Un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones

Resumen

Los hepatocitos primarios son una herramienta valiosa para estudiar la respuesta hepática y el metabolismo in vitro. Utilizando reactivos disponibles comercialmente, se desarrolló un protocolo mejorado de tiempo y mano de obra eficiente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón.

Resumen

Los hepatocitos primarios se utilizan ampliamente en la investigación in vitro del hígado, especialmente en estudios de metabolismo de la glucosa. Se ha adaptado una técnica base en función de diferentes necesidades, como el tiempo, la mano de obra, el costo y el uso de hepatocitos primarios, lo que resulta en varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. Sin embargo, los numerosos pasos y las preparaciones de reactivos que consumen mucho tiempo en el aislamiento primario de hepatocitos son inconvenientes importantes para la eficiencia. Después de comparar diferentes protocolos por sus pros y sus contras, se combinaron las ventajas de cada uno, y se formuló un protocolo de aislamiento de hepatocitos primarios rápido y eficiente. En solo ~ 35 minutos, este protocolo podría producir tanto, si no más, hepatocitos primarios sanos como otros protocolos. Además, los experimentos de metabolismo de la glucosa realizados utilizando los hepatocitos primarios aislados validaron la utilidad de este protocolo en estudios in vitro de metabolismo hepático. También revisamos y analizamos ampliamente la importancia y el propósito de cada paso en este estudio para que los futuros investigadores puedan optimizar aún más este protocolo en función de las necesidades.

Introducción

El hígado sirve como uno de los órganos más importantes en el cuerpo de los vertebrados debido al papel vital que desempeña en numerosas funciones de soporte vital como la digestión de alimentos, la circulación sanguínea y la desintoxicación. El uso del cultivo in vitro de hepatocitos primarios de ratón es cada vez más popular en estudios sobre el metabolismo de los carbohidratos y el carcinoma hepático. Por lo tanto, es importante desarrollar un método conveniente para el aislamiento de hepatocitos primarios de ratón mientras se mantiene su función fisiológica innata. Debido a su función como un centro del metabolismo de la glucosa, el hígado también es fundamental para la producción y el almacenamiento de glucosa¹. Los experimentos con hepatocitos primarios in vitro son imprescindibles para la mayoría de los estudios del metabolismo de la glucosa. Por lo tanto, durante años, varios grupos de investigación han desarrollado protocolos para el aislamiento de hepatocitos primarios en ratones.

El procedimiento general del aislamiento de hepatocitos de ratón es primero eliminar la sangre en el hígado con un líquido isosmótico como solución salina tamponada con fosfato (PBS) o solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) y luego usar solución que contiene colagenasa para disociar los hepatocitos. Estos protocolos comparten un procedimiento general, pero difieren en reactivos y pasos en función de las diferentes necesidades. Sin embargo, la preparación de los reactivos necesarios y la realización de pasos de aislamiento llevan tiempo. En el desarrollo del presente protocolo, se estableció la eficiencia como una prioridad, con todos los reactivos listos para usar y disponibles en el mercado, y la menor cantidad de pasos posible. El objetivo general de este protocolo es proporcionar un método rápido y eficiente en el trabajo de parto para aislar los hepatocitos primarios del ratón, sin poner en peligro la pureza y viabilidad de los hepatocitos primarios aislados.

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de Johns Hopkins. En este estudio se utilizaron ratones hembra C57BL/6 (8 semanas de edad).

1. Preparación:

1. Mezcle William's E Medium (suplemento GlutaMAX) con 10% de FBS y 1% de solución antibiótico-antimicótica para hacer el medio de cultivo.
2. Filtre 25 ml de medio colagenasa-dispasa (por ejemplo, Liver Digest Medium) a través de un filtro de jeringa de 0,45 μm para eliminar los restos de partículas.
3. Caliente 50 ml de H₂O de doble destilación (ddH₂O), 35 ml de medio de perfusión (por ejemplo, medio de perfusión hepática) (o 50 ml la primera vez que se utiliza este protocolo) y 25 ml de medio filtrado de colagenasa-dispasa en un baño de agua de 45 °C durante 30 min.
4. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, mezcle 2 ml de 10x HBSS y 18 mL de Percoll en un tubo de 50 mL para hacer 20 mL 1x Percoll-HBSS y mantener en hielo o 4 °C.
   NOTA: 1x Percoll-HBSS se puede mantener a 4 °C durante al menos 6 meses.
5. Dentro de una campana de cultivo de tejidos estériles, vierta 30 ml de medio de lavado (por ejemplo, hepatocyte Wash Medium) en una placa de Petri limpia y manténgalo en hielo.
6. Sumerja el tubo de bombeo en el agua de un baño de agua a 45 °C. Los resultados son más fiables si la temperatura ambiente está a 25 °C.
7. Preparar 2 ml de 1x anestésicos mezclando 225 μL de ketamina HCL, 93,75 μL de xilazina y 1681 μL de 1x PBS.
8. Anestesiar un ratón utilizando un método aprobado. Aquí el ratón fue inyectado intraperitonealmente con 150 μL de 1x anestésicos. Realice las pruebas para detectar la pérdida de reflejos, como la reacción al pellizco del dedo del pie para garantizar una anestesia completa.
9. Asegure el ratón en su espalda a la almohadilla de disección por cuatro extremidades, ya sea fijando o usando cinta impermeable u otros métodos aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la institución (o equivalentes).
10. Prepare pinzas y tijeras esterilizadas para la disección. Para evitar una posible contaminación, realice todos los pasos dentro de una campana estéril.

2. Procedimiento:

1. Usando una bomba peristáltica, comience a bombear ddH₂O calentado a una velocidad de 4 ml / min durante 5 minutos. Cambie el tubo de bombeo de agua a un medio de perfusión calentado.
2. Desinfecte el abdomen del ratón anestesiado con 70% de EtOH y ártelo con una tijera para exponer el hígado, la vena porta y la vena cava inferior (IVC).
3. Detenga la bomba peristáltica. Inserte un catéter de 24 G (por ejemplo, catéter IV cerrado, 24 G, 0,75 IN) en IVC. Comience a bombear y corte la vena porta abierta.
4. Continúe bombeando hasta que el líquido eliminado esté claro (alrededor de 3-5 min). Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado. Tenga cuidado de no dejar que las burbujas de aire entren en el IVC.
   NOTA: Este paso consiste en eliminar la mayor cantidad de sangre posible del hígado.
5. Cambie el tubo de bombeo del medio de perfusión al medio colagenasa-dispasa. Continúe bombeando hasta que los 25 ml del medio colagenasa-dispasa se agoten mientras realiza el paso 2.6.
6. Presione la vena porta cada minuto para dejar que el líquido llegue a cada rincón del hígado.
   NOTA: En esta etapa, la pérdida completa de sangre es fatal para el ratón. La muerte del ratón puede confirmarse por la falta de latidos del corazón después del experimento. Deseche el cadáver según las políticas de la instalación.
7. Aísle todo el hígado sin vesícula biliar al medio de lavado de 30 ml en la placa de Petri sobre hielo.
8. Romperlo en pedazos con fórceps para liberar hepatocitos primarios en solución. Este paso convertiría el medio de lavado en una solución turbia llena de hepatocitos primarios liberados y pequeños trozos de hígado.
9. Filtre la solución turbia en el paso 2.8 a través de un colador celular de 70 μm en el Percoll-HBSS de 20 ml 1x en un tubo de 50 ml sobre hielo. Mezclar invirtiendo el tubo 20 veces.
10. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C.
11. Dentro de la capucha de cultivo de tejidos, aspire el sobrenadante. Lavar el pellet con 30 mL de medio de lavado en frío.
12. Centrifugar a 50 x g durante 5 min a 4 °C.
13. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 25 ml del medio de cultivo (u otros volúmenes apropiados) dentro de la campana de cultivo de tejidos.
14. Cuente el número de células y platee las células en las placas de cultivo deseadas de acuerdo con el diseño experimental.
    NOTA: Los hepatocitos primarios correctamente aislados de un ratón de 8 semanas de edad suelen ser suficientes para ser chapados en cuatro placas de 6 pocillos o cuatro placas de 12 pocillos.

Resultados

Para probar la eficiencia, el actual protocolo de aislamiento primario de hepatocitos se realizó en ratones C57BL/6 hembra de 8 semanas de edad. Se probó la unión y pureza de los hepatocitos primarios aislados. El aislamiento primario de hepatocitos se utiliza para una amplia variedad de experimentos sobre fisiología hepática, como los efectos de los fármacos hepáticos y el metabolismo de la glucosa, la actividad de biomarcadores farmacéuticos², la sensibilidad a la insulina y la producci?...

Discusión

Se han desarrollado varios protocolos de aislamiento de hepatocitos primarios. También se han mantenido optimizados y adaptados en función de las diferentes necesidades (Tabla 1). Los protocolos de aislamiento generalmente se componen de dos partes: perfusión (incluida la digestión enzimática) y purificación.

La perfusión se puede realizar con todo el hígado in vivo 2,20,21,22,23 o con lóbulos hepáti...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10