一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案

摘要

原代肝细胞是 研究体外肝脏反应和新陈代谢的宝贵工具。利用市售试剂，开发了一种改进的小鼠原代肝细胞分离时间和劳动效率方案。

摘要

原代肝细胞广泛用于肝脏 体外 研究，特别是在葡萄糖代谢研究中。根据不同的需求（如时间、人工、成本和原代肝细胞使用）对基本技术进行了调整，从而产生了各种原发性肝细胞分离方案。然而，原代肝细胞分离中的众多步骤和耗时的试剂制备是效率的主要缺点。在比较了不同方案的优缺点后，综合了每种方案的优点，并制定了快速有效的原代肝细胞分离方案。 在短短约35分钟内，该方案可以产生与其他方案一样多（如果不是更多）的健康原代肝细胞。此外，使用分离的原代肝细胞进行的葡萄糖代谢实验验证了该方案 在体外 肝脏代谢研究中的有用性。我们还广泛回顾和分析了本研究每个步骤的意义和目的，以便未来的研究人员可以根据需要进一步优化该协议。

引言

肝脏是脊椎动物体内最重要的器官之一，因为它在食物消化，血液循环和解毒等许多生命支持功能中起着至关重要的作用。小鼠原代肝细胞 在体外 培养中的应用在碳水化合物代谢和肝癌的研究中越来越受欢迎。因此，在维持其先天生理功能的同时，开发一种方便的小鼠原代肝细胞分离方法非常重要。由于其作为葡萄糖代谢中心的功能，肝脏也是葡萄糖产生和储存的核心¹。在 体外 进行原代肝细胞实验是大多数葡萄糖代谢研究的必要条件。因此，多年来，各种研究小组已经制定了小鼠原代肝细胞分离方案。

小鼠肝细胞分离的一般程序是首先用等渗液体（如磷酸盐缓冲盐水（PBS）或Hanks平衡盐溶液（HBSS）冲洗肝脏中的血液，然后使用含胶原酶的溶液解离肝细胞。这些实验方案共享一般程序，但根据不同的需求，试剂和步骤不同。然而，制备所需的试剂和执行分离步骤需要时间。在开发本方案时，效率被确定为优先事项，所有试剂都是即用型的，可以从市场上获得，并且步骤尽可能少。该协议的总体目标是提供一种快速且劳动高效的方法，以从小鼠中分离原代肝细胞，而不会危及分离的原代肝细胞纯度和活力。

研究方案

所有程序均由约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准。本研究使用C57BL / 6雌性小鼠（8周龄）。

1. 准备工作:

1. 将William's E培养基（GlutaMAX补充剂）与10%FBS和1%抗生素抗真菌剂溶液混合，制成培养基。
2. 通过0.45μm注射器过滤器过滤25mL胶原酶 - 分散酶培养基（例如，肝脏消化培养基），以除去颗粒碎片。
3. 将50 mL双蒸馏H₂O（ddH₂O），35mL灌注培养基（例如，肝脏灌注培养基）（或首次使用该方案时为50mL）和25mL过滤的胶原酶 - 分散酶培养基在45°C水浴中加热30分钟。
4. 在无菌组织培养罩内，将2 mL 10x HBSS和18 mL Percoll混合在50 mL管中，制成20 mL 1x Percoll-HBSS并保持在冰上或4°C。
   注意:1x Percoll-HBSS可以在4°C下保持至少6个月。
5. 在无菌组织培养罩内，将30mL洗涤培养基（例如肝细胞洗涤培养基）倒入干净的培养皿中，并保持在冰上。
6. 将泵送管浸入45°C水浴的水中。如果室温为25°C，则结果最可靠。
7. 通过混合225μL氯胺酮盐酸盐，93.75μL木拉嗪和1681μL1x PBS制备2mL1x麻醉剂。
8. 使用批准的方法麻醉一只鼠标。在这里，将小鼠腹膜内注射150μL1x麻醉剂。进行反射丧失测试，例如对脚趾捏合的反应，以确保完全麻醉。
9. 通过固定或使用防水胶带或该机构动物护理和使用委员会（或同等机构）批准的其他方法，用四肢将鼠标背对着解剖垫。
10. 准备灭菌的镊子和剪刀进行解剖。为避免可能的污染，请在无菌罩内执行所有步骤。

2. 程序:

1. 使用蠕动泵，以4 mL / min的速度开始泵送预热的ddH₂O，持续5分钟。将泵送管从水改为预热灌注介质。
2. 用70%的EtOH消毒麻醉小鼠的腹部，并用剪刀切开以暴露肝脏，门静脉和下腔静脉（IVC）。
3. 停止蠕动泵。将 24 G 导管（例如，闭合静脉导管，24 G，0.75 IN）插入 IVC。开始泵送并切开门静脉。
4. 继续泵送，直到冲洗出的液体变清（约 3-5 分钟）。每分钟按压门静脉，让液体到达肝脏的每个角落。注意不要让气泡进入IVC。
   注意:此步骤是从肝脏中冲洗出尽可能多的血液。
5. 将泵管从灌注培养基更换为胶原酶-分散酶培养基。继续泵送，直到在执行步骤 2.6 时耗尽所有 25 mL 胶原酶-分散酶培养基。
6. 每分钟按压门静脉，让液体到达肝脏的每个角落。
   注意:在这个阶段，完全失血对小鼠来说是致命的。小鼠的死亡可以通过实验后缺乏心跳来确认。根据设施政策处理胴体。
7. 将整个肝脏分离出来，没有胆囊，放入冰上培养皿中的30 mL洗涤培养基中。
8. 用镊子将其撕成碎片，将原代肝细胞释放到溶液中。该步骤将洗涤培养基变成充满释放的原代肝细胞和小肝块的浑浊溶液。
9. 通过70μm细胞过滤器过滤步骤2.8中的浑浊溶液，在50mL冰管中加入20 mL 1x Percoll-HBSS。通过倒置管子20次混合。
10. 在4°C下以300× g 离心10分钟。
11. 在组织培养罩内，吸出上清液。用冷的30mL洗涤培养基洗涤沉淀。
12. 在4°C下以50× g 离心5分钟。
13. 除去上清液并将沉淀重悬于组织培养罩内的25mL培养基（或适当的其他体积）中。
14. 根据实验设计，计数细胞数量并将细胞接种在所需的培养板上。
    注意:从一只8周龄的小鼠中正确分离的原代肝细胞通常足以接种在四个6孔板或四个12孔板上。

结果

为了测试效率，在8周龄雌性C57BL / 6小鼠上进行了本原代肝细胞分离方案。测试分离的原代肝细胞的附着性和纯度。原发性肝细胞分离用于肝脏生理学的各种实验，例如肝脏药物效应和葡萄糖代谢，药物生物标志物活性²，胰岛素敏感性和葡萄糖产生。因此，在以下实验中测试了用该方案分离的原代肝细胞的活性。

在本方案中，原发性肝细胞附着不需要?...

讨论

已经开发了各种原发性肝细胞分离方案。它们还根据不同的需求进行了优化和调整（表1）。分离方案通常由两部分组成:灌注（包括酶消化）和纯化。

灌注可以与整个肝脏在体内^{2，20，21，22，23}或解剖的肝叶²⁴中进行。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10