Ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus

Zusammenfassung

Primäre Hepatozyten sind ein wertvolles Werkzeug, um die Leberreaktion und den Metabolismus in vitro zu untersuchen. Unter Verwendung kommerziell erhältlicher Reagenzien wurde ein verbessertes zeit- und arbeitseffizientes Protokoll für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Zusammenfassung

Primäre Hepatozyten werden in der Leber-in-vitro-Forschung , insbesondere in Glukosestoffwechselstudien, umfassend eingesetzt. Eine Basistechnik wurde basierend auf verschiedenen Anforderungen wie Zeit, Arbeit, Kosten und primärer Hepatozytennutzung angepasst, was zu verschiedenen primären Hepatozytenisolationsprotokollen führte. Die zahlreichen Schritte und zeitaufwändigen Reagenzienpräparate in der primären Hepatozytenisolierung sind jedoch große Nachteile für die Effizienz. Nach dem Vergleich verschiedener Protokolle für ihre Vor- und Nachteile wurden die Vorteile jedes Protokolls kombiniert und ein schnelles und effizientes primäres Hepatozytenisolationsprotokoll formuliert. Innerhalb von nur ~ 35 Minuten könnte dieses Protokoll genauso viel, wenn nicht mehr, gesunde primäre Hepatozyten liefern wie andere Protokolle. Darüber hinaus validierten Glukosestoffwechselexperimente, die mit den isolierten primären Hepatozyten durchgeführt wurden, die Nützlichkeit dieses Protokolls in In-vitro-Leberstoffwechselstudien . Wir haben auch die Bedeutung und den Zweck jedes Schritts in dieser Studie ausführlich überprüft und analysiert, damit zukünftige Forscher dieses Protokoll basierend auf den Bedürfnissen weiter optimieren können.

Einleitung

Die Leber dient als eines der wichtigsten Organe im Wirbeltierkörper aufgrund der lebenswichtigen Rolle, die sie bei zahlreichen lebenserhaltenden Funktionen wie Nahrungsverdauung, Durchblutung und Entgiftung spielt. Die Verwendung von primären Hepatozyten in vitro-Kulturen der Maus wird in Studien zum Kohlenhydratstoffwechsel und zum Leberkarzinom immer beliebter. Daher ist es wichtig, eine geeignete Methode zur primären Hepatozytenisolierung der Maus zu entwickeln und gleichzeitig ihre angeborene physiologische Funktion beizubehalten. Aufgrund ihrer Funktion als Drehscheibe des Glukosestoffwechsels ist die Leber auch für die Glukoseproduktion und -speicherung^{von zentraler Bedeutung 1}. Experimente mit primären Hepatozyten in vitro sind ein Muss für die meisten Glukosestoffwechselstudien. Daher haben verschiedene Forschungsgruppen seit Jahren Protokolle für die primäre Hepatozytenisolierung der Maus entwickelt.

Das allgemeine Verfahren der Hepatozytenisolierung der Maus besteht darin, zuerst Blut in der Leber mit einer isosmotischen Flüssigkeit wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) oder Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) auszuspülen und dann Kollagenase-haltige Lösung zu verwenden, um Hepatozyten zu dissoziieren. Diese Protokolle teilen sich ein allgemeines Verfahren, unterscheiden sich jedoch in Reagenzien und Schritten, die auf unterschiedlichen Anforderungen basieren. Die Vorbereitung der erforderlichen Reagenzien und die Durchführung von Isolationsschritten nehmen jedoch Zeit in Anspruch. Bei der Entwicklung des vorliegenden Protokolls wurde die Effizienz als Priorität festgelegt, wobei alle Reagenzien gebrauchsfertig und auf dem Markt erhältlich sind, und zwar in so wenigen Schritten wie möglich. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, eine schnelle und arbeitseffiziente Methode zur Isolierung primärer Hepatozyten von der Maus bereitzustellen, ohne die Reinheit und Lebensfähigkeit isolierter primärer Hepatozyten zu gefährden.

Protokoll

Alle Verfahren wurden vom Johns Hopkins Animal Care and Use Committee genehmigt. C57BL/6 weibliche Mäuse (8 Wochen alt) wurden in dieser Studie verwendet.

1. Vorbereitung:

1. Mischen Sie William's E Medium (GlutaMAX Supplement) mit 10% FBS und 1% antimykotischer Lösung, um die Kultur medium zu machen.
2. Filtern Sie 25 ml Kollagenase-Dispase-Medium (z. B. Leberaufschlussmedium) durch einen 0,45-μm-Spritzenfilter, um Partikelablagerungen zu entfernen.
3. Erwärmen Sie 50 ml doppelt destilliertes_H2O(ddH₂O), 35 ml Perfusionsmedium (z. B. Leberperfusionsmedium) (oder 50 ml zum ersten Mal unter Verwendung dieses Protokolls) und 25 ml gefiltertes Kollagenase-Dispase-Medium in einem 45 ° C-Wasserbad für 30 min.
4. Mischen Sie in einer sterilen Gewebekulturhaube 2 ml 10x HBSS und 18 ml Percoll in einem 50 ml Röhrchen, um 20 ml 1x Percoll-HBSS herzustellen und auf Eis oder 4 ° C zu halten.
   HINWEIS: 1x Percoll-HBSS kann mindestens 6 Monate bei 4 °C gehalten werden.
5. In einer sterilen Gewebekulturhaube 30 ml Waschmedium (z. B. Hepatozyten-Waschmedium) in eine saubere Petrischale geben und auf Eis legen.
6. Tauchen Sie das Pumprohr in das Wasser eines 45 °C warmen Wasserbades. Die Ergebnisse sind am zuverlässigsten, wenn die Raumtemperatur bei 25 °C liegt.
7. Bereiten Sie 2 ml 1x Anästhetika vor, indem Sie 225 μL Ketamin HCL, 93,75 μL Xylat und 1681 μL 1x PBS mischen.
8. Anästhesieren Sie eine Maus mit einer zugelassenen Methode. Hier wurde der Maus intraperitoneal 150 μL 1x Anästhetika injiziert. Führen Sie die Tests für den Verlust von Reflexen wie Reaktion auf Zehenkneifen durch, um eine Vollnarkose zu gewährleisten.
9. Befestigen Sie die Maus auf dem Rücken mit vier Gliedmaßen auf dem Sezierpad, indem Sie entweder festklemmen oder wasserdichtes Klebeband oder andere vom Animal Care and Use Committee (oder gleichwertigen) der Institution genehmigte Methoden verwenden.
10. Sterilisierte Pinzetten und Scheren für die Dissektion vorbereiten. Um eine mögliche Kontamination zu vermeiden, führen Sie alle Schritte in einer sterilen Haube durch.

2. Verfahren:

1. Beginnen Sie mit einer Peristaltikpumpe mit dem Pumpen von erwärmtem ddH₂O mit einer Geschwindigkeit von 4 ml/min für 5 min. Wechseln Sie das Pumprohr von Wasser zu einem aufgewärmten Perfusionsmedium.
2. Desinfizieren Sie den Bauch der betäubten Maus mit 70% EtOH und schneiden Sie ihn mit einer Schere auf, um die Leber, die Pfortader und die untere Hohlvene (IVC) freizulegen.
3. Stoppen Sie die Peristaltikpumpe. Setzen Sie einen 24-G-Katheter (z. B. geschlossener IV-Katheter, 24 G, 0,75 Zoll) in IVC ein. Beginnen Sie mit dem Pumpen und schneiden Sie die Pfortader auf.
4. Pumpen Sie weiter, bis die ausgespülte Flüssigkeit klar ist (ca. 3-5 min). Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht. Achten Sie darauf, dass keine Luftblasen in das IVC eindringen.
   HINWEIS: Dieser Schritt besteht darin, so viel Blut wie möglich aus der Leber auszuspülen.
5. Wechseln Sie das Pumprohr vom Perfusionsmedium zum Kollagenase-Dispase-Medium. Pumpen Sie weiter, bis alle 25 ml des Kollagenase-Dispase-Mediums erschöpft sind, während Sie Schritt 2.6 ausführen.
6. Drücken Sie die Pfortader jede Minute, damit Flüssigkeit jeden Winkel der Leber erreicht.
   HINWEIS: In diesem Stadium ist der vollständige Blutverlust für die Maus tödlich. Der Tod der Maus kann durch einen fehlenden Herzschlag nach dem Experiment bestätigt werden. Entsorgen Sie den Kadaver gemäß den Richtlinien der Einrichtung.
7. Isolieren Sie die ganze Leber ohne Gallenblase auf das 30 ml Waschmedium in der Petrischale auf Eis.
8. Reißen Sie es mit einer Pinzette in Stücke, um primäre Hepatozyten in Lösung freizusetzen. Dieser Schritt würde das Waschmedium in eine trüben Lösung voller freigesetzter primärer Hepatozyten und kleiner Leberstücke verwandeln.
9. Filtern Sie die trüben Lösung in Schritt 2.8 durch ein 70 μm Zellsieb in das 20 mL 1x Percoll-HBSS in einem 50 mL Rohr auf Eis. Mischen Sie, indem Sie das Rohr 20 Mal umkehren.
10. Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
11. Saugen Sie den Überstand innerhalb der Gewebekulturhaube ab. Waschen Sie das Pellet mit kaltem 30 ml Waschmedium.
12. Zentrifuge bei 50 x g für 5 min bei 4 °C.
13. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 25 ml des Kulturmediums (oder geeigneten anderen Volumina) innerhalb der Gewebekulturhaube.
14. Zählen Sie die Zellzahl und die Platte der Zellen auf den gewünschten Kulturplatten entsprechend dem Versuchsdesign.
    HINWEIS: Primäre Hepatozyten, die ordnungsgemäß von einer 8 Wochen alten Maus isoliert wurden, reichen normalerweise aus, um auf vier 6-Well-Platten oder vier 12-Well-Platten plattiert zu werden.

Ergebnisse

Um die Effizienz zu testen, wurde das vorliegende primäre Hepatozytenisolationsprotokoll an 8 Wochen alten weiblichen C57BL/6-Mäusen durchgeführt. Die Anheftung und Reinheit isolierter primärer Hepatozyten wurde getestet. Die primäre Hepatozytenisolierung wird für eine Vielzahl von Experimenten zur Leberphysiologie verwendet, wie z. B. hepatische Arzneimittelwirkungen und Glukosestoffwechsel, pharmazeutische Biomarkeraktivität², Insulinsensitivität und Glukoseproduktion. Daher wurden die A...

Diskussion

Verschiedene primäre Hepatozytenisolationsprotokolle wurden entwickelt. Sie wurden auch optimiert und an unterschiedliche Bedürfnisse angepasst (Tabelle 1). Isolationsprotokolle bestehen im Allgemeinen aus zwei Teilen: Perfusion (einschließlich Enzymaufschluss) und Reinigung.

Die Perfusion kann mit der gesamten Leber in vivo 2,20,21,22,23 oder mit sezierten Leberlappen

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Gibco	10010023
10x HBSS	Gibco	14065-056
12-well Plate	FALCON	353043	Coating not required
6-well Plate	FALCON	353046	Coating not required
anti-AKT	Cell Signaling	2920S
Antibiotic Antimycotic Solution (100x), Stabilized	Sigma-Aldrich	A5955
anti-FOXO1	Cell Signaling	97635S
anti-GAPDH	Cell Signaling	2118S
anti-p-AKT (S473)	Cell Signaling	9271L
anti-PEPCK	Santa Cruz	SC-166778
anti-p-FOXO1 (S256)	Cell Signaling	84192S
Cell Strainer, 70 µm	CELLTREAT	229483
Closed IV Catheter, 24 Gauge 0.75 IN	Becton Dickinson	383511
DMEM, no glucose, no glutamine, no phenol red	ThermoFisher Scientific	A1443001
EnzyChrom Glucose Assay Kit	BioAssay Systems	EBGL-100
Fetal Bovine Serum (FBS)	Hyclone	SH30071.03
Forskolin	MilliporeSigma	F3917-10MG
Glucagon	Sigma-Aldrich	G2044
Goat Anti-mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070
Goat Anti-rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211
GraphPad Prism 8	GraphPad Software	NA
Hepatocyte Wash Medium	Gibco	17704-024
IBMX	Cell Signaling	13630S
Insulin	Lilly	NDC 0002-8215-01
Ketamine HCL (100 mg/mL)	Hospira Inc	NDC 0409-2051-05
L-Glutamine	Gibco	25030081
Liver Digest Medium	Gibco	17703-034	Aliquot within tissue culture hood to 25 mL each in 50 mL tube, and keep in -20 °C freezer
Liver Perfusion Medium	Gibco	17701-038
Pen Strep	Gibco	15140122
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
Peristaltic Pump	Gilson	Minipuls 2	Capable of pumping at 4 mL/min
Petri Dish	Fisherbrand	08-757-12
Refrigerated Centrifuge	Sorvall	Legend RT	Capable to centrifuge 50 mL tube at 4 °C
Sodium L-Lactate	Sigma-Aldrich	L7022
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
Syringe Filter, PVDF 0.45 µm 30mm diameter	CELLTREAT	229745
Syringe, 0.5 mL	Becton Dickinson	329461
Syringe, 60 mL	Becton Dickinson	309653
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco	15250061
Tube, 15 mL	Corning	430052
Tube, 50 mL	Corning	430290
Water Bath Tank	Corning	CLS6783	Or any water bath tank capable of heating up to 45 °C
William’s E Medium (GlutaMAX Supplement)	Gibco	32551020
Xylozine (100 mg/mL)	Vetone Anased LA	NDC13985-704-10