JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הייצור והשימוש הניתנים להתאמה אישית של בדיקות פלואורסצנטיות לתיוג תאי B ספציפיים לאנטיגן.

Abstract

ייצור אנטיגן פלואורסצנטי הוא שלב קריטי בזיהוי תאי B ספציפיים לאנטיגן. כאן, פירטנו את ההכנה, הטיהור והשימוש במצומדי אנטיגן PEG-אנטיגן פלואורסצנטיים בעלי ארבע זרועות לזיהוי סלקטיבי של תאי B ספציפיים לאנטיגן באמצעות מעורבות נלהבת עם קולטני תאי B קוגנטיים. באמצעות כימיה מודולרית של קליק וכימיה של ערכת פלואורופור הזמינה מסחרית, הדגמנו את הרבגוניות של הכנת מצומדים פלואורסצנטיים מותאמים אישית על ידי יצירת מערכים נפרדים לחלבון פרוטאוליפיד (PLP139-151) ואינסולין, שהם אוטואנטיגנים חשובים במודלים של עכברים של טרשת נפוצה וסוכרת מסוג 1, בהתאמה. בדיקות פותחו עבור כל מצומד פלואורסצנטי במודל המחלה המתאים לו באמצעות ציטומטריית זרימה. מערכי אנטיגן הושוו לאוטואנטיגן חד-ערכי כדי לכמת את התועלת של מולטימריזציה על עמוד השדרה של PEG. לבסוף, הדגמנו את התועלת של פלטפורמה זו על ידי בידוד והערכה של תגובות תאי אנטי-אינסולין B לאחר גירוי אנטיגן ex vivo. תיוג תאי B ספציפיים לאינסולין איפשר זיהוי מוגבר של שינויים בגירוי משותף (CD86) שאחרת היו מופחתים בניתוח תאי B מצטבר. יחד, דוח זה מאפשר ייצור ושימוש במערכי אנטיגן פלואורסצנטיים ככלי חזק לחקירת אוכלוסיות תאי B.

Introduction

מערכת החיסון הנרכשת ממלאת תפקיד קריטי בהתקדמות או רגרסיה של מצבי מחלה רבים, כולל אוטואימוניות, סרטן ומחלות זיהומיות1. עבור יישומים רחבים כולל חקר אימונופתולוגיה או פיתוח טיפולים מדויקים חדשים, לעתים קרובות קריטי להעריך את תגובות תאי B ו-T ספציפיות לאנטיגן העומדות בבסיס התקדמות המחלה 2,3,4. טטרמרים של קומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי (MHC) זמינים באופן נרחב ומסחרי לזיהוי שיבוטים של תאי T ספציפיים לאנטיגן5. מבנים אלה המסומנים בפלואורופור מציגים קומפלקסים מרובעים של פפטיד-MHC כדי לעסוק בשקיקה בקולטני תאי T קוגנטיים ליישומי תיוג כגון מיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית.

אנטיגנים לחקירת תאי B יכולים להציג משקלים מולקולריים, מטענים ומסיסות מגוונים ביותר 6,7. בעת שימוש באנטיגן מונומרי כבדיקות תאי B מסיסים, ייתכן שתכונות האנטיגן הפיזיקוכימיות לא יתייצבו באמצעות קומפלקס עם מולקולת הסטרפטווידין המסיסה במים הגדולה בהרבה, או עלולות להציג בעיות מסיסות כריאגנטים מונומריים לפני הצימוד. לפיכך, חלק מהחלבונים מציגים קשיים ביולוגיים ותוצאות בלתי צפויות בתרגול 7,8. צימוד צבע פלואורסצנטי ישיר יכול לפעמים להפוך מבנים לבלתי מסיסים במים וליפופילים. תרכובות אנטיגן צבע ישירות אלה רגישות להטמעה לא ספציפית בתוך קרומי התאים, מה שמבלבל ניתוחים ספציפיים לאנטיגן 7,8,9. אסטרטגיות מסוימות התגברו על אתגרי המסיסות על ידי צימוד אנטיגן ופלואורופורים עם קבוצות פונקציונליות אחרות. Cambier et al., למשל, השתמשו באינסולין ביוטיניל בצורתו המקורית כדי לעסוק בקולטני תאי B ספציפיים לאינסולין (BCR) לפני הוספת סטרפטווידין עם תווית פלואורופור בצורה הדרגתית10. בעוד שגישה זו אפשרה הערכה של תאי B הנקשרים לאינסולין מונומרי ברזולוציה גבוהה, נדרשו שני שלבי תיוג. פרוטוקול הניתן להכללה להכנת בדיקות תאי B מבוססות פולימר מוכנות לשימוש המשולב בקלות עם הליכי תיוג נוגדנים פלואורסצנטיים נפוצים יועיל לקידום המחקר של תאי B במחלה.

בפרוטוקול זה, אנו מפרטים את הייצור והשימוש במערכי אנטיגן פלואורסצנטיים (FAAs) עבור תיוג חד-שלבי וניתן להכללה של תאי B ספציפיים לאנטיגן עבור ניסויי מיקרוסקופיה וזרימה ציטומטרית (איור 1). מערכי אנטיגן מסיסים (SAgAs) שימשו בעשור האחרון כאימונותרפיה ספציפית לאנטיגן ממוקד תאי B כנגד מחלות אוטואימוניות 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . SAgAs ממנפים תצוגת אנטיגן רב-ערכית על עמודי שדרה פולימריים גמישים כדי לעסוק בשקיקה בקולטני תאי B ולעורר השפעות אימונומודולטוריות, אם כי ספציפיות האנטיגן שלהם מספקת הזדמנות נוספת לחקור תאי B מעניינים כאשר הם מחוברים לפלואורופור23. עמודי השדרה הפולימריים המרכיבים SAgAs מעניקים מסיסות במים לביו-מקרומולקולה הכוללת ויכולים להפחית את מאפייני האנטיגן הקיצוניים לפעמים המבלבלים את יצירת הבדיקה ואת ספציפיות הצביעה 6,24. השתלנו אנטיגנים רבים בגודל ובמורכבות על פלטפורמת SAgA באמצעות כימיית קליק מודולרית, התורמת לשימוש באפיטופים קטנים של פפטידים וחלבונים מלאים14,18. כאן, אנו מדגימים FAAs ככלי תיוג תאי B חזקים ספציפיים לאנטיגן שניתן להשתמש בהם במקביל לתיוג נוגדנים פלואורסצנטיים טיפוסיים. הכנו והערכנו FAAs המורכבים מאינסולין אנושי לתיוג תאי B במודל עכבר טרנסגני של סוכרת מסוג 1 (VH125), כמו גם FAAs ששילבו חלבון פרוטאוליפיד 139-151 (PLP), אפיטופ פפטיד לדלקת מוח אוטואימונית ניסיונית (EAE), מודל העכבר של טרשת נפוצה. כוונתנו בשימוש במודלים אלה של מחלות הייתה להדגים את הרבגוניות של פלטפורמה זו, הן להחלפה מודולרית של אנטיגנים המשמשים, והן לכדאיות השימוש עם אפיטופים פפטידיים (PLP) וחלבונים מלאים (אינסולין) כאחד. פרוטוקול זה מוצג במטרה להנגיש, ללא צורך במומחיות נרחבת בביו-צימוד. הריאגנטים, כמו גם שיטות הסינתזה והטיהור, מתוכננים להיות מגוונים ומיושמים בקלות ברוב מעבדות המחקר המתמקדות בכימיה, ביולוגיה מולקולרית או אימונולוגיה.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים המיוצגים בעבודה זו אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קנזס.

1. סינתזת מערך אנטיגן (4-6 ימים)

  1. פונקציונליזציה של אנטיגן לא שונה עם ידית אלקין (1 שעה). הוסיפו אינסולין שווה ערך אחד (100 מ"ג, 17.4 מיקרומול) לבקבוקון זכוכית של 20 מ"ל עם מוט ערבוב והמיסו בדימתיל-סולפוקסיד נטול מים (DMSO) (2 מ"ל) עם חימום עדין ל-40-50 מעלות צלזיוס באמצעות אקדח חום או אמבט מים.
    1. הוסף 1,1,3,3-טטרמתילגואנידין (40.2 מ"ג, 348.8 מיקרומול) ו-1.35 שווה ערך לתמיסת מלאי 78.5 מ"מ פרופרגיל N-hydroxysuccinimide אסטר (NHS-ester) שהוכנה טרי ב-DMSO נטול מים (0.3 מ"ל, 5.3 מ"ג, 23.6 מיקרומול).
    2. מערבבים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ואז מרווים את התגובה עם 0.05% HCl (12 מ"ל).
  2. טהר את האינסולין-אלקין שהשתנה בנפרד על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בפאזה הפוכה (4 שעות). השתמש בעמודת C18 מכינה (19 מ"מ x 250 מ"מ, גודל נקבוביות 300 A, גודל חלקיקים של 5 מיקרומטר) עם שיפוע B של 10 דקות 30-40% B (A, מים עם 0.05% חומצה טריפלואורואצטית (TFA); B, אצטוניטריל עם 0.05% TFA) וקצב זרימה של 14 מ"ל לדקה. המוצר הרצוי נפלט מיד לאחר אינסולין ללא שינוי.
    1. אידוי אצטוניטריל ו-TFA על ידי זרם גז חנקן או אידוי סיבובי בלחץ מופחת (650 פסקל) וסיבוב ב-150 סל"ד. הקפיאו את התמיסה המימית והליופיליזציה ליובש. אחסן אינסולין פונקציונלי בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס באווירה יבשה.
      הערה: האינסולין הפונקציונלי יציב עד שנה בתנאי אחסון אלה.
  3. לסנתז את מערך האנטיגן על ידי ציקלוספציה של אזיד-אלקין (CuAAC) (2.5 שעות)22. הוסף 6 שווה ערך אינסולין-אלקין (38 מ"ג, 6.3 מיקרומול) לבקבוקון זכוכית של 10 מ"ל עם מוט ערבוב והמיס ב-DMSO (1.2 מ"ל) בחימום עדין.
    1. הוסף 50 מ"מ נתרן פוספט בופר (1.8 מ"ל) pH 7.4, 1 שווה ערך ל-20 kDa אזיד PEG 4 זרועות (21 מ"ג, 1.05 מיקרומול), נחושת (II) סולפט פנטהידרט (3.15 מ"ג, 12.6 מיקרומול), טריס (3-הידרוקסיפרופילטריאזולילמתיל)אמין (27.37 מ"ג, 63 מיקרומול) ונתרן אסקורבט (50.34 מ"ג, 254 מיקרומול).
    2. מערבבים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר ואז מוסיפים DMSO (3 מ"ל) כדי להמיס משקעים ולהחמיץ את התמיסה עם 0.05% HCl (4 מ"ל).
  4. טהר את מערך האנטיגן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך (3 שעות). השתמש בעמודת C18 מכינה (19 מ"מ x 250 מ"מ, גודל נקבוביות 300 A, גודל חלקיקים של 5 מיקרומטר) עם שיפוע של 10 דקות 20-60% B (A, מים עם 0.05% TFA; B, אצטוניטריל עם 0.05% TFA) וקצב זרימה של 14 מ"ל לדקה. המוצר הרצוי נפלט מיד לאחר אינסולין-אלקין.
    1. אידוי אצטוניטריל על ידי זרם גז חנקן או אידוי סיבובי בלחץ מופחת. הקפיאו את התמיסה המימית והליופיליזציה ליובש. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס באווירה יבשה.
      הערה: מערך האנטיגן של האינסולין הוא היגרוסקופי מאוד. הסיבים הליופיליים עשויים להתלכד לכדור צפוף לאחר חשיפה חוזרת ונשנית לאטמוספירה. מאפייני FAA עשויים להשתנות בהתאם לאנטיגן הספציפי ליישום בו נעשה שימוש. מערך האנטיגן של האינסולין יציב למשך מספר חודשים בתנאי אחסון אלה.

2. צימוד פלואורופור (1-2 ימים)

  1. להצמיד את הפלואורופור למערך האנטיגן (2.5 שעות). הוסף אינסולין ארבע-ערכי שווה ערך (21.7 מ"ג, 0.5 מיקרומול) לבקבוקון זכוכית של 20 מ"ל עם מוט ערבוב והמיס ב-DMSO (1.75 מ"ל) בחימום עדין. הוסף חיץ קרבונט 100 מ"מ (8 מ"ל) pH 9.0 ו-5 שווה ערך של פלואורסצאין איזותיוציאנט בתמיסת מלאי טרייה של 10 מ"מ ב-DMSO (0.25 מ"ל, 0.97 מ"ג, 2.5 מיקרומול). מערבבים שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר.
  2. טהר את המוצר באמצעות דיאליזה (24 שעות). השתמש בצינורות דיאליזה במשקל מולקולרי של 3.5 kDa בדלי מעורבב של 5 ליטר עם מים מזוקקים בחושך בטמפרטורת החדר. יש לבצע דיאליזה במשך 24 שעות ולהחליף את תמיסת הדיאליזה כל 6-12 שעות.
  3. הקפיאו את התמיסה שעברה דיאליזה והליופיליזציה ליובש כדי להניב את ה-FAA. יש לאחסן בחושך באווירה יבשה בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
    הערה: ה-FAA יציב במשך מספר חודשים בתנאי אחסון אלה.

3. אפיון FAA (2-4 שעות)

  1. נתח את התוצרים של שלבים 1 ו -2 על ידי אלקטרופורזה של ג'ל נתרן דודציל סולפט-פוליאקרילאמיד על פי Laemmli25 (2 שעות). הכן דגימות המכילות 5 מיקרוגרם של אנטיגן חד ערכי מטוהר, אזיד PEG 20 kDa 4 זרועות, מערך אנטיגן ו-FAA.
    1. דמיין תיוג פלואורופור בדגימות FAA על ידי הדמיה פלואורסצנטית בהדמיית ג'ל.
    2. בצע צביעה כחולה של Coomassie26 כדי לדמיין את האנטיגן.
    3. בצע צביעת יוד27 כדי להמחיש את עמוד השדרה של PEG. שטפו את הג'ל במים מזוקקים (3 x 2 דקות), דגרו בתמיסת בריום כלוריד 5% (20 מ"ל) למשך 10 דקות, שטפו במים מזוקקים (3 x 2 דקות), דגרו בתמיסת יוד 0.1 N (20 מ"ל) למשך דקה אחת, ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים (3 x 2 דקות) כדי להסיר כתמי רקע לפני ההדמיה.
      הערה: להכנת תמיסת יוד של 0.1 N, הוסף אשלגן יודיד (2.0 גרם, 12 מילימול) ויוד (1.27 גרם, 5 מילימול) ל-100 מ"ל מים מזוקקים.
  2. חשב את מידת תיוג הצבע על ידי ספקטרוסקופיה UV-Vis (1 שעה). ממיסים כמות קטנה של FAA ב-0.1 מ"ג/מ"ל ורשמו את הספיגה ב-280 ננומטר ואת אורך גל הספיגה השיא של הצבע. השג את מקדמי ההכחדה המולרית עבור האנטיגן והצבע.
    הערה: חלק מהצבעים רגישים ל-pH. הקפד להשתמש בתמיסה עם חוצץ מתאים כמו מאגר קרבונט של 100 מ"מ עם pH 8.3 בעת מדידת ספיגת ה-FAA כדי להבטיח שמקדם הכחדת הצבע המדווח מדויק.
    1. בצע את החישוב הבא28 כאשרA Dye, maxλ הוא ספיגת ה-FAA באורך גל שיא הספיגה עבור הצבע, EDye, maxλ הוא מקדם ההכחדה המולרית באורך גל הספיגה השיא של הצבע,ואנטיגן E, 280 ננומטר הוא מקדם ההכחדה המולרית עבור אנטיגן חד-ערכי ב-280 ננומטר:
      גורם תיקון (CF) =צבע, 280 ננומטר /צבע A, מקסימום 0.25 * (צבע A, צבע מקסימום / צבע E, מקסימום) * (אנטיגן E, 280 ננומטר / (A280 ננומטר – (צבע A, מקסימום λ * CF))) = צבע/FAA
  3. נתח את ה-FAA עבור צבע חופשי או מוצרי פירוק פוטנציאליים על ידי RP-HPLC (שעה אחת).
    1. ממיסים כמות קטנה של FAA ב-1.0 מ"ג/מ"ל ומבצעים ניתוח עם עמודת C18 אנליטית (4.6 מ"מ x 150 מ"מ, גודל נקבוביות 300 A, גודל חלקיקים של 2.5 מיקרומטר) באמצעות שיפוע B של 10 דקות 5-95% B (A, מים עם 0.05% חומצה טריפלואורואצטית: B, אצטוניטריל עם 0.05% חומצה טריפלואורואצטית) עם קצב זרימה של 1 מ"ל לדקה. הגדר את גלאי ה-UV-Vis לניטור אורך גל שיא הספיגה של הצבע (437 ננומטר עבור FITC).
      הערה: עבור צבעים רגישים ל-pH, ניתוח HPLC בממיסים מחומצים עשוי לדרוש הסטת אורך הגל המנוטר מאורך גל שיא הספיגה של הצבע בתנאים מימיים ניטרליים. ב-0.05% TFA, ה-pH הוא כ-3 והספיגה המקסימלית עבור FITC השתנתה.

4. פיתוח בדיקה על ידי טיטרציה של FAA (3-5 שעות)

הערה: מוצג שימוש ב-FAA עבור זרימה ציטומטרית, אך ניתן לשנות את אותם שלבים לשימוש בפורמטים אחרים כגון אימונוהיסטוכימיה או מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. בעת החלת FAA עבור פורמט חדש, יש להשלים בדיקת אופטימיזציה חדשה. ניתן להשיג אוכלוסיות תאים מעורבות או מבודדות באמצעות שיטות עיבוד דם או איברי לימפה23,29. קציר באמצעות עיכול אנזימטי של רקמות אינו מומלץ, מכיוון שסמני פני התאים עלולים להישפך.

  1. השעו את מלאי ה-FAA ל-1 מ"ג/מ"ל במאגר FACS (1x PBS + 5% סרום בקר עוברי ו-0.1% נתרן אזיד). ניתן לשלב עד 10% DMSO כדי להאיץ את הפירוק.
  2. השג תאים חיוביים לתאי B ספציפיים לאנטיגן מעניינים והוציאו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה. יידרשו כ -1 x 107 תאים בסך הכל.
    הערה: הטחול נקטף מעכברי VH125 ו-EAE על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC באוניברסיטת קנזס להדגמה הנוכחית. חוקרים עשויים להשתמש בשיטות המתוארות כאן עבור דגימות תאים ספציפיות ליישום שלהם ולהכנת FAA.
    1. הוצא 5 x 105 תאים לשכפולי תיוג טיטרציה (לפחות 3 שכפולים לכל טיטרציה).
    2. הוצא 1 x 105 תאים לבקרות של כתמים בודדים כמו גם בקרה לא מוכתמת.
      הערה: ניתן להשתמש גם באיזוטיפים של נוגדנים ובפלואורסצנטיות מינוס בקרה אחת כדי לאמת את הבדיקה במלואה.
  3. שטפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור. צנטריפוגה ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
  4. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדורי התא ב-50 מיקרוליטר של מאגר FACS.
  5. הוסף נוגדנים פלואורסצנטיים CD3 ו-CD19 לכל דגימה בריכוזים המומלצים על ידי היצרן, כמו גם מינוני FAA מדורגים.
    הערה: ניתן לטטר את ריכוזי הנוגדנים הפלואורסצנטיים הפועלים באופן עצמאי כדי לאשר את תקינות האצווה. טווחי המינון המתאימים של FAA ישתנו בהתאם ליישום, אך נקודת התחלה טובה היא 50, 25, 10, 5 ו-1 מיקרוגרם לדגימה. 1 מיקרוליטר של תמיסת FAA במלאי שווה ל-1 מיקרוגרם של מינון.
  6. מערבבים היטב כל דגימה ודוגרים מכוסה מאור, על קרח למשך 30 דקות.
  7. לאחר הדגירה, שטפו תאים על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור. צנטריפוגה את הדגימות ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
  8. שאפו את הסופרנטנט וחזרו על הכביסה על ידי הוספת 1 מ"ל של מאגר FACS לכל צינור. צנטריפוגה את הדגימות ב 200 x גרם למשך 5 דקות.
  9. שאפו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הדגימות ב-200 מיקרוליטר של מאגר FACS טרי. הניחו את הדגימות על קרח ופנו אל הציטומטר.
  10. הפעל את הדגימות על הציטומטר ואסוף לפחות 50,000 אירועים.

5. ניתוח טיטרציה של FAA ואופטימיזציה של מינון תיוג (1-2 שעות)

  1. שימוש בתוכנת ניתוח זרימה ציטומטרית, שער לתאים בודדים.
  2. בתאים בודדים, מקם שערים עבור CD19+ (תאי B) ו- CD3+ (תאי T).
  3. בתוך אוכלוסיות ההורים CD19+ ו-CD3+, שער לאירועי FAA+ בערוץ הפלואורוכרום הרלוונטי.
  4. רשום את אחוז אירועי FAA+ בתוך אוכלוסיות ההורים CD19+ ו-CD3+.
  5. חשב יחס ספציפיות על ידי חלוקת שיעור אירועי FAA+ באוכלוסיית CD19+ (ספציפי) בשיעור אירועי FAA+ באוכלוסיית CD3+ (לא ספציפי). יש למקסם את יחס הספציפיות לשימוש מוצלח ב-FAA.
  6. השתמש במינון התיוג המתאים ליחס הספציפיות הגבוה ביותר עבור ניסויים עתידיים.

תוצאות

התפוקה המטוהרת של אינסולין-אלקין (איור 2, פאנל עליון), שנקבעה על פי משקל, נעה בדרך כלל בין 50 ל-65%. יבולים של פחות מ-40% נגרמו ככל הנראה על ידי זיהום מים ב-DMSO נטול מים ו/או הידרוליזה של הפרופרגיל NHS-ester. עבור ריבוי אנטיגנים (איור 1B), התפוקה המטוהרת ש?...

Discussion

פיתחנו פרוטוקול (איור 1) לבניית FAAs מותאמים אישית לזיהוי תאי B ספציפיים לאנטיגן, מה שמפשט את היצירה של בדיקות תאי B עבור מטרות אנטיגן קשות. בחרנו פולימרי PEG בעלי 4 זרועות עם קבוצות אזיד סופיות כמצע קל לבניית FAAs, מכיוון ש-PEG מעניק מסיסות במים בעוד ידיות האזיד הפ?...

Disclosures

CJB הוא מייסד שותף של Orion Bioscience, Inc., חברה המעניקה רישיון לטכנולוגיית SAgA לחקירת השימושים הטיפוליים שלה. דוח זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי תוכנית המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע במסגרת מענק מס' 1946099. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את העמדות של הקרן הלאומית למדע.

Acknowledgements

אנו מודים לקולט וורצ'סטר על עזרתה באיסוף הנתונים. עבודה זו נתמכה על ידי קרן PhRMA (JDG), תוכנית מלגות המחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע (KDA), ועל ידי מענקי NIH R21AI143407, R21AI144408 ו-DP5OD023118.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,1,3,3-tetramethylguanidineAlfa AesarAAA12314AC
12 M hydrochloric acidFisher ChemicalA508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ulBio-Rad4561043
20 kDa 4-arm PEG azideJenkem USAA7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)Fisher Scientific25-152-10
Acetonitrile, HPLC gradeFisher ChemicalA998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 AntibodyBioLegend115522
anhydrous dimethylsulfoxideACROS OrganicsAC610420010
barium chlorideACROS Organics203135000
Brilliant Blue G-250 DyeFisher BioReagentsBP100-50
Cell Prime r-insulinEMD Millipore4512-01Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrateACROS OrganicsAC197722500
dimethylsulfoxideFisher ChemicalS67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1Sigma-AldrichF7250-1G
Glacial acetic acidFisher ChemicalA38-212
GlycerolACROS Organics15892-0010
GlycineFisher ChemicalG46-500
homopropargyl-PLPBiomatikNACustom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodineSigma-Aldrich207772-100G
Methanol, HPLC gradeFisher ChemicalA452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomerThermo Scientific46406A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 AntibodyBioLegend100220
potassium iodideSigma-Aldrich30315
propargyl N-hydroxysuccinimide esterSigma-Aldrich764221
sodium ascorbateSigma-AldrichA7631
sodium biocarbonateSigma-AldrichS5761-1KG
sodium dodecyl sulfateFisher BioReagentsBP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrateFisher ChemicalS468-500
trifluoroacetic acidSigma-Aldrich302031-10x1mL
Tris baseFisher BioReagentsBP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amineClickChemTools1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm columnWaters186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mmWaters186004021

References

  1. Murphy, K., Weaver, C. . Janeway's Immunobiology. , (2016).
  2. Sospedra, M., Martin, R. Immunology of Multiple Sclerosis. Seminars in Neurology, Thieme Medical Publishers. , 115-127 (2016).
  3. Knutson, K. L., Disis, M. Tumor antigen-specific T helper cells in cancer immunity and immunotherapy. Cancer Immunology, Immunotherapy. 54 (8), 721-728 (2005).
  4. Rivino, L., et al. Hepatitis B virus-specific T cells associate with viral control upon nucleos (t) ide-analogue therapy discontinuation. The Journal of Clinical Investigation. 128 (2), 668-681 (2018).
  5. Constantin, C. M., Bonney, E. E., Altman, J. D., Strickland, O. L. Major histocompatibility complex (MHC) tetramer technology: an evaluation. Biological Research For Nursing. 4 (2), 115-127 (2002).
  6. Griffin, J. D., Song, J. Y., Sestak, J. O., DeKosky, B. J., Berkland, C. J. Linking autoantigen properties to mechanisms of immunity. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2020).
  7. Moody, M. A., Haynes, B. F. Antigen-specific B cell detection reagents: use and quality control. Cytometry A. 73 (11), 1086-1092 (2008).
  8. Boonyaratanakornkit, J., Taylor, J. J. Techniques to study antigen-specific B cell responses. Frontiers in Immunology. 10 (1694), (2019).
  9. Newman, J., Rice, J. S., Wang, C., Harris, S. L., Diamond, B. Identification of an antigen-specific B cell population. Journal of Immunological Methods. 272 (1), 177-187 (2003).
  10. Smith, M. J., et al. Silencing of high-affinity insulin-reactive B lymphocytes by anergy and impact of the NOD genetic background in mice. Diabetologia. 61 (12), 2621-2632 (2018).
  11. Griffin, J. D., et al. Acute B-cell inhibition by soluble antigen arrays is valency-dependent and predicts immunomodulation in splenocytes. Biomacromolecules. 20 (5), 2115-2122 (2019).
  12. Hartwell, B. L., et al. Antigen-specific binding of multivalent soluble antigen arrays induces receptor clustering and impedes B cell receptor mediated signaling. Biomacromolecules. 17 (3), 710-722 (2016).
  13. Hartwell, B. L., Pickens, C. J., Leon, M., Berkland, C. Multivalent soluble antigen arrays exhibit high avidity binding and modulation of B cell receptor-mediated signaling to drive efficacy against experimental autoimmune encephalomyelitis. Biomacromolecules. 18 (6), 1893-1907 (2017).
  14. Hartwell, B. L., et al. Soluble antigen arrays disarm antigen-specific B cells to promote lasting immune tolerance in experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Autoimmunity. 93, 76-88 (2018).
  15. Hartwell, B. L., et al. Molecular dynamics of multivalent soluble antigen arrays support a two-signal co-delivery mechanism in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 13 (2), 330-343 (2016).
  16. Kuehl, C., et al. Pulmonary administration of soluble antigen arrays is superior to antigen in treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (11), 3293-3302 (2017).
  17. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays displaying mimotopes direct the response of diabetogenic T Cells. ACS Chemical Biology. 14 (7), 1436-1448 (2019).
  18. Leon, M. A., et al. Soluble antigen arrays for selective desensitization of Insulin-Reactive B cells. Molecular Pharmaceutics. 16 (4), 1563-1572 (2019).
  19. Sestak, J. O., Fakhari, A., Badawi, A. H., Siahaan, T. J., Berkland, C. Structure, size, and solubility of antigen arrays determines efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. The AAPS Journal. 16 (6), 1185-1193 (2014).
  20. Sestak, J. O., et al. Codelivery of antigen and an immune cell adhesion inhibitor is necessary for efficacy of soluble antigen arrays in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. 1, 14008 (2014).
  21. Thati, S., et al. Routes of administration and dose optimization of soluble antigen arrays in mice with experimental autoimmune encephalomyelitis. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 714-721 (2015).
  22. Johnson, S. N., et al. Multimeric insulin desensitizes insulin-specific B cells. ACS Applied Bio Materials. , (2020).
  23. Griffin, J. D., et al. Antigen-specific immune decoys intercept and exhaust autoimmunity to prevent disease. Biomaterials. 222, 119440 (2019).
  24. Hartwell, B. L., et al. Multivalent nanomaterials: learning from vaccines and progressing to antigen-specific immunotherapies. Journal of Pharmaceutical Sciences. 104 (2), 346-361 (2015).
  25. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  26. Simpson, R. J. Staining proteins in gels with coomassie blue. CSH Protocols. 2007, 4719 (2007).
  27. Moosmann, A., Müller, E., Böttinger, H. Purification of PEGylated proteins, with the example of PEGylated lysozyme and PEGylated scFv. Methods Molecular Biology. 1129, 527-538 (2014).
  28. Haugland, R. P., Davis, W. C. Coupling of monoclonal antibodies with fluorophores. Monoclonal Antibody Protocols. , 205-221 (1995).
  29. Martin, T. J., Whalen, M. M. Exposures to the environmental toxicants pentachlorophenol (PCP) and dichlorodiphenyltrichloroethane (DDT) modify secretion of interleukin 1-beta (IL-1β) from human immune cells. Archives of Toxicology. 91 (4), 1795-1808 (2017).
  30. Felton, J. L., Maseda, D., Bonami, R. H., Hulbert, C., Thomas, J. W. Anti-insulin B cells are poised for antigen presentation in type 1 diabetes. The Journal of Immunology. 201 (3), 861-873 (2018).
  31. Griffin, J. D., et al. Tocopherol emulsions as functional autoantigen delivery vehicles evoke therapeutic efficacy in experimental autoimmune encephalomyelitis. Molecular Pharmaceutics. 16 (2), 607-617 (2019).
  32. Yarkoni, Y., Getahun, A., Cambier, J. C. Molecular underpinning of B-cell anergy. Immunology Reviews. 237 (1), 249-263 (2010).
  33. Pickens, C. J., Johnson, S. N., Pressnall, M. M., Leon, M. A., Berkland, C. J. Practical considerations, challenges, and limitations of bioconjugation via azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 29 (3), 686-701 (2017).
  34. Song, J. Y., et al. Glatiramer acetate persists at the injection site and draining lymph nodes via electrostatically-induced aggregation. Journal of Controlled Release. 293, 36-47 (2019).
  35. van Dongen, M. A., et al. Avidity mechanism of dendrimer-folic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 11 (5), 1696-1706 (2014).
  36. Hudson, P. J., Kortt, A. A. High avidity scFv multimers; diabodies and triabodies. Journal of Immunological Methods. 231 (1), 177-189 (1999).
  37. Baker, J. C., et al. Selective acylation of epsilon-amino groups. Google Patents. , (2003).
  38. Grimsley, G. R., Scholtz, J. M., Pace, C. N. A summary of the measured pK values of the ionizable groups in folded proteins. Protein Science. 18 (1), 247-251 (2009).
  39. Fesel, C., Coutinho, A. Serum IgM repertoire reactions to MBP/CFA immunization reflect the individual status of EAE susceptibility. Journal of Autoimmunity. 14 (4), 319-324 (2000).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

BPEG1Bex vivo

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved