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Neste Artigo

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Resumo

Este protocolo detalha a produção e o uso personalizáveis de sondas fluorescentes para rotular células B específicas do antígeno.

Resumo

A produção de antígenos fluorescentes é uma etapa crítica na identificação de células B específicas do antígeno. Aqui, detalhamos a preparação, purificação e o uso de conjugados de antígeno PEG fluorescente de quatro braços para identificar seletivamente células B específicas do antígeno por meio do envolvimento ávido com receptores de células B cognatos. Usando química de clique modular e produtos químicos de kit de fluoróforo disponíveis comercialmente, demonstramos a versatilidade da preparação de conjugados de PEG fluorescentes personalizados, criando matrizes distintas para proteína proteolipídica (PLP139-151) e insulina, que são autoantígenos importantes em modelos murinos de esclerose múltipla e diabetes tipo 1, respectivamente. Ensaios foram desenvolvidos para cada conjugado fluorescente em seu respectivo modelo de doença usando citometria de fluxo. As matrizes de antígenos foram comparadas ao autoantígeno monovalente para quantificar o benefício da multimerização nos backbones do PEG. Finalmente, ilustramos a utilidade dessa plataforma isolando e avaliando as respostas das células B anti-insulina após estimulação do antígeno ex vivo. A marcação de células B específicas para insulina permitiu a detecção amplificada de alterações na co-estimulação (CD86) que, de outra forma, seriam atenuadas na análise agregada de células B. Juntos, este relatório permite a produção e o uso de matrizes de antígenos fluorescentes como uma ferramenta robusta para sondar populações de células B.

Introdução

O sistema imunológico adaptativo desempenha um papel crítico na progressão ou regressão de muitos estados de doença, incluindo autoimunidade, câncer e doenças infecciosas1. Para aplicações amplas, incluindo o estudo de imunopatologia ou o desenvolvimento de novos tratamentos de precisão, muitas vezes é crítico avaliar as respostas de células B e T específicas do antígeno subjacentes à progressão da doença 2,3,4. Os tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) estão ampla e comercialmente disponíveis para identificar clones de células T antígeno-específicos5. Essas construções marcadas com fluoróforo apresentam complexos peptídeo-MHC quadrivalentes para se envolver avidamente com receptores de células T cognatas para aplicações de rotulagem, como microscopia e citometria de fluxo.

Os antígenos para interrogação de células B podem apresentar pesos moleculares, cargas e solubilidades altamente variados 6,7. Ao usar antígeno monomérico como sondas de células B solúveis, as propriedades físico-químicas do antígeno podem não ser estabilizadas por meio da complexação com a molécula de estreptavidina solúvel em água muito maior, ou podem apresentar problemas de solubilidade como reagentes monoméricos antes da conjugação. Assim, algumas proteínas apresentam dificuldades de bioconjugação e resultados inesperados na prática 7,8. A conjugação direta de corantes fluorescentes às vezes pode tornar as construções insolúveis em água e lipofílicas. Esses compostos de antígeno corante direto são suscetíveis à incorporação inespecífica nas membranas celulares, confundindo as análises específicas do antígeno 7,8,9. Algumas estratégias superaram os desafios de solubilidade acoplando antígenos e fluoróforos com outros grupos funcionais. Cambier et al., por exemplo, empregaram insulina biotinilada em sua forma nativa para se envolver com receptores de células B específicos para insulina (BCRs) antes de adicionar estreptavidina marcada com fluoróforo de forma gradual10. Embora essa abordagem tenha permitido a avaliação de células B que se ligam à insulina monomérica com alta resolução, foram necessárias duas etapas de rotulagem. Um protocolo generalizável para a preparação de sondas de células B à base de polímero prontas para uso, prontamente integradas aos procedimentos comuns de marcação de anticorpos fluorescentes, seria benéfico para promover o estudo das células B na doença.

Neste protocolo, detalhamos a produção e o uso de matrizes de antígenos fluorescentes (FAAs) para a marcação generalizável e de etapa única de células B específicas do antígeno para experimentos de microscopia e citometria de fluxo (Figura 1). Matrizes de antígenos solúveis (SAgAs) têm sido empregadas na última década como imunoterapias específicas de antígenos direcionados a células B contra doenças autoimunes 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Os SAgAs aproveitam a exibição de antígenos multivalentes em backbones poliméricos flexíveis para envolver avidamente os receptores de células B e provocar efeitos imunomoduladores, embora sua especificidade de antígeno forneça outra oportunidade para sondar células B de interesse quando acopladas a um fluoróforo23. Os esqueletos poliméricos que constituem as SAgAs conferem solubilidade em água à biomacromolécula geral e podem amortecer as características de antígeno às vezes extremas que confundem a geração de sonda e a especificidade da coloração 6,24. Enxertamos vários antígenos que variam em tamanho e complexidade na plataforma SAgA usando química de clique modular, que é propícia ao uso de pequenos epítopos peptídicos e proteínas completas14,18. Aqui, demonstramos FAAs como ferramentas robustas de marcação de células B específicas para antígenos que podem ser usadas em paralelo com a marcação típica de anticorpos fluorescentes. Preparamos e avaliamos FAAs consistindo de insulina humana para marcação de células B em um modelo de camundongo transgênico de diabetes tipo 1 (VH125), bem como FAAs que incorporaram proteína proteolipídica 139-151 (PLP), um epítopo peptídico para encefalomielite autoimune experimental (EAE), o modelo de camundongo de esclerose múltipla. Nossa intenção ao empregar esses modelos de doenças foi demonstrar a versatilidade dessa plataforma, tanto para a substituição modular de antígenos utilizados, quanto para a viabilidade de uso com epítopos peptídicos (PLP) e proteínas completas (insulina). Este protocolo é apresentado com o objetivo de acessibilidade, sem a necessidade de ampla experiência em bioconjugação. Os reagentes, bem como os métodos de síntese e purificação, são projetados para serem versáteis e prontamente implementados na maioria dos laboratórios de pesquisa focados em química, biologia molecular ou imunologia.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais representados neste trabalho foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Kansas.

1. Síntese de matriz de antígenos (4–6 dias)

  1. Funcionalizar o antigénio não modificado com um cabo alcino (1 h). Adicione 1 insulina equivalente (100 mg, 17,4 μmol) a um frasco de vidro de 20 ml com uma barra de agitação e dissolva em dimetilsulfóxido anidro (DMSO) (2 ml) com aquecimento suave a 40-50 °C utilizando uma pistola de calor ou banho-maria.
    1. Adicionar 1,1,3,3-tetrametilguanidina (40,2 mg, 348,8 μmol) e 1,35 equivalentes de solução-mãe de éster N-hidroxisuccinimida de propargil a 78,5 mM (éster NHS) recentemente preparada em DMSO anidro (0,3 ml, 5,3 mg, 23,6 μmol).
    2. Mexa por 30 min em temperatura ambiente e depois apague a reação com 0,05% de HCl (12 mL).
  2. Purificar a insulina-alcino modificada individualmente por cromatografia líquida de fase inversa (4 h). Use uma coluna preparativa C18 (19 mm x 250 mm, tamanho de poro de 300 A, tamanho de partícula de 5 μm) com um gradiente de 10 min de 30 a 40% B (A, água com ácido trifluoroacético (TFA) a 0,05%; B, acetonitrila com TFA 0,05%) e vazão de 14 mL/min. O produto desejado elui imediatamente após a insulina não modificada.
    1. Evaporar acetonitrilo e TFA por fluxo de gás nitrogênio ou evaporação rotativa sob pressão reduzida (650 Pascals) e girando a 150 rpm. Congelar a solução aquosa e liofilizar até à secura. Armazene insulina funcionalizada a -20 ° C em uma atmosfera seca.
      NOTA: A insulina funcionalizada é estável por até um ano nessas condições de armazenamento.
  3. Sintetize a matriz de antígenos por cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre (CuAAC) (2,5 h) 22 . Adicione 6 equivalentes de insulina-alcino (38 mg, 6,3 μmol) a um frasco de vidro de 10 mL com uma barra de agitação e dissolva em DMSO (1,2 mL) com aquecimento suave.
    1. Adicione tampão fosfato de sódio 50 mM (1,8 mL) pH 7,4, 1 equivalente a 20 kDa PEG azida de 4 braços (21 mg, 1,05 μmol), sulfato de cobre (II) pentahidratado (3,15 mg, 12,6 μmol), Tris (3-hidroxipropiltriazolilmetil) amina (27,37 mg, 63 μmol) e ascorbato de sódio (50,34 mg, 254 μmol).
    2. Agitar durante 2 h à temperatura ambiente e, em seguida, adicionar DMSO (3 ml) para solubilizar quaisquer precipitados e acidificar a solução com HCl a 0,05% (4 ml).
  4. Purificar a matriz de antigénios por cromatografia líquida de fase inversa (3 h). Use uma coluna preparativa C18 (19 mm x 250 mm, tamanho de poro de 300 A, tamanho de partícula de 5 μm) com um gradiente de 10 min de 20 a 60% B (A, água com 0,05% de TFA; B, acetonitrila com 0,05% de TFA) e uma taxa de fluxo de 14 ml/min. O produto desejado elui imediatamente após a insulina-alcino.
    1. Evaporar a acetonitrila por fluxo de gás nitrogênio ou evaporação rotativa sob pressão reduzida. Congelar a solução aquosa e liofilizar até à secura. Conservar a -20 °C em atmosfera seca.
      NOTA: O conjunto de antígenos de insulina é altamente higroscópico. As fibras liofilizadas podem coalescer em uma pelota densa após exposição repetida à atmosfera. As propriedades da FAA podem diferir dependendo do antígeno específico da aplicação usado. A matriz de antígenos de insulina é estável por vários meses nessas condições de armazenamento.

2. Conjugação de fluoróforo (1–2 dias)

  1. Conjugar o fluoróforo com a matriz de antigénios (2,5 h). Adicione 1 insulina tetravalente equivalente (21,7 mg, 0,5 μmol) a um frasco de vidro de 20 mL com barra de agitação e dissolva em DMSO (1,75 mL) com aquecimento suave. Adicionar tampão carbonato 100 mM (8 ml) pH 9,0 e 5 equivalentes de isotiocianato de fluoresceína recentemente preparado numa solução-mãe 10 mM recentemente preparada em DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Mexa por 2 h no escuro em temperatura ambiente.
  2. Purifique o produto por diálise (24 h). Use um tubo de diálise de corte de peso molecular de 3.5 kDa em um balde agitado de 5 L com água destilada no escuro em temperatura ambiente. Dialize por 24 h e troque a solução de diálise a cada 6–12 h.
  3. Congele a solução dialisada e liofilize até a secura para produzir o FAA. Conservar à escura e em atmosfera seca a -20 °C.
    NOTA: A FAA é estável por vários meses sob essas condições de armazenamento.

3. Caracterização da FAA (2–4 h)

  1. Analisar os produtos das etapas 1 e 2 por eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida de acordo com Laemmli25 (2 h). Prepare amostras contendo 5 μg de antígeno monovalente purificado, 20 kDa PEG azida de 4 braços, matriz de antígenos e FAA.
    1. Visualize a marcação de fluoróforos nas amostras da FAA por imagem de fluorescência em um gerador de imagens em gel.
    2. Execute a coloração azul de Coomassie26 para visualizar o antígeno.
    3. Realize a coloração de iodo27 para visualizar a espinha dorsal do PEG. Enxágue o gel em água destilada (3 x 2 min), incube em solução de cloreto de bário a 5% (20 mL) por 10 min, enxágue em água destilada (3 x 2 min), incube em solução de iodo 0,1 N (20 mL) por 1 min e depois enxágue em água destilada (3 x 2 min) para remover a coloração de fundo antes da visualização.
      NOTA: Para fazer uma solução de iodo 0.1 N, adicione iodeto de potássio (2.0 g, 12 mmol) e iodo (1.27 g, 5 mmol) a 100 mL de água destilada.
  2. Calcular o grau de marcação do corante por espectroscopia UV-Vis (1 h). Dissolver uma pequena quantidade de FAA a 0,1 mg/ml e registar a absorvância a 280 nm e o comprimento de onda de pico de absorção do corante. Obter os coeficientes de extinção molar para o antigénio e o corante.
    NOTA: Alguns corantes são sensíveis ao pH. Certifique-se de usar uma solução tamponada apropriadamente, como tampão de carbonato de 100 mM com pH 8,3 ao medir a absorbância da FAA para garantir que o coeficiente de extinção de corante relatado seja preciso.
    1. Efectuar o seguinte cálculo28 em que ADye, maxλ é a absorbância FAA no comprimento de onda de absorção de pico para o corante, EDye, maxλ é o coeficiente de extinção molar no comprimento de onda de absorção de pico para o corante e Eantigénio, 280 nm é o coeficiente de extinção molar para o antigénio monovalente a 280 nm.:
      Fator de correção (CF) = ADye, 280 nm / ADye, maxλ 0.25 * (ADye, maxλ / EDye, maxλ) * (E antígeno, 280 nm / (A280 nm – (ADye, maxλ * CF))) = corante/FAA
  3. Analise o FAA para corante livre ou produtos de degradação potencial por RP-HPLC (1 h).
    1. Dissolva uma pequena quantidade de FAA a 1,0 mg / mL e analise com uma coluna analítica C18 (4,6 mm x 150 mm, tamanho de poro de 300 A, tamanho de partícula de 2,5 μm) usando um gradiente de 10 min de 5 a 95% B (A, água com ácido trifluoroacético a 0,05%; B, acetonitrila com ácido trifluoroacético a 0,05%) com uma taxa de fluxo de 1 mL / min. Defina o detector UV-Vis para monitorar o comprimento de onda de absorbância de pico do corante (437 nm para FITC).
      NOTA: Para corantes sensíveis ao pH, a análise por HPLC em solventes acidificados pode exigir o deslocamento do comprimento de onda monitorado do comprimento de onda de absorção de pico do corante em condições aquosas neutras. Em 0,05% de TFA, o pH é de aproximadamente 3 e a absorção máxima para FITC mudou.

4. Desenvolvimento do ensaio por titulação FAA (3–5 h)

NOTA: O uso da FAA para citometria de fluxo é apresentado, mas as mesmas etapas podem ser modificadas para uso em outros formatos, como imuno-histoquímica ou microscopia fluorescente. Ao aplicar FAAs para um novo formato, um novo ensaio de otimização deve ser concluído. Populações de células mistas ou isoladas podem ser obtidas por meio de métodos de processamento de sangue ou órgãos linfóides23,29. A colheita por meio da digestão enzimática do tecido não é recomendada, pois os marcadores de superfície das células podem ser eliminados.

  1. Suspenda o estoque de FAA a 1 mg/mL em tampão FACS (1x PBS + 5% de soro fetal bovino e 0,1% de azida sódica). Até 10% de DMSO pode ser incorporado para acelerar a dissolução.
  2. Obtenha células positivas para células B específicas do antígeno de interesse e dispense em tubos de microcentrífuga. Aproximadamente 1 x 107 células no total serão necessárias.
    NOTA: Os esplenócitos foram colhidos de camundongos VH125 e EAE de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC na Universidade do Kansas para a presente demonstração. Os pesquisadores podem empregar os métodos aqui descritos para amostras de células específicas para sua própria aplicação e preparação de FAA.
    1. Dispense 5 x 105 células para réplicas de rotulagem de titulação (pelo menos 3 réplicas por titulação).
    2. Dispense 1 x 105 células para controles de coloração única, bem como um controle sem coloração.
      NOTA: Os isotipos de anticorpos e a fluorescência menos um controlo também podem ser utilizados para validar totalmente o ensaio.
  3. Lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS a cada tubo. Centrifugue a 200 x g por 5 min.
  4. Aspirar o sobrenadante e ressuspender os grânulos celulares em 50 μL de tampão FACS.
  5. Adicione anticorpos fluorescentes CD3 e CD19 a cada amostra nas concentrações recomendadas pelo fabricante, bem como nas doses tituladas da FAA.
    NOTA: As concentrações de trabalho de anticorpos fluorescentes podem ser tituladas independentemente para confirmar a integridade do lote. Os intervalos de dose apropriados da FAA variam de acordo com a aplicação, mas um bom ponto de partida é 50, 25, 10, 5 e 1 μg por amostra. 1 μL de solução estoque de FAA equivale a 1 μg de dose.
  6. Misture bem cada amostra e incube coberto de luz, no gelo por 30 min.
  7. Após a incubação, lave as células adicionando 1 mL de tampão FACS a cada tubo. Centrifugue as amostras a 200 x g por 5 min.
  8. Aspire o sobrenadante e repita a lavagem adicionando 1 mL de tampão FACS a cada tubo. Centrifugue as amostras a 200 x g por 5 min.
  9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 200 μL de tampão FACS fresco. Coloque as amostras no gelo e dirija-se ao citômetro.
  10. Execute as amostras no citômetro e colete pelo menos 50.000 eventos.

5. Análise de titulação FAA e otimização da dose de rotulagem (1–2 h)

  1. Usando o software de análise de citometria de fluxo, porta para células individuais.
  2. Em células individuais, coloque portas para CD19+ (células B) e CD3+ (células T).
  3. Dentro das populações parentais CD19+ e CD3+, portão para eventos FAA+ no canal de fluorocromo relevante.
  4. Registre a porcentagem de eventos FAA + nas populações de pais CD19 + e CD3 +.
  5. Calcule uma razão de especificidade dividindo a proporção de eventos FAA+ na população CD19+ (específica) pela proporção de eventos FAA+ na população CD3+ (inespecífica). A taxa de especificidade deve ser maximizada para o uso bem-sucedido da FAA.
  6. Empregar a dose de marcação correspondente à maior razão de especificidade para experimentos futuros.

Resultados

O rendimento purificado de insulina-alcino (Figura 2, painel superior), determinado pelo peso, variou tipicamente de 50 a 65%. Rendimentos inferiores a 40% foram provavelmente causados pela contaminação da água no DMSO anidro e/ou hidrólise do éster propargyl NHS. Para multimerização de antígeno (Figura 1B), o rendimento purificado da matriz de antígenos de insulina (Figura 2, painel do mei...

Discussão

Desenvolvemos um protocolo (Figura 1) para construir FAAs personalizados para identificar células B específicas do antígeno, simplificando a geração de sondas de células B para alvos de antígenos difíceis. Selecionamos polímeros PEG de 4 braços com grupos azida terminais como um substrato fácil para a construção de FAAs, pois o PEG confere solubilidade em água, enquanto as alças de azida funcionais permitem reações de conjugação de clique ...

Divulgações

CJB é cofundador da Orion Bioscience, Inc., uma empresa que licencia a tecnologia SAgA para investigar seus usos terapêuticos. Este relatório é baseado no trabalho apoiado pelo Programa de Pesquisa de Pós-Graduação da National Science Foundation sob a concessão nº 1946099. Quaisquer opiniões, descobertas e conclusões ou recomendações expressas neste material são de responsabilidade dos autores e não refletem necessariamente as opiniões da National Science Foundation.

Agradecimentos

Agradecemos a Colette Worcester pela ajuda na coleta de dados. Este trabalho foi apoiado pela PhRMA Foundation (JDG), pelo National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (KDA) e pelas bolsas do NIH R21AI143407, R21AI144408 e DP5OD023118.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

Referências

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