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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive in dettaglio la produzione e l'uso personalizzabili di sonde fluorescenti per la marcatura delle cellule B antigene-specifiche.

Abstract

La produzione di antigeni fluorescenti è un passaggio fondamentale nell'identificazione delle cellule B antigene-specifiche. Qui, abbiamo dettagliato la preparazione, la purificazione e l'uso di coniugati PEG-antigene fluorescenti a quattro bracci per identificare selettivamente le cellule B antigene-specifiche attraverso l'impegno avido con i recettori delle cellule B affini. Utilizzando la chimica modulare a scatto e i kit chimici fluorofori disponibili in commercio, abbiamo dimostrato la versatilità della preparazione di coniugati PEG fluorescenti personalizzati creando array distinti per la proteina proteolipide (PLP139-151) e l'insulina, che sono importanti autoantigeni rispettivamente nei modelli murini di sclerosi multipla e diabete di tipo 1. Sono stati sviluppati saggi per ciascun coniugato fluorescente nel rispettivo modello di malattia utilizzando la citometria a flusso. Gli array di antigeni sono stati confrontati con l'autoantigene monovalente per quantificare il beneficio della multimerizzazione sulle dorsali PEG. Infine, abbiamo illustrato l'utilità di questa piattaforma isolando e valutando le risposte delle cellule B anti-insulina dopo stimolazione antigenica ex vivo. L'etichettatura delle cellule B insulino-specifiche ha permesso il rilevamento amplificato di cambiamenti nella co-stimolazione (CD86) che sarebbero stati altrimenti smorzati nell'analisi delle cellule B aggregate. Insieme, questo rapporto consente la produzione e l'uso di array di antigeni fluorescenti come strumento robusto per sondare le popolazioni di cellule B.

Introduzione

Il sistema immunitario adattativo svolge un ruolo fondamentale nella progressione o regressione di molti stati patologici, tra cui l'autoimmunità, il cancro e le malattie infettive1. Per applicazioni su vasta scala, tra cui lo studio dell'immunopatologia o lo sviluppo di nuovi trattamenti di precisione, è spesso fondamentale valutare le risposte delle cellule B e T antigene-specifiche alla base della progressione della malattia 2,3,4. I tetrameri del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) sono ampiamente e commercialmente disponibili per l'identificazione di cloni di cellule T antigene-specifiche5. Questi costrutti marcati con fluorofori presentano complessi peptide-MHC quadrivalenti per interagire avidamente con i recettori delle cellule T affini per applicazioni di marcatura come la microscopia e la citometria a flusso.

Gli antigeni per l'interrogazione delle cellule B possono presentare pesi, cariche e solubilità molecolari molto vari 6,7. Quando si utilizza l'antigene monomerico come sonde solubili per cellule B, le proprietà fisico-chimiche dell'antigene potrebbero non essere stabilizzate attraverso la complessazione con la molecola di streptavidina solubile in acqua, molto più grande, o potrebbero presentare problemi di solubilità come reagenti monomerici prima della coniugazione. Pertanto, alcune proteine presentano difficoltà di bioconiugazione e risultati inaspettati nella pratica 7,8. La coniugazione diretta del colorante fluorescente può talvolta rendere i costrutti insolubili in acqua e lipofili. Questi composti diretto colorante-antigene sono suscettibili all'incorporamento aspecifico all'interno delle membrane cellulari, confondendo le analisi antigene-specifiche 7,8,9. Alcune strategie hanno superato le sfide di solubilità accoppiando antigene e fluorofori con altri gruppi funzionali. Cambier et al., ad esempio, hanno impiegato l'insulina biotinilata nella sua forma nativa per interagire con i recettori delle cellule B insulino-specifiche (BCR) prima di aggiungere streptavidina marcata con fluorofori in modo graduale10. Sebbene questo approccio abbia consentito la valutazione delle cellule B che si legano all'insulina monomerica ad alta risoluzione, sono state necessarie due fasi di marcatura. Un protocollo generalizzabile per la preparazione di sonde di cellule B pronte all'uso a base di polimeri, facilmente integrabile con le comuni procedure di marcatura degli anticorpi fluorescenti, sarebbe utile per promuovere lo studio delle cellule B nella malattia.

In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la produzione e l'uso di array di antigeni fluorescenti (FAA) per la marcatura generalizzabile e in un unico passaggio di cellule B antigene-specifiche per esperimenti di microscopia e citometria a flusso (Figura 1). Gli array di antigeni solubili (SAgA) sono stati impiegati nell'ultimo decennio come immunoterapie antigene-specifiche mirate alle cellule B contro le malattie autoimmuni 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Le SAgA sfruttano il display multivalente dell'antigene su dorsali polimeriche flessibili per coinvolgere avidamente i recettori delle cellule B e suscitare effetti immunomodulatori, sebbene la loro specificità dell'antigene fornisca un'altra opportunità per sondare le cellule B di interesse quando accoppiate a un fluoroforo23. Le dorsali polimeriche che costituiscono le SAgA conferiscono solubilità in acqua alla biomacromolecola complessiva e possono smorzare le caratteristiche dell'antigene, a volte estreme, che confondono la generazione della sonda e la specificità della colorazione 6,24. Abbiamo innestato numerosi antigeni di dimensioni e complessità variabili sulla piattaforma SAgA utilizzando la chimica modulare a clic, che favorisce l'uso di piccoli epitopi peptidici e proteine complete14,18. Qui, dimostriamo che i FAA sono robusti strumenti di marcatura delle cellule B antigene-specifiche che possono essere utilizzati in parallelo con la tipica marcatura degli anticorpi fluorescenti. Abbiamo preparato e valutato FAA costituiti da insulina umana per la marcatura delle cellule B in un modello murino transgenico di diabete di tipo 1 (VH125), nonché FAA che incorporavano la proteina proteolipide 139-151 (PLP), un epitopo peptidico per l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE), il modello murino della sclerosi multipla. La nostra intenzione nell'impiegare questi modelli di malattia era quella di dimostrare la versatilità di questa piattaforma, sia per la sostituzione modulare degli antigeni utilizzati, sia per la fattibilità dell'uso con epitopi peptidici (PLP) e proteine complete (insulina). Questo protocollo è presentato con l'obiettivo dell'accessibilità, senza che siano necessarie competenze approfondite in materia di bioconiugazione. I reagenti, così come i metodi di sintesi e purificazione, sono progettati per essere versatili e facilmente implementabili nella maggior parte dei laboratori di ricerca focalizzati in chimica, biologia molecolare o immunologia.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali rappresentate in questo lavoro sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Kansas.

1. Sintesi dell'array di antigeni (4-6 giorni)

  1. Funzionalizzare l'antigene non modificato con un manico alchino (1 h). Aggiungere 1 insulina equivalente (100 mg, 17,4 μmol) in un flaconcino di vetro da 20 ml con una barra di agitazione e sciogliere in dimetilsolfossido anidro (DMSO) (2 mL) con un leggero riscaldamento a 40-50 °C utilizzando una pistola termica o un bagnomaria.
    1. Aggiungere 1,1,3,3-tetrametilguanidina (40,2 mg, 348,8 μmol) e 1,35 equivalenti 78,5 mM di propargil N-idrossisuccinimide estere (NHS-estere) soluzione madre in DMSO anidro (0,3 mL, 5,3 mg, 23,6 μmol).
    2. Mescolare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi spegnere la reazione con HCl allo 0,05% (12 mL).
  2. Purificare l'insulino-alchino singolarmente modificato mediante cromatografia liquida in fase inversa (4 ore). Utilizzare una colonna preparativa C18 (19 mm x 250 mm, dimensione dei pori 300 A, dimensione delle particelle 5 μm) con un gradiente B di 10 minuti 30-40% (A, acqua con acido trifluoroacetico (TFA) allo 0,05%); B, acetonitrile con 0,05% TFA) e una portata di 14 mL/min. Il prodotto desiderato eluisce immediatamente dopo l'insulina non modificata.
    1. Evaporare l'acetonitrile e il TFA mediante flusso di azoto gassoso o evaporazione rotativa a pressione ridotta (650 Pascal) e rotante a 150 giri/min. Congelare la soluzione acquosa e liofilizzare fino a quando non sarà a secco. Conservare l'insulina funzionalizzata a -20 °C in atmosfera secca.
      NOTA: L'insulina funzionalizzata è stabile fino a un anno in queste condizioni di conservazione.
  3. Sintetizzare l'array di antigeni mediante cicloaddizione azide-alchino catalizzata dal rame (CuAAC) (2,5 h)22. Aggiungere 6 equivalenti di insulino-alchino (38 mg, 6,3 μmol) a un flaconcino di vetro da 10 mL con una barra di agitazione e sciogliere in DMSO (1,2 mL) con un leggero riscaldamento.
    1. Aggiungere 50 mM di tampone fosfato di sodio (1,8 mL) pH 7,4, 1 equivalente 20 kDa di PEG azide a 4 bracci (21 mg, 1,05 μmol), solfato di rame (II) pentaidrato (3,15 mg, 12,6 μmol), Tris(3-idrossipropiltriazolilmetil)ammina (27,37 mg, 63 μmol) e ascorbato di sodio (50,34 mg, 254 μmol).
    2. Agitare per 2 ore a temperatura ambiente, quindi aggiungere DMSO (3 mL) per solubilizzare eventuali precipitati e acidificare la soluzione con HCl (4 mL) allo 0,05%.
  4. Purificare l'array di antigeni mediante cromatografia liquida in fase inversa (3 ore). Utilizzare una colonna preparativa C18 (19 mm x 250 mm, dimensione dei pori 300 A, dimensione delle particelle 5 μm) con un gradiente B di 10 minuti 20-60% (A, acqua con 0,05% TFA; B, acetonitrile con 0,05% TFA) e una portata di 14 ml/min. Il prodotto desiderato eluisce immediatamente dopo l'insulina-alchino.
    1. Evaporare l'acetonitrile mediante flusso di azoto gassoso o evaporazione rotativa a pressione ridotta. Congelare la soluzione acquosa e liofilizzare fino a quando non sarà a secco. Conservare a -20 °C in atmosfera asciutta.
      NOTA: L'array di antigeni dell'insulina è altamente igroscopico. Le fibre liofilizzate possono fondersi in un pellet denso dopo ripetute esposizioni all'atmosfera. Le proprietà FAA possono variare a seconda dell'antigene specifico per l'applicazione utilizzato. L'array di antigeni dell'insulina è stabile per diversi mesi in queste condizioni di conservazione.

2. Coniugazione dei fluorofori (1-2 giorni)

  1. Coniugare il fluoroforo all'array di antigeni (2,5 ore). Aggiungere 1 insulina tetravalente equivalente (21,7 mg, 0,5 μmol) in un flaconcino di vetro da 20 mL con ancoretta e sciogliere in DMSO (1,75 mL) con un leggero riscaldamento. Aggiungere 100 mM di tampone carbonato (8 mL) appena preparato a pH 9,0 e 5 equivalenti di isotiocianato di fluoresceina in una soluzione madre da 10 mM appena preparata in DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Mescolare per 2 ore al buio a temperatura ambiente.
  2. Purificare il prodotto mediante dialisi (24 h). Utilizzare un tubo per dialisi con taglio del peso molecolare da 3,5 kDa in un secchio da 5 L agitato con acqua distillata al buio a temperatura ambiente. Dializzare per 24 ore e cambiare la soluzione di dialisi ogni 6-12 ore.
  3. Congelare la soluzione dializzata e liofilizzare fino a secchezza per produrre il FAA. Conservare al buio in atmosfera asciutta a -20 °C.
    NOTA: La FAA è stabile per diversi mesi in queste condizioni di conservazione.

3. Caratterizzazione FAA (2-4 ore)

  1. Analizzare i prodotti delle fasi 1 e 2 mediante elettroforesi su gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide secondo Laemmli25 (2 h). Preparare campioni contenenti 5 μg di antigene monovalente purificato, 20 kDa di azide PEG a 4 bracci, array di antigeni e FAA.
    1. Visualizzazione della marcatura dei fluorofori nei campioni FAA mediante imaging a fluorescenza in un gel-imager.
    2. Eseguire la colorazione blu Coomassie26 per visualizzare l'antigene.
    3. Eseguire la colorazione con iodio27 per visualizzare la spina dorsale PEG. Sciacquare il gel in acqua distillata (3 x 2 min), incubare in una soluzione di cloruro di bario al 5% (20 mL) per 10 min, risciacquare in acqua distillata (3 x 2 min), incubare in una soluzione di iodio 0,1 N (20 mL) per 1 min, quindi risciacquare in acqua distillata (3 x 2 min) per rimuovere le macchie di fondo prima della visualizzazione.
      NOTA: Per preparare una soluzione di iodio 0,1 N, aggiungere ioduro di potassio (2,0 g, 12 mmol) e iodio (1,27 g, 5 mmol) a 100 ml di acqua distillata.
  2. Calcolare il grado di marcatura del colorante mediante spettroscopia UV-Vis (1 ora). Sciogliere una piccola quantità di FAA a 0,1 mg/mL e registrare l'assorbanza a 280 nm e la lunghezza d'onda di assorbimento di picco per il colorante. Ottenere i coefficienti di estinzione molare per l'antigene e il colorante.
    NOTA: Alcuni coloranti sono sensibili al pH. Assicurarsi di utilizzare una soluzione tamponata appropriata come un tampone carbonato da 100 mM con pH 8,3 quando si misura l'assorbanza FAA per assicurarsi che il coefficiente di estinzione del colorante riportato sia accurato.
    1. Eseguire il seguente calcolo28 dove ADye, maxλ è l'assorbanza FAA alla lunghezza d'onda di assorbimento di picco per il colorante, EDye, maxλ è il coefficiente di estinzione molare alla lunghezza d'onda di assorbimento di picco per il colorante eE antigene, 280 nm è il coefficiente di estinzione molare per l'antigene monovalente a 280 nm.:
      Fattore di correzione (CF) =A colorante, 280 nm /A colorante, maxλ 0,25 * (A colorante, maxλ /E colorante, maxλ) * (E antigene, 280 nm / (A280 nm – (A colorante, maxλ * CF))) = colorante/FAA
  3. Analizzare la FAA per coloranti liberi o prodotti di potenziale degradazione mediante RP-HPLC (1 h).
    1. Sciogliere una piccola quantità di FAA a 1,0 mg/mL e analizzare con una colonna analitica C18 (4,6 mm x 150 mm, dimensione dei pori 300 A, dimensione delle particelle 2,5 μm) utilizzando un gradiente B di 10 minuti 5-95% (A, acqua con acido trifluoroacetico allo 0,05%: B, acetonitrile con acido trifluoroacetico allo 0,05%) con una velocità di flusso di 1 mL/min. Impostare il rivelatore UV-Vis per monitorare la lunghezza d'onda di assorbanza di picco del colorante (437 nm per FITC).
      NOTA: Per i coloranti sensibili al pH, l'analisi HPLC in solventi acidificati può richiedere lo spostamento della lunghezza d'onda monitorata dalla lunghezza d'onda di assorbimento di picco del colorante in condizioni acquose neutre. Nello 0,05% di TFA, il pH è di circa 3 e l'assorbimento massimo per FITC è cambiato.

4. Sviluppo del saggio mediante titolazione FAA (3-5 ore)

NOTA: Viene presentato l'uso della FAA per la citometria a flusso, ma gli stessi passaggi possono essere modificati per l'uso in altri formati come l'immunoistochimica o la microscopia a fluorescenza. Quando si applicano le FAA per un nuovo formato, è necessario completare un nuovo test di ottimizzazione. Popolazioni cellulari miste o isolate possono essere ottenute attraverso metodi di elaborazione del sangue o degli organi linfoidi23,29. Il prelievo attraverso la digestione enzimatica del tessuto non è raccomandato, poiché i marcatori della superficie cellulare possono essere eliminati.

  1. Sospendere il brodo FAA a 1 mg/mL nel tampone FACS (1x PBS + 5% di siero fetale bovino e 0,1% di sodio azide). È possibile incorporare fino al 10% di DMSO per accelerare la dissoluzione.
  2. Ottenere cellule positive per le cellule B antigene-specifiche di interesse e somministrarle in provette da microcentrifuga. Saranno necessarie circa 1 x 107 celle totali.
    NOTA: Gli splenociti sono stati raccolti da topi VH125 ed EAE secondo i protocolli approvati dall'IACUC presso l'Università del Kansas per la presente dimostrazione. I ricercatori possono utilizzare i metodi qui descritti per campioni di cellule specifici per la propria applicazione e preparazione FAA.
    1. Erogare 5 x 105 cellule per l'etichettatura delle repliche di titolazione (almeno 3 repliche per titolazione).
    2. Erogare 1 x 105 celle per controlli a colorazione singola e un controllo non colorato.
      NOTA: Gli isotipi degli anticorpi e la fluorescenza meno un controllo possono essere utilizzati anche per convalidare completamente il test.
  3. Lavare le celle aggiungendo 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
  4. Aspirare il surnatante e risospendere i pellet cellulari in 50 μl di tampone FACS.
  5. Aggiungere anticorpi fluorescenti CD3 e CD19 a ciascun campione alle concentrazioni raccomandate dal produttore, nonché alle dosi FAA titolate.
    NOTA: Le concentrazioni di lavoro degli anticorpi fluorescenti possono essere titolate in modo indipendente per confermare l'integrità del lotto. Gli intervalli di dose FAA appropriati variano in base all'applicazione, ma un buon punto di partenza è 50, 25, 10, 5 e 1 μg per campione. 1 μL di soluzione madre di FAA equivale a 1 μg di dose.
  6. Mescolare bene ogni campione e incubare coperto dalla luce, su ghiaccio per 30 minuti.
  7. Dopo l'incubazione, lavare le cellule aggiungendo 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. Centrifugare i campioni a 200 x g per 5 minuti.
  8. Aspirare il surnatante e ripetere il lavaggio aggiungendo 1 mL di tampone FACS a ciascuna provetta. Centrifugare i campioni a 200 x g per 5 minuti.
  9. Aspirare il surnatante e risospendere i campioni in 200 μl di tampone FACS fresco. Posizionare i campioni sul ghiaccio e dirigersi verso il citometro.
  10. Esegui i campioni sul citometro e raccogli almeno 50.000 eventi.

5. Analisi della titolazione FAA e ottimizzazione della dose di marcatura (1-2 ore)

  1. Utilizzo del software di analisi della citometria a flusso, gate per singole cellule.
  2. Su singole cellule, posizionare i cancelli per CD19+ (cellule B) e CD3+ (cellule T).
  3. All'interno delle popolazioni parentali CD19+ e CD3+, gate per eventi FAA+ nel canale fluorocromo pertinente.
  4. Registrare la percentuale di eventi FAA+ all'interno delle popolazioni parentali CD19+ e CD3+.
  5. Calcola un rapporto di specificità dividendo la proporzione di eventi FAA+ nella popolazione CD19+ (specifica) per la proporzione di eventi FAA+ nella popolazione CD3+ (non specifica). Il rapporto di specificità dovrebbe essere massimizzato per un uso efficace della FAA.
  6. Utilizzare la dose di marcatura corrispondente al rapporto di specificità più alto per esperimenti futuri.

Risultati

La resa purificata di insulino-alchino (Figura 2, pannello superiore), determinata dal peso, variava tipicamente dal 50 al 65%. Rese inferiori al 40% sono state probabilmente causate dalla contaminazione dell'acqua nel DMSO anidro e/o dall'idrolisi dell'estere NHS del propargilico. Per la multimerizzazione dell'antigene (Figura 1B), la resa purificata dell'array di antigeni dell'insulina (Figura 2, ...

Discussione

Abbiamo sviluppato un protocollo (Figura 1) per costruire FAA personalizzati per l'identificazione delle cellule B antigene-specifiche, semplificando la generazione di sonde di cellule B per bersagli antigenici difficili. Abbiamo selezionato polimeri PEG a 4 bracci con gruppi azidici terminali come substrato facile per la costruzione di FAA, poiché il PEG conferisce solubilità in acqua mentre le maniglie funzionali dell'azide consentono semplici reazioni d...

Divulgazioni

CJB è co-fondatore di Orion Bioscience, Inc., una società che concede in licenza la tecnologia SAgA per studiarne gli usi terapeutici. Questo rapporto si basa sul lavoro sostenuto dal National Science Foundation Graduate Research Program nell'ambito della sovvenzione n. 1946099. Tutte le opinioni, i risultati, le conclusioni o le raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation.

Riconoscimenti

Ringraziamo Colette Worcester per l'aiuto nella raccolta dei dati. Questo lavoro è stato sostenuto dalla PhRMA Foundation (JDG), dal National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (KDA) e dalle sovvenzioni NIH R21AI143407, R21AI144408 e DP5OD023118.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

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