Use Committee. Des souris femelles C57BL/6 (âgées de 8 semaines) ont été utilisées dans cette étude.

1. Préparation :

1. Mélanger William’s E Medium (GlutaMAX Supplement) avec 10% FBS et 1% de solution antibiotique-antimycotique pour faire le milieu de culture.
2. Filtrer 25 mL de milieu collagénase-dispase (p. ex. milieu de digestion du foie) à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm pour éliminer les débris de particules.
3. Réchauffer 50 mL de H₂O (ddH₂O) double distillé, 35 mL de milieu de perfusion (p. ex. milieu de perfusion hépatique) (ou 50 mL pour la première fois en utilisant ce protocole) et 25 mL de milieu filtré à la collagénase-dispase dans un bain-marie à 45 °C pendant 30 min.
4. Dans une hotte de culture tissulaire stérile, mélanger 2 mL de 10x HBSS et 18 mL de Percoll dans un tube de 50 mL pour obtenir 20 mL 1x Percoll-HBSS et garder sur la glace ou 4 °C.
   REMARQUE: 1x Percoll-HBSS peut être conservé à 4 °C pendant au moins 6 mois.
5. Dans une cagoule de culture tissulaire stérile, versez 30 mL de milieu de lavage (p. ex. milieu de lavage des hépatocytes) dans une boîte de Pétri propre et conservez-la sur la glace.
6. Immergez le tube de pompage dans l’eau d’un bain-marie à 45 °C. Les résultats sont plus fiables si la température ambiante est de 25 °C.
7. Préparer 2 mL de 1x anesthésiques en mélangeant 225 μL de Kétamine HCL, 93,75 μL de Xylazine et 1681 μL de 1x PBS.
8. Anesthésiez une souris à l’aide d’une méthode approuvée. Ici, la souris a été injectée par voie intrapéritonéale avec 150 μL de 1x anesthésiques. Effectuer les tests de perte de réflexes tels que la réaction au pincement des orteils pour assurer une anesthésie complète.
9. Fixez la souris sur le dos sur le coussinet de dissection par quatre membres, en épinglant ou en utilisant du ruban adhésif étanche ou d’autres méthodes approuvées par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’établissement (ou des équivalents).
10. Préparez des pinces stérilisées et des ciseaux pour la dissection. Pour éviter toute contamination possible, effectuez toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte stérile.

2. Procédure :

1. À l’aide d’une pompe péristaltique, commencez à pomper du ddH₂O réchauffé à une vitesse de 4 mL/min pendant 5 min. Remplacez le tube de pompage de l’eau par un milieu de perfusion réchauffé.
2. Désinfectez l’abdomen de la souris anesthésiée avec 70% d’EtOH et coupez-le avec un ciseau pour exposer le foie, la veine porte et la veine cave inférieure (IVC).
3. Arrêtez la pompe péristaltique. Insérez un cathéter de 24 G (p. ex., cathéter IV fermé, 24 G, 0,75 PO) dans la CIV. Commencez à pomper et coupez la veine porte ouverte.
4. Continuez à pomper jusqu’à ce que le liquide évacué soit clair (environ 3-5 min). Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie. Veillez à ne pas laisser les bulles d’air pénétrer dans l’IVC.
   REMARQUE: Cette étape consiste à éliminer autant de sang que possible du foie.
5. Changer le tube de pompage du milieu de perfusion au milieu collagénase-dispase. Continuez à pomper jusqu’à ce que les 25 mL du milieu collagénase-dispase soient épuisés pendant l’étape 2.6.
6. Appuyez sur la veine porte toutes les minutes pour laisser le liquide atteindre tous les coins du foie.
   REMARQUE: À ce stade, la perte complète de sang est fatale à la souris. La mort de la souris peut être confirmée par un manque de rythme cardiaque après l’expérience. Jetez la carcasse conformément aux politiques de l’établissement.
7. Isolez tout le foie sans vésicule biliaire dans le milieu de lavage de 30 ml dans la boîte de Pétri sur de la glace.
8. Déchirez-le en morceaux avec des pinces pour libérer les hépatocytes primaires en solution. Cette étape transformerait le milieu de lavage en une solution trouble pleine d’hépatocytes primaires libérés et de petits morceaux de foie.
9. Filtrer la solution trouble à l’étape 2.8 à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans le Percoll-HBSS de 20 mL 1x dans un tube de 50 mL sur glace. Mélanger en inversant le tube 20 fois.
10. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
11. Dans la hotte de culture tissulaire, aspirez le surnageant. Laver la pastille avec 30 mL de milieu de lavage froid.
12. Centrifuger à 50 x g pendant 5 min à 4 °C.
13. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 25 mL du milieu de culture (ou d’autres volumes appropriés) dans la hotte de culture tissulaire.
14. Comptez le numéro de cellule et plaquez les cellules sur les plaques de culture souhaitées selon la conception expérimentale.
    REMARQUE: Les hépatocytes primaires correctement isolés d’une souris de 8 semaines sont généralement suffisants pour être plaqués sur quatre plaques de 6 puits ou quatre plaques de 12 puits.

Résultats

Afin de tester l’efficacité, le protocole actuel d’isolement des hépatocytes primaires a été réalisé sur des souris femelles C57BL/6 âgées de 8 semaines. La fixation et la pureté des hépatocytes primaires isolés ont été testées. L’isolement hépatocytaire primaire est utilisé pour une grande variété d’expériences sur la physiologie du foie, telles que les effets des médicaments hépatiques et le métabolisme du glucose, l’activité des biomarqueurs^{pharmaceutiques 2}, la...

Discussion

Divers protocoles d’isolement des hépatocytes primaires ont été développés. Ils ont également été optimisés et adaptés en fonction des différents besoins (tableau 1). Les protocoles d’isolement sont généralement composés de deux parties : la perfusion (y compris la digestion enzymatique) et la purification.

La perfusion peut être réalisée avec l’ensemble du foie in vivo 2,20,21,22,23 ou ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10