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요약

이 프로토콜은 항원 특이적 B 세포 표지를 위한 형광 프로브의 맞춤형 생산 및 사용에 대해 자세히 설명합니다.

초록

형광 항원 생산은 항원 특이적 B 세포를 식별하는 데 중요한 단계입니다. 여기에서는 동족 B 세포 수용체와의 열렬한 참여를 통해 항원 특이적 B 세포를 선택적으로 식별하기 위해 4군 형광 PEG-항원 접합체의 준비, 정제 및 사용에 대해 자세히 설명했습니다. 모듈식 클릭 화학과 상업적으로 이용 가능한 형광단 키트 화학을 사용하여 다발성 경화증 및 제1형 당뇨병의 쥐 모델에서 각각 중요한 자가항원인 단백질지질단백질(PLP139-151) 및 인슐린에 대한 별개의 어레이를 생성하여 맞춤형 형광 PEG 접합체를 준비할 수 있는 다양성을 입증했습니다. 분석은 유세포 분석을 사용하여 해당 질병 모델의 각 형광 접합체에 대해 개발되었습니다. 항원 어레이는 PEG 백본에 대한 다중합체화의 이점을 정량화하기 위해 1가 자가항원과 비교되었습니다. 마지막으로, 우리는 생체 외 항원 자극 후 항인슐린 B 세포 반응을 분리하고 평가함으로써 이 플랫폼의 유용성을 설명했습니다. 인슐린 특이적 B 세포를 라벨링하면 응집체 B 세포 분석에서 감쇠된 공동 자극(CD86)의 변화를 증폭하여 감지할 수 있었습니다. 이 보고서를 통해 형광 항원 어레이를 B 세포 집단을 조사하기 위한 강력한 도구로 생산할 수 있습니다.

서문

적응면역체계(adaptive immune system)는 자가면역, 암, 감염성 질환 등 많은 질병 상태의 진행 또는 퇴행에 중요한 역할을 한다1. 면역병리학 연구 또는 새로운 정밀 치료법 개발을 포함한 광범위한 응용 분야의 경우, 질병 진행의 기저에 있는 항원 특이적 B 및 T 세포 반응을 평가하는 것이 중요한 경우가 많습니다 2,3,4. 주요 조직적합성 복합체(MHC) 사량체는 항원 특이적 T 세포 클론을 식별하기 위해 널리 상업적으로 이용 가능합니다5. 이러한 형광단 표지 구조체는 4가 펩타이드-MHC 복합체를 나타내어 현미경 및 유세포 분석과 같은 라벨링 응용 분야를 위해 동족 T 세포 수용체와 적극적으로 작용합니다.

B 세포 심문에 대한 항원은 매우 다양한 분자량, 전하 및 용해도를 나타낼 수 있습니다 6,7. 단량체 항원을 용해성 B 세포 프로브로 사용하는 경우, 물리화학적 항원 특성은 훨씬 더 큰 수용성 스트렙타비딘 분자와의 복합체를 통해 안정화되지 않거나 접합 전에 단량체 시약으로 용해성 문제를 나타낼 수 있습니다. 따라서 일부 단백질은 실제로 생체 접합의 어려움과 예상치 못한 결과를 나타냅니다 7,8. 직접적인 형광 염료 접합은 때때로 구조물을 물을 불용성 및 지방성으로 만들 수 있습니다. 이러한 직접 염료 항원 화합물은 세포막 내에 비특이적 포매에 취약하여 항원 특이적 분석을 혼란스럽게 합니다 7,8,9. 일부 전략은 항원 및 형광단을 다른 작용기와 결합하여 용해도 문제를 극복했습니다. 예를 들어, Cambier 등은 형광단 표지 스트렙타비딘을 단계적으로 첨가하기 전에 인슐린 특이적 B 세포 수용체(BCR)와 연결하기 위해 네이티브 형태의 비오틴화 인슐린을 사용했습니다10. 이 접근법을 통해 고해상도로 단량체 인슐린에 결합하는 B 세포를 평가할 수 있었지만 두 가지 라벨링 단계가 필요했습니다. 일반적인 형광 항체 라벨링 절차와 쉽게 통합되는 즉시 사용 가능한 폴리머 기반 B 세포 프로브의 준비를 위한 일반화 가능한 프로토콜은 질병 내 B 세포 연구를 진전시키는 데 도움이 될 것입니다.

이 프로토콜에서는 현미경 검사 및 유세포 분석 실험을 위한 항원 특이적 B 세포의 일반화 가능하고 단일 단계 라벨링을 위한 형광 항원 어레이(FAA)의 생산 및 사용에 대해 자세히 설명합니다(그림 1). 용해성 항원 어레이(SAgA)는 지난 10년 동안 자가면역 질환에 대한 B 세포 표적 항원 특이적 면역 요법으로 사용되어 왔습니다 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. SAgA는 유연한 고분자 골격에 다가 항원 디스플레이를 활용하여 B 세포 수용체와 적극적으로 결합하고 면역 조절 효과를 유도하지만, 항원 특이성은 형광단23에 결합할 때 관심 B 세포를 조사할 수 있는 또 다른 기회를 제공합니다. SAgAs를 구성하는 고분자 골격은 전체 생체 거대분자에 수용성을 부여하고 프로브 생성 및 염색 특이성을 혼란스럽게 하는 때때로 극단적인 항원 특성을 약화시킬 수 있습니다 6,24. 당사는 작은 펩타이드 에피토프와 전체 단백질을 사용하는 데 도움이 되는 모듈식 클릭 화학을 사용하여 크기와 복잡성에 이르는 수많은 항원을 SAgA 플랫폼에 이식했습니다14,18. 여기에서는 FAA가 일반적인 형광 항체 라벨링과 병행하여 사용할 수 있는 강력한 항원 특이적 B 세포 라벨링 도구임을 보여줍니다. 제1형 당뇨병의 형질전환 마우스 모델(VH125)에서 B 세포를 표지하기 위한 인간 인슐린으로 구성된 FAA와 다발성 경화증의 마우스 모델인 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)에 대한 펩타이드 항원결정기인 단백질지질 단백질 139-151(PLP)을 통합한 FAA를 준비하고 평가했습니다. 이러한 질병 모델을 채택한 우리의 의도는 사용된 항원의 모듈식 대체뿐만 아니라 펩타이드 항원결정기(PLP) 및 완전 단백질(인슐린)과 함께 사용할 수 있는 실행 가능성 모두에 대해 이 플랫폼의 다양성을 입증하는 것이었습니다. 이 프로토콜은 광범위한 생체접합 전문 지식이 필요하지 않은 접근성을 목적으로 제공됩니다. 시약과 합성 및 정제 방법은 화학, 분자 생물학 또는 면역학에 중점을 둔 대부분의 연구 실험실에서 다용도로 사용할 수 있도록 설계되었으며 쉽게 구현할 수 있습니다.

프로토콜

이 작업에 포함된 모든 동물 절차는 캔자스 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 항원 어레이 합성(4-6일)

  1. 알킨 핸들(alkyne handle)로 변형되지 않은 항원을 기능화합니다(1시간). 20mL 유리 바이알에 1개의 등가 인슐린(100mg, 17.4μmol)을 교반 막대와 함께 넣고 무수 디메틸설폭사이드(DMSO)(2mL)에 녹이고 히트 건 또는 수조를 사용하여 40–50°C로 부드럽게 가열합니다.
    1. 무수 DMSO(0.3mL, 5.3mg, 23.6μmol)에 1,1,3,3-테트라메틸구아니딘(40.2mg, 348.8μmol) 및 1.35 등가물을 갓 준비한 78.5mM 프로파르길 N-하이드록시숙신이미드 에스테르(NHS-에스테르) 원액을 추가합니다.
    2. 실온에서 30분 동안 저어준 다음 0.05% HCl(12mL)로 반응을 급냉합니다.
  2. 단일 변형 인슐린-알카인을 역상 액체 크로마토그래피(4시간)로 정제합니다. 10분 30–40% B 그래디언트(A, 0.05% 트리플루오로아세트산(TFA)가 함유된 물)의 분취용 C18 컬럼(19mm x 250mm, 300A 공극 크기, 5μm 입자 크기)을 사용합니다. B, 0.05% TFA의 아세토니트릴) 및 14mL/분의 유속. 원하는 생성물은 변형되지 않은 인슐린 직후에 용리됩니다.
    1. 질소 가스 스트림 또는 회전 증발로 아세토니트릴 및 TFA를 감압(650파스칼) 및 150rpm으로 회전하여 증발합니다. 수용액을 동결하고 동결건조합니다. 기능화된 인슐린은 건조한 분위기 아래에서 -20°C에서 보관하십시오.
      참고: 기능화된 인슐린은 이러한 저장 조건에서 최대 1년 동안 안정적입니다.
  3. 구리 촉매, 아지드-알킨 고리첨가(CuAAC)(2.5시간)로 항원 어레이를 합성합니다22. 6 등가물 인슐린-알카인(38 mg, 6.3 μmol)을 10 mL 유리 바이알에 넣고 교반 막대를 사용하여 DMSO(1.2 mL)에 용해시킵니다.
    1. 50mM 인산나트륨 완충액(1.8mL) pH 7.4, 1개 등가 20kDa 4암 PEG 아지드(21mg, 1.05μmol), 구리(II) 황산염 5수화물(3.15mg, 12.6μmol), 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민(27.37mg, 63μmol) 및 아스코르브산나트륨(50.34mg, 254μmol)을 추가합니다.
    2. 실온에서 2 시간 동안 교반 한 다음 DMSO (3 mL)를 첨가하여 침전물을 용해시키고 용액을 0.05 % HCl (4 mL)로 산성화시킵니다.
  4. 역상 액체 크로마토그래피(3시간)로 항원 어레이를 정제합니다. 10분 20–60% B 그래디언트(A, 0.05% TFA의 물; B, 0.05% TFA를 함유한 아세토니트릴) 및 14ml/min의 유속. 원하는 생성물은 인슐린-알카인 직후에 용리됩니다.
    1. 질소 가스 스트림 또는 감소된 압력에서 회전 증발에 의해 아세토니트릴을 증발시킵니다. 수용액을 동결하고 동결건조합니다. 건조한 분위기에서 -20 °C에서 보관하십시오.
      참고: 인슐린 항원 어레이는 흡습성이 매우 높습니다. 동결건조된 섬유는 대기에 반복적으로 노출된 후 조밀한 펠릿으로 합쳐질 수 있습니다. FAA 특성은 사용되는 애플리케이션별 항원에 따라 다를 수 있습니다. 인슐린 항원 어레이는 이러한 저장 조건에서 몇 달 동안 안정적입니다.

2. 형광단 접합 (1-2일)

  1. 형광단을 항원 어레이에 접합합니다(2.5시간). 20mL 유리 바이알에 교반 막대가 있는 20mL 유리 바이알에 1개 상당의 4가 인슐린(21.7mg, 0.5μmol)을 넣고 부드럽게 가열하여 DMSO(1.75mL)에 녹입니다. DMSO(0.25ml, 0.97mg, 2.5μmol)의 새로 준비된 10mM 원액에 새로 준비된 100mM 탄산염 완충액(8mL) pH 9.0 및 5등가의 플루오레세인 이소티오시아네이트를 추가합니다. 실온에서 어두운 곳에서 2시간 동안 저어줍니다.
  2. 투석(24시간)으로 제품을 정제하십시오. 증류수와 함께 교반된 5L 버킷에 3.5kDa 분자량 차단 투석 튜브를 실온의 어두운 곳에서 사용합니다. 24시간 동안 투석하고 6-12시간마다 투석 용액을 교체하십시오.
  3. 투석된 용액을 동결하고 동결건조하여 FAA를 생성합니다. -20 °C의 건조한 분위기 아래 어두운 곳에 보관하십시오.
    참고: FAA는 이러한 보관 조건에서 몇 달 동안 안정적입니다.

3. FAA 특성화(2–4시간)

  1. Laemmli25 (2시간)에 따라 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 1단계와 2단계의 생성물을 분석합니다. 5μg의 정제된 1가 항원, 20kDa 4-arm PEG 아지드, 항원 어레이 및 FAA를 포함하는 샘플을 준비합니다.
    1. 겔 이미저에서 형광 이미징을 통해 FAA 샘플의 형광단 라벨링을 시각화합니다.
    2. Coomassie blue staining26 을 수행하여 항원을 시각화합니다.
    3. PEG 골격을 시각화하기 위해 요오드 염색27 을 수행합니다. 겔을 증류수(3 x 2분)로 헹구고, 5% 염화바륨 용액(20mL)에서 10분 동안 배양하고, 증류수(3 x 2분)로 헹구고, 0.1N 요오드 용액(20mL)에서 1분 동안 배양한 다음 증류수(3 x 2분)로 헹구어 시각화 전에 배경 염색을 제거합니다.
      참고: 0.1N 요오드 용액을 만들려면 100mL 증류수에 요오드화칼륨(2.0g, 12mmol)과 요오드(1.27g, 5mmol)를 첨가합니다.
  2. UV-Vis 분광법(1시간)으로 염료 표지 정도를 계산합니다. 0.1mg/mL에서 소량의 FAA를 용해하고 280nm에서의 흡광도와 염료의 피크 흡수 파장을 기록합니다. 항원과 염료에 대한 몰 흡광 계수를 구합니다.
    참고: 일부 염료는 pH에 민감합니다. 보고된 염료 흡광 계수가 정확한지 확인하기 위해 FAA 흡광도를 측정할 때 pH 8.3의 100mM 탄산염 완충액과 같은 적절하게 완충된 용액을 사용해야 합니다.
    1. 다음 계산을수행합니다 28 , 여기서 A염료, maxλ 는 염료의 최대 흡수 파장에서의 FAA 흡광도, E염료, 최대 λ 는 염료의 최대 흡수 파장에서의 몰 흡광 계수, E항원, 280 nm 는 280 nm에서 1가 항원에 대한 몰 흡광 계수입니다.
      보정 계수 (CF) = 염료, 280 nm /A 염료, 최대 λ 0.25 * (A염료, 최대 λ / E염료, 최대 λ) * (E항원, 280 nm / (A 280 nm – (A염료, 최대 λ * CF))) = 염료 / FAA
  3. RP-HPLC에 의한 유리 염료 또는 잠재적 분해 생성물에 대한 FAA를 분석합니다(1시간).
    1. 1.0mg/mL에서 소량의 FAA를 용해하고 10분 5–95% B 그래디언트(A, 0.05% 트리플루오로아세트산이 포함된 물: B, 0.05% 트리플루오로아세트산이 포함된 물, 0.05% 트리플루오로아세트산이 포함된 아세토니트릴)를 사용하여 1mL/분의 유속으로 분석용 C18 컬럼(4.6mm x 150mm, 300A 공극 크기, 2.5μm 입자 크기)으로 분석합니다. UV-Vis 검출기를 설정하여 염료의 피크 흡광 파장(FITC의 경우 437nm)을 모니터링합니다.
      참고: pH에 민감한 염료의 경우 산성화된 용매의 HPLC 분석을 위해서는 중성 수성 조건에서 모니터링된 파장을 염료의 최대 흡수 파장에서 이동해야 할 수 있습니다. 0.05% TFA에서 pH는 약 3이고 FITC의 최대 흡수율이 이동했습니다.

4. FAA 적정에 의한 분석 개발(3–5시간)

참고: 유세포 분석을 위한 FAA 사용이 제시되어 있지만 면역조직화학 또는 형광 현미경 검사와 같은 다른 형식으로 사용하기 위해 동일한 단계를 수정할 수 있습니다. 새로운 형식에 FAA를 적용할 때 새로운 최적화 분석을 완료해야 합니다. 혼합 또는 분리된 세포 집단은 혈액 또는 림프 장기 처리 방법을 통해 얻을 수 있습니다23,29. 조직의 효소 분해를 통한 수확은 세포 표면 마커가 벗겨질 수 있으므로 권장되지 않습니다.

  1. FAA 스톡을 FACS 완충액에 1mg/mL로 현탁시킵니다(PBS 1개 + 5% 소 태아 혈청 및 0.1% 아지드화나트륨). 용해를 가속화하기 위해 최대 10%의 DMSO를 통합할 수 있습니다.
  2. 관심 항원 특이적 B 세포에 대해 양성 세포를 확보하고 마이크로 원심분리 튜브에 분배합니다. 약 1 x 107 총 셀이 필요합니다.
    참고: 본 시연을 위해 캔자스 대학교(University of Kansas)에서 IACUC 승인 프로토콜에 따라 VH125 및 EAE 마우스에서 비장세포를 수확했습니다. 연구자들은 그들 자신의 응용 분야 및 FAA 준비에 특이적인 세포 샘플에 대해 본원에 기술된 방법을 사용할 수 있다.
    1. 적정 라벨링 반복을 위해 5 x 105 세포를 분주합니다(적정당 최소 3회 반복).
    2. 1 x 105 셀을 분주하여 단일 염색 제어와 염색되지 않은 대조군을 사용할 수 있습니다.
      참고: 항체 동형과 형광 - 하나의 대조군도 사용하여 분석을 완전히 검증할 수 있습니다.
  3. 각 튜브에 1mL의 FACS 버퍼를 추가하여 세포를 세척합니다. 200 x g 에서 5분 동안 원심분리기
  4. 상층액을 흡인하고 50μL의 FACS 완충액에 세포 펠릿을 재현탁합니다.
  5. CD3 및 CD19 형광 항체를 각 샘플에 제조업체가 권장하는 농도와 적정 FAA 용량으로 추가합니다.
    참고: 형광 항체 작업 농도는 로트 무결성을 확인하기 위해 독립적으로 적정될 수 있습니다. 적절한 FAA 선량 범위는 응용 분야에 따라 다르지만 샘플당 50, 25, 10, 5 및 1μg부터 시작하는 것이 좋습니다. 1μL의 FAA 용액은 1μg의 용량과 같습니다.
  6. 각 샘플을 잘 섞고 빛을 피하고 얼음 위에서 30분 동안 배양합니다.
  7. 배양 후 각 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 추가하여 세포를 세척합니다. 200 x g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
  8. 상층액을 흡입하고 각 튜브에 1mL의 FACS 완충액을 추가하여 세척을 반복합니다. 200 x g 에서 5분 동안 샘플을 원심분리합니다.
  9. 상층액을 흡입하고 200μL의 새로운 FACS 완충액에 샘플을 재현탁합니다. 샘플을 얼음 위에 놓고 세포분석기로 향합니다.
  10. 세포분석기에서 샘플을 실행하고 최소 50,000개의 이벤트를 수집합니다.

5. FAA 적정 분석 및 라벨링 용량 최적화(1-2시간)

  1. 유세포 분석 소프트웨어를 사용하여 단일 세포를 게이트합니다.
  2. 단일 세포에는 CD19+(B 세포) 및 CD3+(T 세포)에 대한 게이트를 배치합니다.
  3. CD19+ 및 CD3+ 부모 집단 내에서 관련 형광 색소 채널에서 FAA+ 이벤트를 게이트합니다.
  4. CD19+ 및 CD3+ 상위 모집단 내에서 FAA+ 이벤트의 백분율을 기록합니다.
  5. CD19+ 모집단(특이적)에서 FAA+ 이벤트의 비율을 CD3+ 모집단에서 FAA+ 이벤트의 비율(비특이적)로 나누어 특이성 비율을 계산합니다. FAA를 성공적으로 사용하려면 특이성 비율을 최대화해야 합니다.
  6. 향후 실험을 위해 가장 높은 특이성 비율에 해당하는 라벨링 용량을 사용합니다.

결과

무게에 따라 결정된 인슐린-알카인(그림 2, 상단 패널)의 정제된 수율은 일반적으로 50-65%로 다양했습니다. 40% 미만의 수율은 무수 DMSO의 수질 오염 또는 프로파르길 NHS-에스테르의 가수분해로 인해 발생했을 가능성이 높습니다. 항원 다량체화(그림 1B)의 경우, 인슐린 항원 어레이(그림 2, 중간 패널)의 정?...

토론

우리는 항원 특이적 B 세포를 식별하기 위한 맞춤형 FAA를 구성하기 위한 프로토콜(그림 1)을 개발하여 까다로운 항원 표적에 대한 B 세포 프로브 생성을 단순화했습니다. 우리는 PEG가 수용성을 부여하는 반면 기능적 아지드 핸들은 간단한 클릭 접합 반응을 가능하게 하기 때문에 FAA 구축을 위한 손쉬운 기판으로 말단 아지드기를 가진 4-arm PEG 폴리머?...

공개

CJB는 SAgA의 치료 용도를 조사하기 위한 SAgA 기술의 라이선스를 취득한 회사인 Orion Bioscience, Inc.의 공동 설립자입니다. 이 보고서는 보조금 번호 1946099에 따라 National Science Foundation 대학원 연구 프로그램의 지원을 받는 작업을 기반으로 합니다. 이 자료에 표현된 모든 의견, 연구 결과, 결론 또는 권장 사항은 저자의 것이며 반드시 National Science Foundation의 견해를 반영하는 것은 아닙니다.

감사의 말

데이터 수집에 도움을 주신 Colette Worcester에게 감사드립니다. 이 연구는 PhRMA 재단(JDG), 국립과학재단 대학원 연구 펠로우십 프로그램(KDA) 및 NIH 보조금 R21AI143407, R21AI144408 및 DP5OD023118의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

참고문헌

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