抗原特異的B細胞のシングルステップ同定のための四量体蛍光抗原アレイ

要約

このプロトコルでは、抗原特異的B細胞を標識するための蛍光プローブのカスタマイズ可能な製造と使用について詳しく説明しています。

要約

蛍光抗原の産生は、抗原特異的B細胞の同定における重要なステップです。ここでは、4アーム蛍光PEG-抗原コンジュゲートの調製、精製、および使用について詳しく説明し、同族のB細胞受容体との熱心な関与を通じて抗原特異的B細胞を選択的に同定します。モジュール式のクリックケミストリーと市販の蛍光色素キットケミストリーを用いて、多発性硬化症と1型糖尿病のマウスモデルでそれぞれ重要な自己抗原であるプロテオ脂質タンパク質(PLP_139-151)とインスリンの異なるアレイを作成することにより、カスタマイズされた蛍光PEG複合体を調製する汎用性を実証しました。アッセイは、フローサイトメトリーを使用して、それぞれの疾患モデルにおける各蛍光コンジュゲートについて開発されました。抗原アレイを一価自己抗原と比較し、PEG骨格への多量体化の利点を定量化しました。最後に、ex vivoでの抗原刺激後の抗インスリンB細胞応答を単離し評価することにより、このプラットフォームの有用性を示しました。インスリン特異的B細胞を標識することで、凝集体B細胞分析では抑制される共刺激(CD86)の変化を増幅して検出することが可能になりました。このレポートを組み合わせることで、B細胞集団をプローブするための堅牢なツールとして蛍光抗原アレイを作製し、使用することが可能になりました。

概要

適応免疫系は、自己免疫、がん、感染症など、多くの病態の進行や退行に重要な役割を果たしています¹。免疫病理学の研究や新しい精密治療の開発など、幅広いアプリケーションでは、疾患の進行の根底にある抗原特異的なB細胞およびT細胞応答を評価することがしばしば重要です^2,3,4。主要組織適合遺伝子複合体(MHC)四量体は、抗原特異的T細胞クローンを同定するために広く市販されています⁵。これらの蛍光色素標識コンストラクトは、4価ペプチド-MHC複合体を提示し、顕微鏡法やフローサイトメトリーなどの標識アプリケーションにおいて、同族のT細胞受容体と熱心に関与します。

B細胞調査用の抗原は、分子量、電荷、溶解度が非常に多様であることがあります^6,7。モノマー抗原を可溶性B細胞プローブとして使用する場合、物理化学的抗原特性は、はるかに大きな水溶性ストレプトアビジン分子との錯体化によって安定化されないか、または結合前にモノマー試薬として溶解性の問題が発生する可能性があります。したがって、一部のタンパク質は、実際には生体結合の困難さと予期しない結果を示します^7,8。直接蛍光色素の結合は、コンストラクトを水に不溶性で親油性にすることがあります。これらの直接色素抗原化合物は、細胞膜内に非特異的に包埋されやすく、抗原特異的解析を交絡させます^7,8,9。いくつかの戦略は、抗原および蛍光色素を他の官能基と結合させることにより、溶解性の課題を克服しています。例えば、Cambierらは、ビオチン化インスリンを天然の形で使用してインスリン特異的B細胞受容体(BCR)と関与させた後、フルオロフォア標識ストレプトアビジンを段階的に添加しました¹⁰。このアプローチにより、単量体インスリンに結合するB細胞を高分解能で評価することができましたが、2つの標識ステップが必要でした。一般的な蛍光抗体標識手順と容易に統合できる、すぐに使用できるポリマーベースのB細胞プローブの調製のための一般化可能なプロトコールは、疾患におけるB細胞の研究を促進するために有益です。

このプロトコールでは、顕微鏡法およびフローサイトメトリー実験用の抗原特異的B細胞の一般化可能なシングルステップ標識のための蛍光抗原アレイ(FAA)の製造と使用について詳しく説明します(図1)。可溶性抗原アレイ(SAgAs)は、自己免疫疾患に対するB細胞標的抗原特異的免疫療法として過去10年間にわたり使用されてきました11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.SAgAは、柔軟な高分子骨格上の多価抗原ディスプレイを活用して、B細胞受容体に熱心に結合し、免疫調節効果を誘発しますが、その抗原特異性は、蛍光色素²³に結合した場合に目的のB細胞をプローブするための別の機会を提供します。SAgAsを構成する高分子骨格は、生体高分子全体に水溶性を付与し、プローブの生成と染色特異性を混乱させる極端な抗原特性を減衰させることができる^6,24。私たちは、小さなペプチドエピトープと完全なタンパク質^14,18の使用を助長するモジュラークリックケミストリーを使用して、サイズと複雑さの異なる多数の抗原をSAgAプラットフォームに移植しました。ここでは、一般的な蛍光抗体標識と並行して使用できる堅牢な抗原特異的B細胞標識ツールとして、FAAを実証します。1型糖尿病のトランスジェニックマウスモデル(VH125)において、B細胞を標識するためのヒトインスリンからなるFAAと、多発性硬化症のマウスモデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)のペプチドエピトープであるタンパク質139-151(PLP)を組み込んだFAAを作製し、評価しました。これらの疾患モデルを採用する意図は、使用される抗原のモジュール式置換と、ペプチドエピトープ(PLP)と完全タンパク質(インスリン)の両方との使用の生存率の両方について、このプラットフォームの多様性を実証することでした。このプロトコールは、広範なバイオコンジュゲーションの専門知識を必要とせずに、アクセシビリティを目的として提示されています。試薬、合成法、精製法は、化学、分子生物学、免疫学を専門とするほとんどの研究室で汎用性が高く、容易に導入できるように設計されています。

プロトコル

この研究で表されているすべての動物手順は、カンザス大学の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。

1. 抗原アレイ合成(4-6日)

1. アルキンハンドル(1時間)で未修飾抗原を官能基化します。攪拌子付きの20 mLガラスバイアルに1相当のインスリン(100 mg、17.4 μmol)を加え、ヒートガンまたはウォーターバスを使用して40〜50°Cに穏やかに加熱して無水ジメチルスルホキシド(DMSO)(2 mL)に溶解します。
   1. 1,1,3,3-テトラメチルグアニジン(40.2 mg、348.8 μmol)と1.35相当量を新たに調製した78.5 mMプロパルギルN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS-エステル)ストック溶液を無水DMSO(0.3 mL、5.3 mg、23.6 μmol)に加えます。
   2. 室温で30分間撹拌し、0.05%HCl(12mL)で反応を急冷します。
2. 逆相液体クロマトグラフィー(4時間)により、単修飾インスリン-アルキンを精製します。分取 C18 カラム(19 mm × 250 mm、孔径 300 A、粒子径 5 μm)を使用し、30 〜 40% B グラジエント(A、0.05% トリフルオロ酢酸(TFA)を含む水)を 10 分間使用してください。B、アセトニトリル、0.05% TFA)および流速14 mL/分。目的の製品は、未修飾インスリンの直後に溶出します。
   1. アセトニトリルとTFAを窒素ガス流または減圧(650パスカル)および150rpmで回転させて回転蒸発させることにより蒸発させます。水溶液を凍結し、凍結乾燥させて乾燥させます。官能基インスリンは、乾燥した雰囲気下で-20°Cで保存してください。
      注:官能基化されたインスリンは、これらの保管条件下で最大1年間安定しています。.
3. 銅触媒を用いたアジド-アルキン環化付加反応(CuAAC)(2.5時間)²²により抗原アレイを合成する。攪拌子付きの10 mLガラスバイアルに6等量のインスリン-アルキン(38 mg、6.3 μmol)を加え、DMSO(1.2 mL)に穏やかに加熱して溶解します。
   1. pH 7.4の50 mMリン酸ナトリウム緩衝液(1.8 mL)、20 kDaの4アームPEGアジド(21 mg、1.05 μmol)1相当、硫酸銅(II)五水和物(3.15 mg、12.6 μmol)、トリス(3-ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル)アミン(27.37 mg、63 μmol)、およびアスコルビン酸ナトリウム(50.34 mg、254 μmol)を添加します。
   2. 室温で2時間撹拌し、DMSO(3 mL)を添加して沈殿物を可溶化し、溶液を0.05%HCl(4 mL)で酸性化します。
4. 抗原アレイを逆相液体クロマトグラフィー(3時間)で精製します。分取 C18 カラム (19 mm × 250 mm、ポアサイズ 300 A、粒子径 5 μm) を 10 分間 20–60% B グラジエント (A、水 0.05% TFA;B、アセトニトリル、0.05% TFA)および流速 14 mL/分。目的の生成物は、インスリン-アルキンの直後に溶出します。
   1. 窒素ガス流または減圧下での回転蒸発によりアセトニトリルを蒸発させます。水溶液を凍結し、凍結乾燥させて乾燥させます。乾燥した雰囲気下で-20°Cで保管してください。
      注:インスリン抗原アレイは非常に吸湿性があります。凍結乾燥された繊維は、大気に繰り返しさらされた後、密度の高いペレットに合体する可能性があります。FAAの特性は、使用するアプリケーション特異的抗原によって異なる場合があります。インスリン抗原アレイは、これらの保存条件下で数ヶ月間安定です。

2. フルオロフォア標識(1〜2日)

1. 蛍光色素を抗原アレイに結合させます(2.5時間)。攪拌子付きの20 mLガラスバイアルに1相当の4価インスリン(21.7 mg、0.5 μmol)を加え、DMSO(1.75 mL)に穏やかに加熱して溶解します。新たに調製した100 mM炭酸塩緩衝液(8 mL、pH 9.0)および5相当のフルオレセインイソチオシアネートを、新たに調製した10 mMのDMSO溶液(0.25 mL、0.97 mg、2.5 μmol)に加えます。室温で暗闇の中で2時間攪拌します。
2. 透析(24時間)により製品を精製します。攪拌した5 Lバケツに3.5 kDaの分子量カットオフ透析チューブを、蒸留水を入れた室温で常温で使用します。24時間透析し、6〜12時間ごとに透析液を交換します。
3. 透析溶液を凍結し、凍結乾燥して乾燥させ、FAAを生成します。-20°Cの乾燥した雰囲気の下で暗所で保管してください。
   注:FAAは、これらの保管条件下で数か月間安定しています。

3. FAAの特性評価(2〜4時間)

1. ステップ 1 および 2 の生成物を、Laemmli²⁵ (2 時間) に従ってドデシル硫酸ナトリウム - ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析します。精製された一価抗原5 μg、20 kDaの4アームPEGアジド、抗原アレイ、およびFAAを含むサンプルを調製します。
   1. FAAサンプル中の蛍光色素の標識を、ゲルイメージャーでの蛍光イメージングにより可視化します。
   2. クマシーブルー染色²⁶ を行い、抗原を可視化する。
   3. ヨウ素染色²⁷ を行い、PEG骨格を可視化する。ゲルを蒸留水ですすぎ(3 × 2 分)、5% 塩化バリウム溶液(20 mL)で 10 分間インキュベートし、蒸留水ですすぎ(3 × 2 分)、0.1 N ヨウ素溶液(20 mL)で 1 分間インキュベートした後、蒸留水ですすいで(3 × 2 分)バックグラウンド染色を除去してから可視化します。
      注:0.1 Nのヨウ素溶液を作るには、ヨウ化カリウム(2.0 g、12 mmol)とヨウ素(1.27 g、5 mmol)を100 mLの蒸留水に加えます。
2. UV-Vis分光法(1時間)により、染料標識の程度を計算します。少量のFAAを0.1 mg/mLで溶解し、280 nmでの吸光度と色素のピーク吸収波長を記録します。抗原と色素のモル吸光係数を取得します。
   注:一部の染料はpHに敏感です。FAA吸光度を測定する際には、pH 8.3の100 mM炭酸塩緩衝液のような適切な緩衝液を使用し、報告された色素吸光係数が正確であることを確認してください。
   1. ここで_{、A染料、maxλ}は染料のピーク吸収波長におけるFAA吸光度、E_{染料、maxλ}は染料のピーク吸収波長におけるモル吸光係数、E_{抗原、280nmは280nm}での一価抗原のモル吸光係数である、以下の計算^{28を実行する}。
      補正係数 (CF) = A_{色素、280 nm} / A_{色素、最大λ} 0.25 * (A_{色素、最大λ} / E_{色素、最大λ}) * (E_{抗原、280 nm} / (A_{280 nm} – (A_{色素、最大λ} * CF))) = 色素 / FAA
3. RP-HPLCによる遊離色素または潜在的な劣化生成物についてFAAを分析します(1時間)。
   1. 少量の FAA を 1.0 mg/mL で溶解し、分析 C18 カラム(4.6 mm × 150 mm、孔径 300 A、粒子径 2.5 μm)で 10 分間の 5–95% B グラジエント(A、0.05% トリフルオロ酢酸を含む水:B、0.05% トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル)を流速 1 mL/分で分析します。UV-Vis検出器を、色素のピーク吸光度波長(FITCの場合は437 nm)をモニターするように設定します。
      注:pH感受性色素の場合、酸性溶媒中でのHPLC分析では、中性の水性条件でモニター波長を色素のピーク吸収波長からシフトする必要がある場合があります。0.05% TFA では、pH は約 3 で、FITC の最大吸収率はシフトしています。

4. FAA滴定法によるアッセイ開発(3-5時間)

注:フローサイトメトリーに対するFAAの使用が示されていますが、免疫組織化学や蛍光顕微鏡などの他の形式で使用するために同じ手順を変更することができます。新しいフォーマットにFAAを適用する場合、新しい最適化アッセイを完了する必要があります。混合または単離された細胞集団は、血液またはリンパ器官の処理方法^23,29を通じて得ることができる。組織の酵素消化による収穫は、細胞表面マーカーが脱落する可能性があるため、推奨されません。

1. FAAストックをFACSバッファー(1x PBS + 5%ウシ胎児血清および0.1%アジ化ナトリウム)に1 mg / mLに懸濁します。溶解を加速するために、最大10%のDMSOを組み込むことができます。
2. 目的の抗原特異的B細胞に陽性の細胞を取得し、微量遠心チューブに分注します。約1 x 10 合計⁷ 個のセルが必要になります。
   注:脾臓細胞は、現在のデモンストレーションのためにカンザス大学のIACUC承認プロトコルに従ってVH125およびEAEマウスから採取されました。研究者は、自身のアプリケーションおよびFAA調製に特異的な細胞サンプルについて、本明細書に記載の方法を採用することができる。
   1. 滴定標識の反復のために5 x 10⁵ 細胞を分注します(滴定ごとに少なくとも3回の反復)。
   2. 1 x 10⁵ 細胞を分注し、単一染色コントロールおよび未染色コントロールに使用します。
      注:抗体アイソタイプと蛍光から1つのコントロールを差し引いたものを使用して、アッセイを完全に検証することもできます。
3. 各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。200 x g で5分間遠心分離します。
4. 上清を吸引し、細胞ペレットを50μLのFACSバッファーに再懸濁します。
5. CD3およびCD19蛍光抗体を各サンプルに、メーカー推奨濃度で、および漸増したFAA用量で添加します。
   注:蛍光抗体の使用濃度は、ロットの完全性を確認するために独立して滴定できます。適切なFAAの用量範囲はアプリケーションによって異なりますが、サンプルあたり50、25、10、5、および1μgから始めるのが適切です。1 μLのFAA溶液は1 μgの用量に相当します。
6. 各サンプルをよく混合し、光を避けて氷上で30分間インキュベートします。
7. インキュベーション後、各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。サンプルを200 x g で5分間遠心分離します。
8. 上清を吸引し、各チューブに1 mLのFACSバッファーを加えて洗浄を繰り返します。サンプルを200 x g で5分間遠心分離します。
9. 上清を吸引し、サンプルを200 μLの新鮮なFACSバッファーに再懸濁します。サンプルを氷の上に置き、サイトメーターに向かいます。
10. サイトメーターでサンプルを分析し、少なくとも50,000のイベントを収集します。

5. FAA滴定分析と標識用量の最適化(1〜2時間)

1. フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用して、単一細胞をゲートします。
2. シングルセル上に、CD19+(B細胞)およびCD3+(T細胞)のゲートを配置します。
3. CD19+およびCD3+の親集団内で、関連する蛍光色素チャネルでFAA+イベントにゲートします。
4. CD19+ および CD3+ 親集団内の FAA+ イベントの割合を記録します。
5. CD19+集団におけるFAA+イベントの割合(特異的)をCD3+集団におけるFAA+イベントの割合(非特異的)で割って、特異度比を計算します。特異性比は、FAAの使用を成功させるために最大化する必要があります。
6. 将来の実験では、最も高い特異度比に対応する標識用量を使用してください。

結果

インスリン-アルキンの精製収率(図2、上パネル)は、重量で決定され、通常50〜65%の範囲で変動しました。収率が40%未満だったのは、無水DMSOの水質汚染やプロパルギルNHSエステルの加水分解が原因である可能性が高い。抗原多量体化(図1B)では、インスリン抗原アレイ(図2、中央パネル)の精製収率は60?...

ディスカッション

私たちは、抗原特異的なB細胞を同定するためのカスタマイズされたFAAを構築するためのプロトコル(図1)を開発し、困難な抗原標的に対するB細胞プローブの生成を簡素化しました。我々は、PEGが水溶性を付与する一方で、官能的なアジドハンドルが簡単なクリック結合反応を可能にするため、FAAを構築するための容易な基質として末端アジド基?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,3,3-tetramethylguanidine	Alfa Aesar	AAA12314AC
12 M hydrochloric acid	Fisher Chemical	A508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ul	Bio-Rad	4561043
20 kDa 4-arm PEG azide	Jenkem USA	A7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)	Fisher Scientific	25-152-10
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Chemical	A998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 Antibody	BioLegend	115522
anhydrous dimethylsulfoxide	ACROS Organics	AC610420010
barium chloride	ACROS Organics	203135000
Brilliant Blue G-250 Dye	Fisher BioReagents	BP100-50
Cell Prime r-insulin	EMD Millipore	4512-01	Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrate	ACROS Organics	AC197722500
dimethylsulfoxide	Fisher Chemical	S67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1	Sigma-Aldrich	F7250-1G
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Glycerol	ACROS Organics	15892-0010
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
homopropargyl-PLP	Biomatik	NA	Custom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodine	Sigma-Aldrich	207772-100G
Methanol, HPLC grade	Fisher Chemical	A452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomer	Thermo Scientific	46406	A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Antibody	BioLegend	100220
potassium iodide	Sigma-Aldrich	30315
propargyl N-hydroxysuccinimide ester	Sigma-Aldrich	764221
sodium ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
sodium dodecyl sulfate	Fisher BioReagents	BP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Fisher Chemical	S468-500
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	302031-10x1mL
Tris base	Fisher BioReagents	BP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine	ClickChemTools	1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm column	Waters	186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mm	Waters	186004021