JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, antijene özgü B hücrelerini etiketlemek için floresan probların özelleştirilebilir üretimini ve kullanımını detaylandırır.

Özet

Floresan antijen üretimi, antijene özgü B hücrelerinin tanımlanmasında kritik bir adımdır. Burada, aynı kökenli B hücresi reseptörleri ile hevesli bir etkileşim yoluyla antijene özgü B hücrelerini seçici olarak tanımlamak için dört kollu, floresan PEG-antijen konjugatlarının hazırlanmasını, saflaştırılmasını ve kullanımını detaylandırdık. Modüler tıklama kimyası ve ticari olarak temin edilebilen florofor kiti kimyalarını kullanarak, sırasıyla multipl skleroz ve tip 1 diyabetin murin modellerinde önemli otoantijenler olan proteolipid proteini (PLP139-151) ve insülin için farklı diziler oluşturarak özelleştirilmiş floresan PEG konjugatları hazırlamanın çok yönlülüğünü gösterdik. Akış sitometrisi kullanılarak ilgili hastalık modelindeki her bir floresan konjugat için testler geliştirilmiştir. Antijen dizileri, PEG omurgaları üzerindeki multimerizasyonun faydasını ölçmek için monovalent otoantijen ile karşılaştırıldı. Son olarak, ex vivo antijen stimülasyonundan sonra anti-insülin B hücresi tepkilerini izole ederek ve değerlendirerek bu platformun faydasını gösterdik. İnsüline özgü B hücrelerinin etiketlenmesi, aksi takdirde agrega B hücresi analizinde sönümlenen ko-stimülasyondaki (CD86) değişikliklerin amplifiye edilmiş şekilde tespit edilmesini sağlamıştır. Birlikte, bu rapor, B hücre popülasyonlarını araştırmak için sağlam bir araç olarak floresan antijen dizilerinin üretimini ve kullanımını sağlar.

Giriş

Adaptif bağışıklık sistemi, otoimmünite, kanser ve bulaşıcı hastalıklar dahil olmak üzere birçok hastalık durumunun ilerlemesinde veya gerilemesinde kritik bir rol oynar1. İmmünopatoloji çalışması veya yeni hassas tedavilerin geliştirilmesi dahil olmak üzere geniş uygulamalar için, hastalık ilerlemesinin altında yatan antijene özgü B ve T hücresi yanıtlarını değerlendirmek genellikle kritik öneme sahiptir 2,3,4. Majör histouyumluluk kompleksi (MHC) tetramerleri, antijene özgü T hücresi klonlarını tanımlamak için yaygın ve ticari olarak mevcuttur5. Bu florofor etiketli yapılar, mikroskopi ve akış sitometrisi gibi etiketleme uygulamaları için aynı kökenli T hücresi reseptörleri ile hevesli bir şekilde etkileşime girmek için dörtlü peptit-MHC kompleksleri sunar.

B hücresi sorgulaması için antijenler, çok çeşitli moleküler ağırlıklar, yükler ve çözünürlükler sunabilir 6,7. Monomerik antijeni çözünür B hücre probları olarak kullanırken, fizikokimyasal antijen özellikleri çok daha büyük, suda çözünür streptavidin molekülü ile kompleks oluşturma yoluyla stabilize edilemeyebilir veya konjugasyondan önce monomerik reaktifler olarak çözünürlük sorunları gösterebilir. Bu nedenle, bazı proteinler biyokonjugasyon zorlukları ve pratikte beklenmedik sonuçlar sunar 7,8. Doğrudan floresan boya konjugasyonu bazen yapıları suda çözünmez ve lipofilik hale getirebilir. Bu doğrudan boya-antijen bileşikleri, hücre zarları içinde spesifik olmayan gömülmeye karşı hassastırve antijene özgü analizleri karıştırır 7,8,9. Bazı stratejiler, antijen ve floroforları diğer fonksiyonel gruplarla birleştirerek çözünürlük zorluklarının üstesinden gelmiştir. Örneğin Cambier ve ark., florofor etiketli streptavidin eklemeden önce insüline özgü B hücre reseptörleri (BCR'ler) ile etkileşime girmek için doğal formunda biyotinile insülin kullandılar10. Bu yaklaşım, monomerik insüline yüksek çözünürlükte bağlanan B hücrelerinin değerlendirilmesini sağlarken, iki etiketleme aşaması gerekliydi. Yaygın floresan antikor etiketleme prosedürleriyle kolayca entegre edilmiş, kullanıma hazır polimer bazlı B hücre problarının hazırlanması için genelleştirilebilir bir protokol, hastalıkta B hücrelerinin çalışmasını ilerletmek için faydalı olacaktır.

Bu protokolde, mikroskopi ve akış sitometrisi deneyleri için antijene özgü B hücrelerinin genelleştirilebilir ve tek adımlı etiketlenmesi için floresan antijen dizilerinin (FAA'lar) üretimini ve kullanımını detaylandırıyoruz (Şekil 1). Çözünür antijen dizileri (SAgA'lar) son on yılda otoimmün hastalıklara karşı B hücresi hedefli antijene özgü immünoterapiler olarak kullanılmıştır 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22. SAgA'lar, B hücresi reseptörlerini hevesli bir şekilde devreye sokmak ve immünomodülatör etkileri ortaya çıkarmak için esnek, polimerik omurgalar üzerinde çok değerlikli antijen ekranından yararlanır, ancak antijen özgüllükleri, bir florofor23'e bağlandığında ilgilenilen B hücrelerini araştırmak için başka bir fırsat sağlar. SAga'ları oluşturan polimerik omurgalar, genel biyomakromoleküle suda çözünürlük sağlar ve prob üretimi ile boyama özgüllüğünükarıştıran bazen aşırı antijen özelliklerini sönümleyebilir 6,24. Küçük peptit epitoplarının ve tam proteinlerinkullanımına elverişli olan modüler tıklama kimyası kullanarak SAgA platformuna boyut ve karmaşıklık açısından değişen çok sayıda antijen aşıladık 14,18. Burada, FAA'ları, tipik floresan antikor etiketlemesine paralel olarak kullanılabilen sağlam antijene özgü B hücresi etiketleme araçları olarak gösteriyoruz. Tip 1 Diyabetin (VH125) transgenik fare modelinde B hücrelerini etiketlemek için insan insülininden oluşan FAA'ları ve ayrıca deneysel otoimmün ensefalomiyelit (EAE) için bir peptit epitopu olan proteolipid protein 139-151 (PLP) içeren FAA'ları hazırladık ve değerlendirdik. Bu hastalık modellerini kullanmaktaki amacımız, hem kullanılan antijenlerin modüler ikamesi hem de peptit epitopları (PLP) ve tam proteinler (insülin) ile kullanımın uygulanabilirliği için bu platformun çok yönlülüğünü göstermekti. Bu protokol, kapsamlı biyokonjugasyon uzmanlığı gerektirmeden erişilebilirlik amacıyla sunulmuştur. Reaktiflerin yanı sıra sentez ve saflaştırma yöntemleri, çok yönlü olacak ve kimya, moleküler biyoloji veya immünolojiye odaklanan çoğu araştırma laboratuvarında kolayca uygulanacak şekilde tasarlanmıştır.

Protokol

Bu çalışmada temsil edilen tüm hayvan prosedürleri, Kansas Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Antijen dizisi sentezi (4-6 gün)

  1. Değiştirilmemiş antijeni bir alkin sapı (1 saat) ile işlevselleştirin. 1 eşdeğer insülin (100 mg, 17.4 μmol) bir karıştırma çubuğu ile 20 mL'lik bir cam şişeye ekleyin ve susuz dimetilsülfoksit (DMSO) (2 mL) içinde bir ısı tabancası veya su banyosu kullanarak 40-50 ° C'ye hafifçe ısıtın.
    1. Susuz DMSO'da (0.3 mL, 5.3 mg, 23.6 μmol) 1,1,3,3-tetrametilguanidin (40.2 mg, 348.8 μmol) ve 1.35 eşdeğeri taze hazırlanmış 78.5 mM propargil N-hidroksisüksinimit ester (NHS-ester) stok çözeltisi ekleyin.
    2. Oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın, ardından reaksiyonu %0.05 HCl (12 mL) ile söndürün.
  2. Tek başına modifiye edilmiş insülin-alkini ters fazlı sıvı kromatografisi (4 saat) ile saflaştırın. 10 dakika %30-40 B gradyanı (A, %0,05 trifloroasetik asit (TFA) içeren su) bir hazırlayıcı C18 sütunu (19 mm x 250 mm, 300 A gözenek boyutu, 5 μm partikül boyutu) kullanın; B, %0.05 TFA'lı asetonitril) ve 14 mL/dk akış hızı. İstenen ürün, modifiye edilmemiş insülinden hemen sonra ortaya çıkar.
    1. Asetonitril ve TFA'yı nitrojen gazı akışı veya düşük basınç (650 Pascal) altında döner buharlaştırma ile ve 150 rpm'de döndürerek buharlaştırın. Sulu çözeltiyi dondurun ve kuruyana kadar liyofilize edin. Fonksiyonel insülini -20 °C'de kuru bir atmosferde saklayın.
      NOT: İşlevselleştirilmiş insülin, bu saklama koşulları altında bir yıla kadar stabildir.
  3. Antijen dizisini bakır katalizli, azid-alkin siklo ilavesi (CuAAC) (2.5 saat) 22 ile sentezleyin. Bir karıştırma çubuğu ile 10 mL'lik bir cam şişeye 6 eşdeğer insülin-alkin (38 mg, 6.3 μmol) ekleyin ve hafif ısıtma ile DMSO'da (1.2 mL) çözün.
    1. 50 mM sodyum fosfat tamponu (1.8 mL) pH 7.4, 1 eşdeğer 20 kDa 4 kollu PEG azid (21 mg, 1.05 μmol), bakır (II) sülfat pentahidrat (3.15 mg, 12.6 μmol), Tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amin (27.37 mg, 63 μmol) ve sodyum askorbat (50.34 mg, 254 μmol).
    2. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın, ardından herhangi bir çökeltiyi çözündürmek için DMSO (3 mL) ekleyin ve çözeltiyi% 0.05 HCl (4 mL) ile asitleştirin.
  4. Antijen dizisini ters fazlı sıvı kromatografisi (3 saat) ile saflaştırın. 10 dakika %20–60 B gradyanı (A, %0,05 TFA'lı su; B, %0.05 TFA'lı asetonitril) ve 14 ml/dk akış hızı. İstenilen ürün insülin-alkinden hemen sonra ortaya çıkar.
    1. Asetonitril'i nitrojen gazı akışı veya düşük basınç altında döner buharlaştırma ile buharlaştırın. Sulu çözeltiyi dondurun ve kuruyana kadar liyofilize edin. -20 °C'de kuru bir atmosferde saklayın.
      NOT: İnsülin antijen dizisi oldukça higroskopiktir. Liyofilize lifler, atmosfere tekrar tekrar maruz kaldıktan sonra yoğun bir pelet halinde birleşebilir. FAA özellikleri, kullanılan uygulamaya özgü antijene bağlı olarak farklılık gösterebilir. İnsülin antijen dizisi, bu saklama koşulları altında birkaç ay boyunca stabildir.

2. Florofor konjugasyonu (1-2 gün)

  1. Floroforu antijen dizisine (2.5 saat) eşlenik edin. Karıştırma çubuklu 20 mL'lik bir cam şişeye 1 eşdeğer tetravalent insülin (21.7 mg, 0.5 μmol) ekleyin ve hafifçe ısıtma ile DMSO'da (1.75 mL) çözün. DMSO'da (0.25 ml, 0.97 mg, 2.5 μmol) taze hazırlanmış 10 mM stok çözeltisine taze hazırlanmış 100 mM karbonat tamponu (8 mL) pH 9.0 ve 5 eşdeğer floresein izotiyosiyanat ekleyin. Karanlıkta oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.
  2. Ürünü diyaliz ile arındırın (24 saat). Oda sıcaklığında karanlıkta damıtılmış su ile karıştırılmış 5 L'lik bir kovada 3,5 kDa moleküler ağırlıklı kesme diyaliz tüpü kullanın. 24 saat diyalize gidin ve diyaliz solüsyonunu her 6-12 saatte bir değiştirin.
  3. Diyaliz solüsyonunu dondurun ve FAA'yı elde etmek için kuruyana kadar liyofilize edin. Karanlıkta, -20 °C'de kuru bir atmosferde saklayın.
    NOT: FAA, bu depolama koşulları altında birkaç ay boyunca stabildir.

3. FAA karakterizasyonu (2–4 saat)

  1. Adım 1 ve 2'nin ürünlerini Laemmli25'e (2 saat) göre sodyum dodesil sülfat-poliakrilamid jel elektroforezi ile analiz edin. 5 μg saflaştırılmış monovalent antijen, 20 kDa 4 kollu PEG azid, antijen dizisi ve FAA içeren numuneler hazırlayın.
    1. Bir jel görüntüleyicide floresan görüntüleme ile FAA numunelerindeki florofor etiketlemesini görselleştirin.
    2. Antijeni görselleştirmek için Coomassie mavi boyama26 yapın.
    3. PEG omurgasını görselleştirmek için iyot boyama27 gerçekleştirin. Jeli damıtılmış suda (3 x 2 dakika) durulayın,% 5 baryum klorür çözeltisinde (20 mL) 10 dakika inkübe edin, damıtılmış suda (3 x 2 dakika) durulayın, 0.1 N iyot çözeltisinde (20 mL) 1 dakika inkübe edin, ardından görselleştirmeden önce arka plan lekesini gidermek için damıtılmış suda (3 x 2 dakika) durulayın.
      NOT: 0.1 N iyot çözeltisi yapmak için 100 mL damıtılmış suya potasyum iyodür (2.0 g, 12 mmol) ve iyot (1.27 g, 5 mmol) ekleyin.
  2. UV-Vis spektroskopisi (1 saat) ile boya etiketleme derecesini hesaplayın. Az miktarda FAA'yı 0.1 mg / mL'de çözün ve 280 nm'de emilimi ve boya için en yüksek absorpsiyon dalga boyunu kaydedin. Antijen ve boya için molar sönme katsayılarını elde edin.
    NOT: Bazı boyalar pH'a duyarlıdır. Rapor edilen boya yok olma katsayısının doğru olduğundan emin olmak için FAA absorbansını ölçerken pH 8.3 olan 100 mM karbonat tamponu gibi uygun şekilde tamponlanmış bir çözelti kullandığınızdan emin olun.
    1. Aşağıdaki hesaplamayıyapın 28 burada ABoya, maksλ boya için tepe absorpsiyon dalga boyunda FAA absorbansıdır, EBoya, maxλ boya için tepe absorpsiyon dalga boyundaki molar sönme katsayısıdır ve Eantijeni, 280 nm, 280 nm'de monovalent antijen için molar sönme katsayısıdır.:
      Düzeltme Faktörü (CF) = ABoya, 280 nm / ABoya, maxλ 0.25 * (ABoya, maxλ / EBoya, maxλ) * (Eantijen, 280 nm / (A280 nm – (ABoya, maxλ * CF))) = boya/FAA
  3. FAA'yı RP-HPLC (1 saat) ile serbest boya veya potansiyel bozunma ürünleri için analiz edin.
    1. Az miktarda FAA'yı 1,0 mg/mL'de çözün ve 10 dakika %5–95 B gradyanı (A, %0,05 trifloroasetik asit içeren su: B, %0,05 trifloroasetik asit içeren su: B, %0,05 trifloroasetik asit içeren asetonitril) kullanarak analitik bir C18 sütunu (4,6 mm x 150 mm, 300 A gözenek boyutu, 2,5 μm partikül boyutu) ile analiz edin ve 1 mL/dk akış hızıyla analiz edin. UV-Vis dedektörünü, boyanın tepe absorbans dalga boyunu izleyecek şekilde ayarlayın (FITC için 437 nm).
      NOT: pH'a duyarlı boyalar için, asitleştirilmiş çözücülerde HPLC analizi, izlenen dalga boyunun nötr, sulu koşullarda boyanın tepe absorpsiyon dalga boyundan kaydırılmasını gerektirebilir. % 0.05 TFA'da pH yaklaşık 3'tür ve FITC için maksimum emilim değişmiştir.

4. FAA titrasyonu ile tahlil geliştirme (3-5 saat)

NOT: Akış sitometrisi için FAA kullanımı sunulmuştur, ancak aynı adımlar immünohistokimya veya floresan mikroskobu gibi diğer formatlarda kullanım için değiştirilebilir. FAA'ları yeni bir format için uygularken, yeni bir optimizasyon tahlili tamamlanmalıdır. Karışık veya izole hücre popülasyonları, kan veya lenfoid organ işleme yöntemleri ile elde edilebilir 23,29. Doku yüzeyinin enzimatik sindirimi yoluyla hasat yapılması önerilmez, çünkü hücre yüzey belirteçleri dökülebilir.

  1. FAA stokunu FACS tamponunda 1 mg / mL'ye askıya alın (1x PBS +% 5 fetal sığır serumu ve% 0.1 sodyum azid). Çözünmeyi hızlandırmak için %10'a kadar DMSO dahil edilebilir.
  2. İlgilenilen antijene özgü B hücreleri için pozitif hücreler elde edin ve mikrosantrifüj tüplerine dağıtın. Yaklaşık 1 x 107 toplam hücre gerekecektir.
    NOT: Splenositler, mevcut gösteri için Kansas Üniversitesi'ndeki IACUC onaylı protokollere göre VH125 ve EAE farelerinden hasat edildi. Araştırmacılar, kendi uygulamalarına ve FAA hazırlığına özgü hücre örnekleri için burada açıklanan yöntemleri kullanabilirler.
    1. Titrasyon etiketleme replikaları için 5 x 105 hücre dağıtın (titrasyon başına en az 3 replikasyon).
    2. Tek lekeli kontrollerin yanı sıra lekesiz kontrol için 1 x 105 hücre dağıtın.
      NOT: Testi tam olarak doğrulamak için antikor izotipleri ve floresan eksi bir kontrol de kullanılabilir.
  3. Her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  4. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletlerini 50 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.
  5. Her numuneye üretici tarafından önerilen konsantrasyonlarda ve ayrıca titre edilmiş FAA dozlarında CD3 ve CD19 floresan antikorları ekleyin.
    NOT: Floresan antikor çalışma konsantrasyonları, parti bütünlüğünü doğrulamak için bağımsız olarak titre edilebilir. Uygun FAA doz aralıkları uygulamaya göre değişecektir, ancak iyi bir başlangıç noktası numune başına 50, 25, 10, 5 ve 1 μg'dir. 1 μL stok FAA çözeltisi 1 μg doza eşittir.
  6. Her numuneyi iyice karıştırın ve ışıktan kapalı olarak 30 dakika buz üzerinde inkübe edin.
  7. İnkübasyondan sonra, her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın. Numuneleri 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı aspire edin ve her tüpe 1 mL FACS tamponu ekleyerek yıkamayı tekrarlayın. Numuneleri 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.
  9. Süpernatanı aspire edin ve numuneleri 200 μL taze FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Örnekleri buzun üzerine yerleştirin ve sitometreye gidin.
  10. Örnekleri sitometrede çalıştırın ve en az 50.000 olay toplayın.

5. FAA titrasyon analizi ve etiketleme dozu optimizasyonu (1-2 saat)

  1. Akış sitometrisi analiz yazılımını kullanarak, tek hücreler için kapı.
  2. Tek hücrelerde, CD19 + (B hücreleri) ve CD3 + (T hücreleri) için kapılar yerleştirin.
  3. CD19 + ve CD3 + ana popülasyonları içinde, ilgili florokrom kanalındaki FAA + olayları için kapı.
  4. CD19 + ve CD3 + ebeveyn popülasyonları içindeki FAA + olaylarının yüzdesini kaydedin.
  5. CD19+ popülasyonundaki (spesifik) FAA+ olaylarının oranını, CD3+ popülasyonundaki (spesifik olmayan) FAA+ olaylarının oranına bölerek bir özgüllük oranı hesaplayın. Başarılı FAA kullanımı için özgüllük oranı maksimize edilmelidir.
  6. Gelecekteki deneyler için en yüksek özgüllük oranına karşılık gelen etiketleme dozunu kullanın.

Sonuçlar

Ağırlıkça belirlenen saflaştırılmış insülin-alkin verimi (Şekil 2, üst panel) tipik olarak %50-65 arasında değişmektedir. % 40'tan daha düşük verimler muhtemelen susuz DMSO'daki su kirliliğinden ve/veya propargil NHS-esterinin hidrolizinden kaynaklanmıştır. Antijen multimerizasyonu için (Şekil 1B), insülin antijen dizisinin saflaştırılmış verimi (Şekil 2, orta panel) %...

Tartışmalar

Antijene özgü B hücrelerini tanımlamak için özelleştirilmiş FAA'lar oluşturmak için bir protokol geliştirdik (Şekil 1), zor antijen hedefleri için B hücresi problarının oluşturulmasını basitleştirdik. FAA'ları oluşturmak için kolay bir substrat olarak terminal azid gruplarına sahip 4 kollu PEG polimerlerini seçtik, çünkü PEG suda çözünürlük sağlarken, fonksiyonel azid kolları basit tıklama konjugasyon reaksiyonlarını mü...

Açıklamalar

CJB, terapötik kullanımlarını araştırmak için SAgA teknolojisini lisanslayan bir şirket olan Orion Bioscience, Inc.'in kurucu ortağıdır. Bu rapor, Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Programı tarafından 1946099 No'lu Hibe kapsamında desteklenen çalışmalara dayanmaktadır. Bu materyalde ifade edilen herhangi bir görüş, bulgu ve sonuç veya tavsiye yazarlara aittir ve Ulusal Bilim Vakfı'nın görüşlerini yansıtmayabilir.

Teşekkürler

Veri toplama konusundaki yardımı için Colette Worcester'a teşekkür ederiz. Bu çalışma PhRMA Vakfı (JDG), Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Burs Programı (KDA) ve NIH hibeleri R21AI143407, R21AI144408 ve DP5OD023118 tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

Referanslar

  1. Murphy, K., Weaver, C. . Janeway's Immunobiology. , (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008 (2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440 (2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719 (2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P., Davis, W. C. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. , 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Tetramerik Floresan Antijen DizileriAntijene zg B H creleriFloresan Antijen retimiPEG Antijen KonjugatlarClick KimyasFlow SitometriProteolipid Proteinns linOtoantijenlerMultipl SklerozTip 1 DiyabetKo stim lasyonB H cre Yan tlarEx Vivo Analiz

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır