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  • Resultados
  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Este protocolo detalla la producción y el uso personalizables de sondas fluorescentes para el marcaje de células B específicas de antígeno.

Resumen

La producción de antígeno fluorescente es un paso crítico en la identificación de células B específicas de antígeno. Aquí, detallamos la preparación, purificación y el uso de conjugados de antígeno PEG fluorescentes de cuatro brazos para identificar selectivamente células B específicas de antígeno a través de la interacción ávida con receptores de células B afines. Utilizando la química de clic modular y los productos químicos de los kits de fluoróforos disponibles en el mercado, demostramos la versatilidad de la preparación de conjugados PEG fluorescentes personalizados mediante la creación de matrices distintas para la proteína proteolípida (PLP139-151) y la insulina, que son autoantígenos importantes en modelos murinos de esclerosis múltiple y diabetes tipo 1, respectivamente. Se desarrollaron ensayos para cada conjugado fluorescente en su respectivo modelo de enfermedad mediante citometría de flujo. Las matrices de antígenos se compararon con el autoantígeno monovalente para cuantificar el beneficio de la multimerización en las redes troncales de PEG. Finalmente, ilustramos la utilidad de esta plataforma mediante el aislamiento y la evaluación de las respuestas de las células B anti-insulina después de la estimulación de antígenos ex vivo. El marcaje de las células B específicas de insulina permitió la detección amplificada de cambios en la coestimulación (CD86) que, de otro modo, se amortiguarían en el análisis de células B agregadas. En conjunto, este informe permite la producción y el uso de matrices de antígenos fluorescentes como una herramienta robusta para sondear las poblaciones de células B.

Introducción

El sistema inmunitario adaptativo desempeña un papel fundamental en la progresión o regresión de muchos estados patológicos, como la autoinmunidad, el cáncery las enfermedades infecciosas. Para aplicaciones amplias, como el estudio de la inmunopatología o el desarrollo de nuevos tratamientos de precisión, a menudo es fundamental evaluar las respuestas de los linfocitos B y T específicos del antígeno que subyacen a la progresión de la enfermedad 2,3,4. Los tetrámeros del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) están ampliamente disponibles y comercialmente para identificar clones de linfocitos T específicos de antígeno5. Estas construcciones marcadas con fluoróforos presentan complejos de péptidos-MHC tetravalentes para interactuar ávidamente con los receptores de células T afines para aplicaciones de etiquetado como la microscopía y la citometría de flujo.

Los antígenos para la interrogación de células B pueden presentar pesos moleculares, cargas y solubilidades muy variados 6,7. Cuando se utilizan antígenos monoméricos como sondas de células B solubles, es posible que las propiedades fisicoquímicas del antígeno no se estabilicen mediante la formación de complejos con la molécula de estreptavidina soluble en agua, mucho más grande, o que presenten problemas de solubilidad como reactivos monoméricos antes de la conjugación. Así, algunas proteínas presentan dificultades de bioconjugación y resultados inesperados en la práctica 7,8. La conjugación directa de colorantes fluorescentes a veces puede hacer que las construcciones sean insolubles en agua y lipofílicas. Estos compuestos de antígeno colorante directo son susceptibles a la inclusión inespecífica dentro de las membranas celulares, lo que confunde los análisis específicos de antígeno 7,8,9. Algunas estrategias han superado los desafíos de solubilidad mediante el acoplamiento de antígenos y fluoróforos con otros grupos funcionales. Cambier et al., por ejemplo, emplearon insulina biotinilada en su forma nativa para interactuar con los receptores de células B específicos de insulina (BCR) antes de agregar estreptavidina marcada con fluoróforos de manera escalonada10. Si bien este enfoque permitió la evaluación de las células B que se unen a la insulina monomérica con alta resolución, se requirieron dos pasos de etiquetado. Un protocolo generalizable para la preparación de sondas de células B basadas en polímeros listas para usar que se integre fácilmente con los procedimientos comunes de marcaje de anticuerpos fluorescentes sería beneficioso para avanzar en el estudio de las células B en la enfermedad.

En este protocolo, detallamos la producción y el uso de matrices de antígenos fluorescentes (FAA) para el marcaje generalizable y en un solo paso de células B específicas de antígeno para experimentos de microscopía y citometría de flujo (Figura 1). Las matrices de antígenos solubles (SAgAs) se han empleado en la última década como inmunoterapias específicas de antígenos dirigidas a células B contra enfermedades autoinmunes 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Las SAgA aprovechan la visualización de antígenos multivalentes en esqueletos poliméricos flexibles para interactuar ávidamente con los receptores de las células B y provocar efectos inmunomoduladores, aunque su especificidad de antígeno ofrece otra oportunidad para sondear las células B de interés cuando se acoplan a un fluoróforo23. Los esqueletos poliméricos que constituyen SAgAs confieren solubilidad en agua a la biomacromolécula en general y pueden amortiguar las características antigénicas, a veces extremas, que confunden la generación de sondas y la especificidad de la tinción 6,24. Hemos injertado numerosos antígenos que varían en tamaño y complejidad en la plataforma SAgA utilizando química de clic modular, que es propicia para el uso de epítopos peptídicos pequeños y proteínas completas14,18. Aquí, demostramos los FAA como herramientas sólidas de etiquetado de células B específicas de antígeno que se pueden usar en paralelo con el etiquetado de anticuerpos fluorescentes típico. Preparamos y evaluamos FAAs consistentes en insulina humana para el marcaje de células B en un modelo de ratón transgénico de diabetes tipo 1 (VH125), así como FAAs que incorporaban proteína proteolípida 139-151 (PLP), un epítopo peptídico para la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), el modelo murino de la Esclerosis Múltiple. Nuestra intención al emplear estos modelos de enfermedad fue demostrar la versatilidad de esta plataforma, tanto para la sustitución modular de los antígenos utilizados, como para la viabilidad de su uso con epítopos peptídicos (PLP) y proteínas completas (insulina) por igual. Este protocolo se presenta con el propósito de accesibilidad, sin necesidad de una amplia experiencia en bioconjugación. Los reactivos, así como los métodos de síntesis y purificación, están diseñados para ser versátiles y fáciles de implementar en la mayoría de los laboratorios de investigación centrados en química, biología molecular o inmunología.

Protocolo

Todos los procedimientos con animales representados en este trabajo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kansas.

1. Síntesis de matrices de antígenos (4-6 días)

  1. Funcionalizar el antígeno no modificado con un mango de alquino (1 h). Añadir 1 insulina equivalente (100 mg, 17,4 μmol) a un vial de vidrio de 20 mL con una barra agitadora y disolver en dimetilsulfóxido anhidro (DMSO) (2 mL) con un calentamiento suave a 40-50 °C utilizando una pistola de calor o un baño de agua.
    1. Añadir 1,1,3,3-tetrametilguanidina (40,2 mg, 348,8 μmol) y 1,35 equivalentes de solución madre de 78,5 mM de propargil N-hidroxisuccinimida (NHS-ester) recién preparada en DMSO anhidro (0,3 mL, 5,3 mg, 23,6 μmol).
    2. Revuelva durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego enfríe la reacción con HCl al 0,05% (12 mL).
  2. Purificar la insulina-alquino modificada individualmente mediante cromatografía líquida de fase reversa (4 h). Utilice una columna C18 preparatoria (19 mm x 250 mm, tamaño de poro de 300 A, tamaño de partícula de 5 μm) con un gradiente B de 30-40 % de 10 min (A, agua con ácido trifluoroacético (TFA) al 0,05 %); B, acetonitrilo con 0,05% de TFA) y un caudal de 14 mL/min. El producto deseado eluye inmediatamente después de la insulina no modificada.
    1. Evapore acetonitrilo y TFA por corriente de gas nitrógeno o evaporación rotativa a presión reducida (650 pascales) y girando a 150 rpm. Congele la solución acuosa y liofílicela hasta que quede seca. Almacene la insulina funcionalizada a -20 °C en una atmósfera seca.
      NOTA: La insulina funcionalizada es estable hasta por un año bajo estas condiciones de almacenamiento.
  3. Sintetizar la matriz de antígenos por cicloadición de azida-alquino (CuAAC) catalizada por cobre (2,5 h)22. Agregue 6 equivalentes de insulina-alquino (38 mg, 6,3 μmol) a un vial de vidrio de 10 mL con una barra agitadora y disuelva en DMSO (1,2 mL) con un calentamiento suave.
    1. Agregue 50 mM de tampón de fosfato de sodio (1,8 mL) pH 7,4, 1 azida PEG equivalente de 20 kDa de 4 brazos (21 mg, 1,05 μmol), sulfato de cobre (II) pentahidratado (3,15 mg, 12,6 μmol), Tris(3-hidroxipropiltriazolilmetil)amina (27,37 mg, 63 μmol) y ascorbato de sodio (50,34 mg, 254 μmol).
    2. Revuelva durante 2 h a temperatura ambiente, luego agregue DMSO (3 mL) para solubilizar cualquier precipitado y acidificar la solución con HCl al 0,05% (4 mL).
  4. Purificar el array de antígenos mediante cromatografía líquida en fase reversa (3 h). Utilice una columna C18 preparatoria (19 mm x 250 mm, tamaño de poro de 300 A, tamaño de partícula de 5 μm) con un gradiente B de 10 min del 20 al 60 % (A, agua con 0,05 % de TFA; B, acetonitrilo con 0,05% de TFA) y un caudal de 14 ml/min. El producto deseado eluye inmediatamente después de la insulina-alquino.
    1. Evapore el acetonitrilo por corriente de gas nitrógeno o evaporación rotatoria a presión reducida. Congele la solución acuosa y liofílicela hasta que quede seca. Almacenar a -20 °C en atmósfera seca.
      NOTA: La matriz de antígenos de insulina es altamente higroscópica. Las fibras liofilizadas pueden fusionarse en una pastilla densa después de una exposición repetida a la atmósfera. Las propiedades de la FAA pueden diferir según el antígeno específico de la aplicación utilizado. La matriz de antígenos de insulina es estable durante varios meses en estas condiciones de almacenamiento.

2. Conjugación de fluoróforos (1-2 días)

  1. Conjugar el fluoróforo a la matriz de antígenos (2,5 h). Agregue 1 insulina tetravalente equivalente (21,7 mg, 0,5 μmol) a un vial de vidrio de 20 mL con barra agitadora y disuelva en DMSO (1,75 mL) con un calentamiento suave. Añadir tampón de carbonato de 100 mM recién preparado (8 mL), pH 9,0 y 5 equivalentes de isotiocianato de fluoresceína en una solución madre de 10 mM recién preparada en DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Revuelva durante 2 h en la oscuridad a temperatura ambiente.
  2. Purificar el producto por diálisis (24 h). Utilice un tubo de diálisis de corte de peso molecular de 3,5 kDa en un cubo de 5 L agitado con agua destilada en la oscuridad a temperatura ambiente. Diálisis durante 24 h y cambio de la solución de diálisis cada 6-12 h.
  3. Congele la solución dializada y liofílicela hasta que se seque para producir el FAA. Almacenar en la oscuridad bajo un ambiente seco a -20 °C.
    NOTA: La FAA es estable durante varios meses en estas condiciones de almacenamiento.

3. Caracterización de la FAA (2-4 h)

  1. Analice los productos de los pasos 1 y 2 mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio-poliacrilamida según Laemmli25 (2 h). Prepare muestras que contengan 5 μg de antígeno monovalente purificado, azida PEG de 20 kDa para 4 brazos, matriz de antígenos y FAA.
    1. Visualice el marcaje de fluoróforos en las muestras de la FAA mediante imágenes de fluorescencia en un generador de imágenes en gel.
    2. Realizar la tinción con azul de Coomassie26 para visualizar el antígeno.
    3. Realice la tinción de yodo27 para visualizar la columna vertebral de PEG. Enjuague el gel en agua destilada (3 x 2 min), incube en una solución de cloruro de bario al 5% (20 mL) durante 10 min, enjuague en agua destilada (3 x 2 min), incube en una solución de yodo 0,1 N (20 mL) durante 1 min, luego enjuague en agua destilada (3 x 2 min) para eliminar las manchas de fondo antes de la visualización.
      NOTA: Para hacer una solución de yodo 0,1 N, agregue yoduro de potasio (2,0 g, 12 mmol) y yodo (1,27 g, 5 mmol) a 100 mL de agua destilada.
  2. Calcular el grado de marcaje del colorante mediante espectroscopía UV-Vis (1 h). Disuelva una pequeña cantidad de FAA a 0,1 mg/mL y registre la absorbancia a 280 nm y la longitud de onda de absorción máxima para el colorante. Obtener los coeficientes de extinción molar para el antígeno y el colorante.
    NOTA: Algunos tintes son sensibles al pH. Asegúrese de utilizar una solución tamponada adecuada, como un tampón de carbonato de 100 mM con un pH de 8,3, cuando mida la absorbancia de FAA para asegurarse de que el coeficiente de extinción de tinte informado sea preciso.
    1. Realice el siguiente cálculo28 dondeA Dye, maxλ es la absorbancia FAA en la longitud de onda de absorción máxima para el colorante, E Dye, maxλ es el coeficiente de extinción molar en la longitud de onda de absorción máxima para el colorante, yE antígeno, 280 nm es el coeficiente de extinción molar para el antígeno monovalente a 280 nm.:
      Factor de corrección (CF) =Un colorante, 280 nm /Un colorante, máx.λ 0.25 * (Colorante A, máx.λ /Colorante E, máx.λ) * (Antígeno E, 280 nm / (A280 nm – (Colorante A, máx.λ * CF))) = colorante/FAA
  3. Analice la FAA en busca de colorantes libres o productos de degradación potencial mediante RP-HPLC (1 h).
    1. Disuelva una pequeña cantidad de FAA a 1,0 mg/mL y analice con una columna analítica C18 (4,6 mm x 150 mm, tamaño de poro de 300 A, tamaño de partícula de 2,5 μm) utilizando un gradiente B de 5-95% de 10 min (A, agua con ácido trifluoroacético al 0,05%: B, acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0,05%) con un caudal de 1 mL/min. Configure el detector UV-Vis para monitorear la longitud de onda de absorbancia máxima del tinte (437 nm para FITC).
      NOTA: En el caso de los tintes sensibles al pH, el análisis por HPLC en disolventes acidificados puede requerir el cambio de la longitud de onda monitoreada de la longitud de onda de absorción máxima del colorante en condiciones acuosas neutras. En el 0,05% de TFA, el pH es de aproximadamente 3 y la absorción máxima de FITC ha cambiado.

4. Desarrollo del ensayo mediante valoración de FAA (3-5 h)

NOTA: Se presenta el uso de la FAA para la citometría de flujo, pero los mismos pasos se pueden modificar para su uso en otros formatos, como la inmunohistoquímica o la microscopía fluorescente. Al aplicar FAA para un nuevo formato, se debe completar un nuevo ensayo de optimización. Las poblaciones celulares mixtas o aisladas pueden obtenerse a través de métodos de procesamiento de órganos sanguíneos o linfoides23,29. No se recomienda la recolección a través de la digestión enzimática del tejido, ya que los marcadores de la superficie de las células pueden desprenderse.

  1. Suspender el stock de FAA a 1 mg/mL en tampón FACS (1x PBS + 5% de suero fetal bovino y 0,1% de azida sódica). Se puede incorporar hasta un 10% de DMSO para acelerar la disolución.
  2. Obtener células positivas para linfocitos B específicos de antígeno de interés y dispensarlas en tubos de microcentrífuga. Se requerirán aproximadamente 1 x 107 celdas en total.
    NOTA: Los esplenocitos se recolectaron de ratones VH125 y EAE de acuerdo con los protocolos aprobados por IACUC en la Universidad de Kansas para la presente demostración. Los investigadores pueden emplear los métodos descritos en este documento para muestras de células específicas para su propia aplicación y preparación de FAA.
    1. Dispense 5 x 105 celdas para las réplicas de etiquetado de valoración (al menos 3 réplicas por valoración).
    2. Dispense 1 x 105 celdas para controles de una sola mancha, así como un control sin tinción.
      NOTA: Los isotipos de anticuerpos y el control de fluorescencia menos uno también se pueden utilizar para validar completamente el ensayo.
  3. Lave las células añadiendo 1 mL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar a 200 x g durante 5 min.
  4. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos celulares en 50 μL de tampón FACS.
  5. Agregue anticuerpos fluorescentes CD3 y CD19 a cada muestra a las concentraciones recomendadas por el fabricante, así como a las dosis ajustadas de FAA.
    NOTA: Las concentraciones de trabajo de anticuerpos fluorescentes se pueden valorar de forma independiente para confirmar la integridad del lote. Los rangos de dosis apropiados de FAA variarán según la aplicación, pero un buen punto de partida es 50, 25, 10, 5 y 1 μg por muestra. 1 μL de solución madre de FAA equivale a 1 μg de dosis.
  6. Mezclar bien cada muestra e incubar cubierta de luz, en hielo durante 30 min.
  7. Después de la incubación, lave las células añadiendo 1 mL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 5 min.
  8. Aspire el sobrenadante y repita el lavado añadiendo 1 mL de tampón FACS a cada tubo. Centrifugar las muestras a 200 x g durante 5 min.
  9. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las muestras en 200 μL de tampón FACS fresco. Coloque las muestras en hielo y diríjase al citómetro.
  10. Ejecute las muestras en el citómetro y recopile al menos 50.000 eventos.

5. Análisis de valoración de la FAA y optimización de la dosis de etiquetado (1-2 h)

  1. Utilizando software de análisis de citometría de flujo, puerta para células individuales.
  2. En las células individuales, coloque puertas para CD19+ (células B) y CD3+ (células T).
  3. Dentro de las poblaciones parentales de CD19+ y CD3+, la puerta para eventos FAA+ en el canal de fluorocromo relevante.
  4. Registre el porcentaje de eventos FAA+ dentro de las poblaciones parentales CD19+ y CD3+.
  5. Calcule una razón de especificidad dividiendo la proporción de eventos de FAA+ en la población CD19+ (específica) por la proporción de eventos de FAA+ en la población CD3+ (inespecífica). La relación de especificidad debe maximizarse para un uso exitoso de la FAA.
  6. Emplee la dosis de marcaje correspondiente a la relación de especificidad más alta para futuros experimentos.

Resultados

El rendimiento purificado de insulina-alquino (Figura 2, panel superior), determinado por peso, varió típicamente entre 50 y 65%. Es probable que los rendimientos de menos del 40% se deban a la contaminación del agua en el DMSO anhidro y/o a la hidrólisis del éster propargil NHS. Para la multimerización de antígenos (Figura 1B), el rendimiento purificado de la matriz de antígenos de insulina (Figura ...

Discusión

Desarrollamos un protocolo (Figura 1) para construir FAAs personalizados para identificar linfocitos B específicos de antígeno, simplificando la generación de sondas de linfocitos B para dianas de antígenos difíciles. Seleccionamos polímeros PEG de 4 brazos con grupos azida terminales como sustrato fácil para la construcción de FAA, ya que el PEG confiere solubilidad en agua, mientras que los mangos funcionales de azida permiten reacciones de conjuga...

Divulgaciones

CJB es cofundador de Orion Bioscience, Inc., una empresa que concede licencias de la tecnología SAgA para investigar sus usos terapéuticos. Este informe se basa en el trabajo apoyado por el Programa de Investigación de Posgrado de la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. 1946099. Todas las opiniones, hallazgos, conclusiones o recomendaciones expresadas en este material pertenecen a los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

Agradecimientos

Agradecemos a Colette Worcester por su ayuda con la recopilación de datos. Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación PhRMA (JDG), el Programa de Becas de Investigación de Posgrado (KDA) de la Fundación Nacional de Ciencias y las subvenciones de los NIH R21AI143407, R21AI144408 y DP5OD023118.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

Referencias

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