JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل الإنتاج والاستخدام القابل للتخصيص لمجسات الفلورسنت لوضع العلامات على الخلايا البائية الخاصة بالمستضد.

Abstract

يعد إنتاج مستضد الفلورسنت خطوة حاسمة في تحديد الخلايا البائية الخاصة بالمستضد. هنا ، قمنا بتفصيل التحضير والتنقية واستخدام مترافقات مستضد PEG الفلورية ذات الأربعة أذرع لتحديد الخلايا البائية الخاصة بالمستضد بشكل انتقائي من خلال المشاركة المتعطشة مع مستقبلات الخلايا البائية المتشابهة. باستخدام كيمياء النقر المعيارية وكيمياء مجموعة الفلوروفور المتاحة تجاريا ، أظهرنا تعدد استخدامات إعداد مترافقات PEG الفلورية المخصصة من خلال إنشاء مصفوفات مميزة للبروتين البروتيني (PLP139-151) والأنسولين ، وهما مستضدان ذاتيان مهم في نماذج الفئران للتصلب المتعدد ومرض السكري من النوع 1 ، على التوالي. تم تطوير المقايسات لكل مترافق فلوري في نموذج المرض الخاص به باستخدام قياس التدفق الخلوي. تمت مقارنة مصفوفات المستضد بالمستضد الذاتي أحادي التكافؤ لتحديد فائدة التعدد على العمود الفقري PEG. أخيرا ، أوضحنا فائدة هذه المنصة من خلال عزل وتقييم استجابات الخلايا البائية المضادة للأنسولين بعد تحفيز المستضد خارج الجسم الحي. مكن وضع العلامات على الخلايا البائية الخاصة بالأنسولين من الكشف المضخم عن التغييرات في التحفيز المشترك (CD86) التي تم تخفيفها في تحليل الخلايا البائية الإجمالية. يتيح هذا التقرير معا إنتاج واستخدام مصفوفات مستضد الفلورسنت كأداة قوية لاستكشاف مجموعات الخلايا البائية.

Introduction

يلعب الجهاز المناعي التكيفي دورا مهما في تطور أو تراجع العديد من الحالات المرضية ، بما في ذلك المناعة الذاتية والسرطان والأمراض المعدية1. بالنسبة للتطبيقات الواسعة بما في ذلك دراسة علم الأمراض المناعية أو تطوير علاجات دقيقة جديدة ، غالبا ما يكون من الأهمية بمكان تقييم استجابات الخلايا البائية والتائية الخاصة بالمستضد الكامنة وراء تطور المرض2،3،4. تتوفر رباعيات مركب التوافق النسيجي الرئيسي (MHC) على نطاق واسع وتجاري لتحديد استنساخ الخلايا التائية الخاصة بالمستضد5. تقدم هذه التركيبات المسماة بالفلوروفور مجمعات الببتيد -معقد التوافق النسيجي الكبير رباعية التكافؤ للتفاعل بشغف مع مستقبلات الخلايا التائية المتشابهة لتطبيقات وضع العلامات مثل الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي.

يمكن أن تقدم المستضدات لاستجواب الخلايا البائية أوزانا جزيئية وشحنات وقابلية للذوبان متنوعةللغاية 6،7. عند استخدام مستضد أحادي كمجسات للخلايا البائية القابلة للذوبان ، قد لا يتم تثبيت خصائص المستضد الفيزيائي الكيميائي من خلال التركيب مع جزيء الستربتافيدين الأكبر حجما القابل للذوبان في الماء ، أو يمكن أن يمثل مشكلات في الذوبان ككواشف أحادية قبل الاقتران. وبالتالي ، فإن بعض البروتينات تمثل صعوبات في الاقتران الحيوي ونتائج غير متوقعة في الممارسةالعملية 7،8. يمكن أن يؤدي اقتران صبغة الفلورسنت المباشر في بعض الأحيان إلى جعل التركيبات غير قابلة للذوبان في الماء ومحبة للدهون. هذه المركبات الصبغية المستضد المباشرة عرضة للتضمين غير المحدد داخل أغشية الخلايا ، مما يؤدي إلى إرباك التحليلات الخاصة بالمستضد7،8،9. تغلبت بعض الاستراتيجيات على تحديات الذوبان عن طريق اقتران المستضد والفلوروفورات مع مجموعات وظيفية أخرى. Cambier et al. ، على سبيل المثال ، استخدم الأنسولين البيوتينيل في شكله الأصلي للتفاعل مع مستقبلات الخلايا البائية الخاصة بالأنسولين (BCRs) قبل إضافة الستربتافيدين المسمى بالفلوروفور بطريقةتدريجية 10. في حين أن هذا النهج مكن من تقييم الخلايا البائية التي ترتبط بالأنسولين الأحادي بدقة عالية ، كانت هناك حاجة إلى خطوتين لوضع العلامات. سيكون البروتوكول القابل للتعميم لإعداد مجسات الخلايا البائية الجاهزة للاستخدام القائمة على البوليمر والتي يتم دمجها بسهولة مع إجراءات وضع العلامات على الأجسام المضادة الفلورية الشائعة مفيدا لتعزيز دراسة الخلايا البائية في المرض.

في هذا البروتوكول ، نقوم بتفصيل إنتاج واستخدام مصفوفات مستضد الفلورسنت (FAAs) لوضع العلامات القابلة للتعميم والخطوة الواحدة للخلايا البائية الخاصة بالمستضد لتجارب الفحص المجهري وقياس التدفق الخلوي (الشكل 1). تم استخدام مصفوفات المستضدات القابلة للذوبان (SAgAs) على مدار العقد الماضي كعلاجات مناعية خاصة بالمستضد تستهدف الخلايا البائية ضد أمراض المناعة الذاتية11،12،13،14،15،16،17،18،19،20،21،22. تستفيد SAgAs من عرض المستضد متعدد التكافؤ على العمود الفقري البوليمري المرن لإشراك مستقبلات الخلايا البائية بشغف واستنباط تأثيرات معدلة للمناعة ، على الرغم من أن خصوصية المستضد توفر فرصة أخرى لاستكشاف الخلايا البائية ذات الأهمية عند اقترانها بالفلوروفور23. تمنح العمود الفقري البوليمري الذي يشكل SAgAs قابلية الذوبان في الماء للجزيء الحيوي الكلي ويمكن أن يخفف من خصائص المستضد المتطرفة في بعض الأحيان التي تربك توليد المسبار وخصوصيةالتلوين 6،24. لقد قمنا بتطعيم العديد من المستضدات التي تتراوح في الحجم والتعقيد على منصة SAgA باستخدام كيمياء النقر المعيارية ، مما يساعد على استخدام حواتم الببتيد الصغيرة والبروتينات الكاملة14،18. هنا ، نوضح FAAs كأدوات قوية لوضع العلامات على الخلايا البائية الخاصة بالمستضد والتي يمكن استخدامها بالتوازي مع وضع العلامات النموذجية على الأجسام المضادة الفلورية. قمنا بإعداد وتقييم FAAs التي تتكون من الأنسولين البشري لوضع العلامات على الخلايا البائية في نموذج فأر معدل وراثيا لمرض السكري من النوع 1 (VH125) ، بالإضافة إلى FAAs التي تضمنت بروتين البروتينات 139-151 (PLP) ، وهو حاتم الببتيد لالتهاب الدماغ والنخاع المناعي الذاتي التجريبي (EAE) ، نموذج الفأر للتصلب المتعدد. كان هدفنا في استخدام نماذج الأمراض هذه هو إثبات تعدد استخدامات هذه المنصة ، سواء من أجل الاستبدال المعياري للمستضدات المستخدمة ، بالإضافة إلى جدوى الاستخدام مع حواتم الببتيد (PLP) والبروتينات الكاملة (الأنسولين) على حد سواء. يتم تقديم هذا البروتوكول بغرض إمكانية الوصول ، دون الحاجة إلى خبرة واسعة في الاقتران الحيوي. تم تصميم الكواشف ، بالإضافة إلى طرق التوليف والتنقية ، لتكون متعددة الاستخدامات ويتم تنفيذها بسهولة في معظم مختبرات الأبحاث التي تركز على الكيمياء أو البيولوجيا الجزيئية أو علم المناعة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية الممثلة في هذا العمل من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه في جامعة كانساس.

1. تخليق مصفوفة المستضد (4-6 أيام)

  1. وظيفية المستضد غير المعدل بمقبض ألكين (1 ساعة). أضف 1 أنسولين مكافئ (100 مجم ، 17.4 ميكرولتر) إلى قارورة زجاجية سعة 20 مل مع قضيب تقليب وقم بإذابة ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي (DMSO) (2 مل) مع تسخين لطيف إلى 40-50 درجة مئوية باستخدام مسدس حراري أو حمام مائي.
    1. أضف 1،1،3،3-رباعي ميثيل جوانيدين (40.2 مجم ، 348.8 ميكرومول) و 1.35 ما يعادلها طازجا 78.5 ملي مولار بروبارجيل N-هيدروكسي سوكسينيميد إستر (NHS-ester) في DMSO اللامائي (0.3 مل ، 5.3 مجم ، 23.6 ميكرومول).
    2. قلبي لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم اروي التفاعل بنسبة 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك (12 مل).
  2. تنقية الأنسولين الألكين المعدل منفردا عن طريق كروماتوغرافيا السائل العكسي (4 ساعات). استخدم عمودا تحضيريا C18 (19 مم × 250 مم ، حجم المسام 300 A ، حجم الجسيمات 5 ميكرومتر) مع تدرج 10 دقائق 30-40٪ B (A ، ماء مع 0.05٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك (TFA) ؛ B ، الأسيتونيتريل مع 0.05٪ TFA) ومعدل تدفق 14 مل / دقيقة. يذوب المنتج المطلوب مباشرة بعد الأنسولين غير المعدل.
    1. تبخر الأسيتونيتريل و TFA عن طريق تيار غاز النيتروجين أو التبخر الدوار تحت ضغط منخفض (650 باسكال) والدوران عند 150 دورة في الدقيقة. قم بتجميد المحلول المائي وتجميد الدهون حتى الجفاف. قم بتخزين الأنسولين الوظيفي عند -20 درجة مئوية تحت جو جاف.
      ملاحظة: الأنسولين الوظيفي مستقر لمدة تصل إلى عام في ظل ظروف التخزين هذه.
  3. قم بتصنيع مصفوفة المستضد عن طريق الإضافة الحلقية المحفزة بالنحاس والأزيد الألكين (CuAAC) (2.5 ساعة) 22. أضف 6 مكافئات من الأنسولين الألكين (38 مجم ، 6.3 ميكرومول) إلى قارورة زجاجية سعة 10 مل مع قضيب تقليب وتذوب في DMSO (1.2 مل) مع تسخين لطيف.
    1. أضف 50 ملي مولار من فوسفات الصوديوم (1.8 مل) درجة الحموضة 7.4 ، 1 ما يعادل 20 كيلو دالتون أزيد PEG رباعي الأذرع (21 مجم ، 1.05 ميكرومول) ، كبريتات النحاس (II) خماسي هيدرات (3.15 مجم ، 12.6 ميكرول) ، تريس (3-هيدروكسي بروبيل تريازوليل ميثيل) أمين (27.37 مجم ، 63 ميكرول) ، وأسكوبات الصوديوم (50.34 مجم ، 254 ميكرومول).
    2. قلبي لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة ثم أضيفي DMSO (3 مل) لإذابة أي رواسب وتحمض المحلول بنسبة 0.05٪ حمض الهيدروكلوريك (4 مل).
  4. تنقية مصفوفة المستضد عن طريق كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي (3 ساعات). استخدم عمودا تحضيريا C18 (19 مم × 250 مم ، حجم المسام 300 أمبير ، حجم الجسيمات 5 ميكرومتر) مع تدرج 10 دقائق 20-60٪ B (A ، ماء مع 0.05٪ TFA ؛ B ، أسيتونيتريل مع 0.05٪ TFA) ومعدل تدفق 14 مل / دقيقة. يمحأ المنتج المطلوب مباشرة بعد الأنسولين الألكين.
    1. تبخر الأسيتونيتريل عن طريق تيار غاز النيتروجين أو التبخر الدوار تحت ضغط منخفض. قم بتجميد المحلول المائي وتجميد الدهون حتى الجفاف. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية تحت جو جاف.
      ملاحظة: مجموعة مستضد الأنسولين استرطابية للغاية. قد تتجمع الألياف المجففة بالتجميد في حبيبات كثيفة بعد التعرض المتكرر للغلاف الجوي. قد تختلف خصائص FAA اعتمادا على المستضد المستخدم الخاص بالتطبيق. مجموعة مستضد الأنسولين مستقرة لعدة أشهر في ظل ظروف التخزين هذه.

2. اقتران الفلوروفور (1-2 أيام)

  1. اقتران الفلوروفور مع مصفوفة المستضد (2.5 ساعة). أضف 1 أنسولين رباعي التكافؤ مكافئ (21.7 مجم ، 0.5 ميكرومول) إلى قارورة زجاجية سعة 20 مل مع قضيب تقليب وقم بإذابة DMSO (1.75 مل) مع تسخين لطيف. أضف 100 ملي مولار من الكربونات المؤقتة (8 مل) درجة الحموضة 9.0 و 5 مكافئات من إيزوثيوسيانات الفلوريسين في محلول مخزون طازج 10 ملي في DMSO (0.25 مل ، 0.97 مجم ، 2.5 ميكرومول). يقلب لمدة 2 ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة.
  2. تنقية المنتج عن طريق غسيل الكلى (24 ساعة). استخدم أنبوب غسيل الكلى بالوزن الجزيئي 3.5 كيلو دالتون في دلو مقلوب سعة 5 لتر مع الماء المقطر في الظلام في درجة حرارة الغرفة. غسيل الكلى لمدة 24 ساعة وتغيير محلول غسيل الكلى كل 6-12 ساعة.
  3. قم بتجميد المحلول المخلل وتجفيفه حتى يجف للحصول على FAA. يحفظ في الظلام تحت جو جاف عند -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: إدارة الطيران الفيدرالية (FAA) مستقرة لعدة أشهر في ظل ظروف التخزين هذه.

3. توصيف إدارة الطيران الفيدرالية (2-4 ساعات)

  1. تحليل نواتج الخطوتين 1 و 2 عن طريق الرحلان الكهربائي لجل دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد وفقا ل Laemmli25 (2 ساعة). تحضير عينات تحتوي على 5 ميكروغرام من المستضد أحادي التكافؤ المنقى ، و 20 كيلو دالتون أزيد PEG رباعي الأذرع ، ومجموعة المستضد ، و FAA.
    1. تصور وضع العلامات على الفلوروفور في عينات إدارة الطيران الفيدرالية (FAA) عن طريق التصوير الفلوري في جهاز تصوير هلامي.
    2. قم بإجراء تلطيخ Coomassie الأزرق26 لتصور المستضد.
    3. قم بتلطيخ اليود27 لتصور العمود الفقري PEG. اشطف الجل بالماء المقطر (3 × 2 دقيقة) ، واحتضنه في محلول كلوريد الباريوم بنسبة 5٪ (20 مل) لمدة 10 دقائق ، ثم اشطفه بالماء المقطر (3 × 2 دقيقة) ، واحتضنه في محلول اليود 0.1 نيوتن (20 مل) لمدة دقيقة واحدة ، ثم اشطفه بالماء المقطر (3 × 2 دقيقة) لإزالة تلطيخ الخلفية قبل التصور.
      ملاحظة: لصنع محلول اليود 0.1 نيوتن ، أضف يوديد البوتاسيوم (2.0 جم ، 12 ملليمول) واليود (1.27 جم ، 5 ملليمول) إلى 100 مل من الماء المقطر.
  2. احسب درجة وضع العلامات على الصبغة عن طريق التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية والبصرية (1 ساعة). قم بإذابة كمية صغيرة من FAA عند 0.1 مجم / مل وسجل الامتصاص عند 280 نانومتر وذروة الطول الموجي للامتصاص للصبغة. الحصول على معاملات الانقراض المولي للمستضد والصبغة.
    ملاحظة: بعض الأصباغ حساسة لدرجة الحموضة. تأكد من استخدام محلول مخزن مؤقت بشكل مناسب مثل 100 ملي مولار من الكربونات مع درجة الحموضة 8.3 عند قياس امتصاص FAA للتأكد من دقة معامل انقراض الصبغة المبلغ عنه.
    1. قم بإجراء الحساب التالي28 حيث ADye ، maxλ هو امتصاص FAA عند ذروة الطول الموجي للامتصاص للصبغة ، EDye ، maxλ هو معامل الانقراض المولي عند ذروة الطول الموجي للامتصاص للصبغة ،ومستضد E ، 280 نانومتر هو معامل الانقراض المولي للمستضد أحادي التكافؤ عند 280 نانومتر.:
      عامل التصحيح (CF) =صبغة ، 280 نانومتر /صبغة ، بحد أقصى 0.25 * (صبغة ، صبغة maxλ / E، maxλ) * (مستضد E ، 280 نانومتر / (A280 نانومتر - (صبغة، maxλ * CF))) = صبغة / FAA
  3. تحليل إدارة الطيران الفيدرالية (FAA) بحثا عن صبغة مجانية أو منتجات تحلل محتملة بواسطة RP-HPLC (1 ساعة).
    1. قم بإذابة كمية صغيرة من FAA عند 1.0 مجم / مل وقم بتحليلها باستخدام عمود تحليلي C18 (4.6 مم × 150 مم ، حجم المسام 300 A ، حجم الجسيمات 2.5 ميكرومتر) باستخدام تدرج 10 دقائق من 5 إلى 95٪ B (A ، ماء يحتوي على 0.05٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك: B ، أسيتونيتريل مع 0.05٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) بمعدل تدفق 1 مل / دقيقة. اضبط كاشف UV-Vis لمراقبة الطول الموجي لامتصاص الذروة للصبغة (437 نانومتر ل FITC).
      ملاحظة: بالنسبة للأصباغ الحساسة للأس الهيدروجيني ، قد يتطلب تحليل HPLC في المذيبات المحمضة تحويل الطول الموجي المراقب من الطول الموجي لذروة امتصاص الصبغة في الظروف المائية المحايدة. في 0.05٪ TFA ، يكون الرقم الهيدروجيني حوالي 3 وتغير الحد الأقصى للامتصاص ل FITC.

4. تطوير الفحص عن طريق معايرة FAA (3-5 ساعات)

ملاحظة: يتم تقديم استخدام FAA لقياس التدفق الخلوي ، ولكن يمكن تعديل نفس الخطوات لاستخدامها في تنسيقات أخرى مثل الكيمياء المناعية أو الفحص المجهري الفلوري. عند تطبيق FAAs لتنسيق جديد ، يجب إكمال اختبار تحسين جديد. يمكن الحصول على مجموعات الخلايا المختلطة أو المعزولة من خلال طرق معالجة الدم أو الأعضاء اللمفاوية23،29. لا ينصح بالحصاد من خلال الهضم الأنزيمي للأنسجة ، حيث قد يتم التخلص من علامات سطح الخلايا.

  1. قم بتعليق مخزون FAA إلى 1 مجم / مل في مخزن FACS المؤقت (1x PBS + 5٪ مصل بقري للجنين و 0.1٪ أزيد الصوديوم). يمكن دمج ما يصل إلى 10٪ DMSO لتسريع الذوبان.
  2. احصل على خلايا إيجابية للخلايا البائية الخاصة بالمستضد ذات الأهمية وتوزيعها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. ستكون هناك حاجة إلى ما يقرب من 1 × 107 خلايا إجمالية.
    ملاحظة: تم حصاد خلايا الطحال من الفئران VH125 و EAE وفقا للبروتوكولات المعتمدة من IACUC في جامعة كانساس للعرض الحالي. يمكن للباحثين استخدام الطرق الموضحة هنا لعينات الخلايا الخاصة بتطبيقهم الخاص وإعداد FAA.
    1. توزيع 5 × 105 خلايا لتكرار ملصقات المعايرة بالتحليل الحجمي (3 نسخ مكررة على الأقل لكل معايرة بالتحليل الحجمي).
    2. قم بتوزيع 1 × 105 خلايا للتحكم في البقعة الواحدة بالإضافة إلى عنصر تحكم غير ملطخ.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأنماط التماثلية للأجسام المضادة والتألق ناقص عنصر تحكم واحد للتحقق من صحة الفحص بالكامل.
  3. اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب. جهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  4. شفط المادة الطافية وأعد تعليق كريات الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS.
  5. أضف الأجسام المضادة الفلورية CD3 و CD19 إلى كل عينة بالتركيزات الموصى بها من الشركة المصنعة ، بالإضافة إلى جرعات FAA المعايرة.
    ملاحظة: يمكن معايرة تركيزات عمل الأجسام المضادة الفلورية بشكل مستقل لتأكيد سلامة الدفعة. ستختلف نطاقات الجرعات المناسبة ل FAA حسب التطبيق ، ولكن نقطة البداية الجيدة هي 50 و 25 و 10 و 5 و 1 ميكروغرام لكل عينة. 1 ميكرولتر من محلول FAA يساوي 1 ميكروغرام من الجرعة.
  6. اخلطي كل عينة جيدا واحتضنها مغطاة بالضوء على الثلج لمدة 30 دقيقة.
  7. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا بإضافة 1 مل من المخزن المؤقت FACS إلى كل أنبوب. الطرد المركزي العينات عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  8. قم بشفط المادة الطافية وكرر الغسيل بإضافة 1 مل من محلول FACS إلى كل أنبوب. الطرد المركزي العينات عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  9. استنشاق المادة الطافية وإعادة تعليق العينات في 200 ميكرولتر من محلول FACS الجديد. ضع العينات على الثلج وتوجه إلى مقياس الخلوي.
  10. قم بتشغيل العينات على مقياس الخلايا واجمع ما لا يقل عن 50,000 حدث.

5. تحليل المعايرة بالتحليل الحجمي FAA وتحسين جرعة الملصقات (1-2 ساعة)

  1. باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي ، بوابة للخلايا المفردة.
  2. في الخلايا المفردة ، ضع بوابات ل CD19 + (الخلايا البائية) و CD3 + (الخلايا التائية).
  3. ضمن المجموعات الأصلية CD19 + و CD3 + ، بوابة لأحداث FAA + في قناة الفلوروكروم ذات الصلة.
  4. سجل النسبة المئوية لأحداث FAA+ داخل المجموعات الأصلية CD19+ و CD3+.
  5. احسب نسبة الخصوصية بقسمة نسبة أحداث FAA + في مجموعة CD19 + (محددة) على نسبة أحداث FAA + في مجموعة CD3 + (غير محددة). يجب تعظيم نسبة الخصوصية لاستخدام FAA بنجاح.
  6. استخدم جرعة الملصقات المقابلة لأعلى نسبة خصوصية للتجارب المستقبلية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

عادة ما يتراوح العائد المنقى للأنسولين الألكين (الشكل 2 ، اللوحة العلوية) ، المحدد حسب الوزن ، من 50-65٪. من المحتمل أن تكون الغلة التي تقل عن 40٪ ناتجة عن تلوث المياه في DMSO اللامائي أو التحلل المائي ل propargyl NHS-ester. بالنسبة لتعدد المستضد (الشكل 1 ب)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

قمنا بتطوير بروتوكول (الشكل 1) لإنشاء FAAs مخصصة لتحديد الخلايا البائية الخاصة بالمستضد ، وتبسيط توليد مجسات الخلايا البائية لأهداف المستضد الصعبة. اخترنا بوليمرات PEG ذات 4 أذرع مع مجموعات أزيد طرفية كركيزة سهلة لبناء FAAs ، حيث يمنح PEG قابلية الذوبان في الماء...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

CJB هو المؤسس المشارك لشركة Orion Bioscience، Inc. ، وهي شركة ترخص تقنية SAgA للتحقيق في استخداماتها العلاجية. يستند هذا التقرير إلى العمل المدعوم من قبل برنامج أبحاث الدراسات العليا التابع لمؤسسة العلوم الوطنية بموجب المنحة رقم 1946099. أي آراء أو نتائج أو استنتاجات أو توصيات يتم التعبير عنها في هذه المادة هي آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة وجهات نظر المؤسسة الوطنية للعلوم.

Acknowledgements

نشكر كوليت ووستر على المساعدة في جمع البيانات. تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة PhRMA (JDG) ، وبرنامج زمالة أبحاث الخريجين التابع للمؤسسة الوطنية للعلوم (KDA) ، ومنح المعاهد الوطنية للصحة R21AI143407 و R21AI144408 و DP5OD023118.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

References

  1. Murphy, K., Weaver, C. Janeway's Immunobiology. , Garland Science. (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008(2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440(2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719(2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. Davis, W. C. , Humana Press. Totowa, NJ. 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

PEG 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved