Улучшенный протокол, эффективный по времени и труду, для выделения первичных гепатоцитов мышей

Резюме

Первичные гепатоциты являются ценным инструментом для изучения реакции печени и метаболизма in vitro. Используя коммерчески доступные реагенты, был разработан улучшенный протокол экономии времени и труда для выделения первичных гепатоцитов мышей.

Аннотация

Первичные гепатоциты широко используются в исследованиях печени in vitro , особенно в исследованиях метаболизма глюкозы. Базовая методика была адаптирована на основе различных потребностей, таких как время, труд, стоимость и использование первичных гепатоцитов, что привело к различным протоколам выделения первичных гепатоцитов. Однако многочисленные этапы и трудоемкие препараты реагентов при первичном выделении гепатоцитов являются основными недостатками эффективности. После сравнения различных протоколов на предмет их плюсов и минусов преимущества каждого из них были объединены, и был сформулирован быстрый и эффективный протокол выделения первичных гепатоцитов. Всего за 35 минут этот протокол может дать столько же, если не больше, здоровых первичных гепатоцитов, сколько и другие протоколы. Кроме того, эксперименты с метаболизмом глюкозы, проведенные с использованием изолированных первичных гепатоцитов, подтвердили полезность этого протокола в исследованиях метаболизма печени in vitro . Мы также подробно рассмотрели и проанализировали значение и цель каждого шага в этом исследовании, чтобы будущие исследователи могли дополнительно оптимизировать этот протокол на основе потребностей.

Введение

Печень служит одним из самых важных органов в организме позвоночных из-за жизненно важной роли, которую она играет в многочисленных жизнеобеспечивающих функциях, таких как переваривание пищи, кровообращение и детоксикация. Использование мышиной первичной культуры гепатоцитов in vitro становится все более популярным в исследованиях углеводного обмена и печеночной карциномы. Поэтому важно разработать удобный метод выделения первичного гепатоцита мыши при сохранении его врожденной физиологической функции. Благодаря своей функции центра метаболизма глюкозы, печень также занимает центральное место в производстве и хранении глюкозы¹. Эксперименты с первичными гепатоцитами in vitro являются обязательными для большинства исследований метаболизма глюкозы. Поэтому в течение многих лет различные исследовательские группы разрабатывали протоколы выделения первичных гепатоцитов мышей.

Общая процедура выделения гепатоцитов у мышей заключается в том, чтобы сначала вымыть кровь в печени изосмотической жидкостью, такой как фосфат-буферный физиологический раствор (PBS) или сбалансированный солевой раствор Хэнкса (HBSS), а затем использовать раствор, содержащий коллагеназу, для диссоциации гепатоцитов. Эти протоколы имеют общую процедуру, но различаются по реагентам и шагам, основанным на различных потребностях. Однако подготовка необходимых реагентов и выполнение этапов изоляции требуют времени. При разработке настоящего протокола эффективность была поставлена в качестве приоритета, при этом все реагенты готовы к использованию и доступны на рынке, и как можно меньше шагов. Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы обеспечить быстрый и эффективный с трудом метод выделения первичных гепатоцитов у мыши, не ставя под угрозу чистоту и жизнеспособность выделенных первичных гепатоцитов.

протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Джона Хопкинса. В этом исследовании использовались самки мышей C57BL/6 (8-недельного возраста).

1. Подготовка:

1. Смешайте Е-среду Уильяма (Добавка GlutaMAX) с 10% FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором, чтобы получить культуральную среду.
2. Фильтруйте 25 мл коллагеназно-диспазной среды (например, liver Digest Medium) через шприцевой фильтр 0,45 мкм для удаления остатков частиц.
3. Нагревают 50 мл двойной дистилляции_H2O (ddH₂O), 35 мл перфузионной среды (например, перфузионной среды печени) (или 50 мл в первый раз с использованием этого протокола) и 25 мл фильтрованной коллагеназно-диспазной среды на водяной бане 45 °C в течение 30 мин.
4. В стерильной вытяжке для культивирования тканей смешайте 2 мл 10x HBSS и 18 мл Percoll в трубке 50 мл, чтобы получить 20 мл 1x Percoll-HBSS и держать на льду или 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: 1x Percoll-HBSS можно хранить при 4 °C в течение не менее 6 месяцев.
5. В стерильной вытяжке для культивирования тканей налейте 30 мл моющей среды (например, гепатоцитарной моющей среды) в чистую чашку Петри и держите на льду.
6. Погрузите насосную трубку в воду водяной бани с температурой 45 °C. Результаты наиболее надежны, если температура в помещении составляет 25 °C.
7. Приготовьте 2 мл 1x анестетиков, смешав 225 мкл кетамина HCL, 93,75 мкл ксилазина и 1681 мкл 1x PBS.
8. Обезболить одну мышь по утвержденному методу. Здесь мышке внутрибрюшинно вводили 150 мкл 1x анестетиков. Выполните тесты на потерю рефлексов, таких как реакция на защемление пальцев ног, чтобы обеспечить полную анестезию.
9. Закрепите мышь на спине на подушечке для рассечения четырьмя конечностями, либо прикалывая, либо используя водонепроницаемую ленту или другие методы, одобренные Комитетом по уходу и использованию животных учреждения (или эквиваленты).
10. Подготовьте стерилизованные щипцы и ножницы для рассечения. Чтобы избежать возможного загрязнения, проводите все шаги в стерильной вытяжке.

2. Процедура:

1. С помощью перистальтического насоса начинают откачку нагретого ddH_2Oсо скоростью 4 мл/мин в течение 5 мин. Замените насосную трубку с воды на подогретую перфузионную среду.
2. Продезинфицируйте живот анестезируемой мыши с помощью 70% EtOH и разрежьте ножницами, чтобы обнажить печень, воротную вену и нижнюю полую вену (IVC).
3. Остановите перистальтический насос. Вставьте катетер 24 г (например, закрытый внутривенный катетер, 24 г, 0,75 ДЮЙМА) в IVC. Начните откачку и разрежьте портальную вену.
4. Продолжайте откачку до тех пор, пока смытая жидкость не станет прозрачной (около 3-5 минут). Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени. Будьте осторожны, чтобы не позволить пузырькам воздуха проникнуть в IVC.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в том, чтобы вымыть как можно больше крови из печени.
5. Измените насосную трубку с перфузионной среды на коллагеназно-диспазную среду. Продолжайте сцеживание до тех пор, пока все 25 мл коллагеназно-диспазной среды не истощатся, выполняя шаг 2.6.
6. Каждую минуту нажимайте на воротную вену, чтобы жидкость достигла каждого уголка печени.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе полная потеря крови смертельна для мыши. Смерть мыши может быть подтверждена отсутствием сердцебиения после эксперимента. Утилизируйте тушу в соответствии с политикой объекта.
7. Изолировать всю печень без желчного пузыря до промывной среды объемом 30 мл в чашке Петри на льду.
8. Разорвите его на куски щипцами, чтобы освободить первичные гепатоциты в раствор. Этот шаг превратит промывную среду в мутный раствор, полный высвобождаемых первичных гепатоцитов и мелких кусочков печени.
9. Отфильтруйте мутный раствор на этапе 2.8 через клеточный ситечко 70 мкм в 20 мл 1x Percoll-HBSS в трубке объемом 50 мл на льду. Перемешайте, перевернув трубку 20 раз.
10. Центрифуга при 300 х г в течение 10 мин при 4 °C.
11. В тканевом культуральном капюшоне аспирируйте супернатант. Вымойте гранулы холодными 30 мл моющей среды.
12. Центрифуга при 50 х г в течение 5 мин при 4 °C.
13. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу в 25 мл питательной среды (или соответствующих других объемов) в вытяжке культуры ткани.
14. Подсчитайте номер ячейки и нанесите ячейки на желаемые культуральные пластины в соответствии с экспериментальной конструкцией.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первичных гепатоцитов, правильно выделенных у одной 8-недельной мыши, обычно достаточно для нанесения на четыре 6-луночные пластины или четыре 12-луночные пластины.

Результаты

Чтобы проверить эффективность, настоящий протокол первичной изоляции гепатоцитов был выполнен на 8-недельных самках мышей C57BL/6. Проверено прикрепление и чистота изолированных первичных гепатоцитов. Первичное выделение гепатоцитов используется для широкого спектра экспериментов по ?...

Обсуждение

Разработаны различные протоколы выделения первичных гепатоцитов. Они также были оптимизированы и адаптированы с учетом различных потребностей (таблица 1). Протоколы выделения обычно состоят из двух частей: перфузии (включая ферментное сбраживание) и очистки.

П?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10