用于抗原特异性 B 细胞单步鉴定的 Tetrameric 荧光抗原阵列

摘要

该方案详细介绍了用于标记抗原特异性 B 细胞的荧光探针的可定制生产和使用。

摘要

荧光抗原产生是鉴定抗原特异性 B 细胞的关键步骤。在这里，我们详细介绍了四臂荧光 PEG-抗原偶联物的制备、纯化和使用，通过与同源 B 细胞受体的热烈结合来选择性地鉴定抗原特异性 B 细胞。使用模块化点击化学和市售荧光团试剂盒化学成分，我们通过为蛋白脂蛋白 （PLP_139-151） 和胰岛素创建不同的阵列来展示制备定制荧光 PEG 偶联物的多功能性，这分别是多发性硬化症和 1 型糖尿病小鼠模型中的重要自身抗原。使用流式细胞术为其各自疾病模型中的每种荧光偶联物开发检测方法。将抗原阵列与单价自身抗原进行比较，以量化 PEG 骨架上多聚化的益处。最后，我们通过分离和评估离体抗原刺激后的抗胰岛素 B 细胞反应来说明该平台的效用。标记胰岛素特异性 B 细胞能够扩增检测共刺激 （CD86） 的变化，否则这些变化在聚集体 B 细胞分析中会被抑制。总之，本报告使荧光抗原阵列的生产和使用成为可能，作为探测 B 细胞群的可靠工具。

引言

适应性免疫系统在许多疾病状态的进展或消退中起着关键作用，包括自身免疫、癌症和传染病¹。对于包括免疫病理学研究或新的精准治疗方法开发在内的广泛应用，评估疾病进展背后的抗原特异性 B 细胞和 T 细胞反应通常至关重要 ^2,3,4。主要组织相容性复合体 （MHC） 四聚体广泛上市，可用于鉴定抗原特异性 T 细胞克隆⁵。这些荧光团标记的构建体呈递四价肽-MHC 复合物，可积极与同源 T 细胞受体结合，用于显微镜检查和流式细胞术等标记应用。

用于 B 细胞检测的抗原可以呈现高度不同的分子量、电荷和溶解度 ^6,7。当使用单体抗原作为可溶性 B 细胞探针时，理化抗原特性可能无法通过与大得多的水溶性链霉亲和素分子复合来稳定，或者可能在偶联前作为单体试剂出现溶解度问题。因此，一些蛋白质在实践中存在生物偶联困难和意想不到的结果 ^7,8。直接荧光染料偶联有时会使构建体不溶于水且具有亲脂性。这些直接染料-抗原化合物易受非特异性包埋在细胞膜内的影响，混淆了抗原特异性分析 ^7,8,9。一些策略通过将抗原和荧光基团与其他官能团偶联来克服溶解度挑战。例如，Cambier 等人使用天然形式的生物素化胰岛素与胰岛素特异性 B 细胞受体 （BCR） 结合，然后逐步添加荧光团标记的链霉亲和素¹⁰。虽然这种方法能够以高分辨率评估与单体胰岛素结合的 B 细胞，但需要两个标记步骤。用于制备即用型聚合物基 B 细胞探针的通用方案，易于与常见的荧光抗体标记程序相结合，将有助于进一步研究疾病中的 B 细胞。

在该协议中，我们详细介绍了荧光抗原阵列 （FAA） 的生产和使用，用于抗原特异性 B 细胞的通用和单步标记，用于显微镜和流式细胞术实验（图 1）。可溶性抗原阵列 （SAgA） 在过去十年中被用作针对自身免疫性疾病的 B 细胞靶向抗原特异性免疫疗法 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22.SAgA 利用柔性聚合物骨架上的多价抗原展示来积极结合 B 细胞受体并引发免疫调节作用，尽管当与荧光基团偶联时，它们的抗原特异性为探测目标 B 细胞提供了另一个机会²³。构成 SAgAs 的聚合物骨架赋予整个生物大分子水溶性，并且可以抑制有时混淆探针生成和染色特异性的极端抗原特性 ^6,24。我们使用模块化点击化学将许多大小和复杂性不同的抗原接枝到 SAgA 平台上，这有利于使用小肽表位和全蛋白^14,18。在这里，我们展示了 FAA 作为强大的抗原特异性 B 细胞标记工具，可以与典型的荧光抗体标记并行使用。我们准备并评估了由人胰岛素组成的 FAA，用于在 1 型糖尿病 （VH125） 的转基因小鼠模型中标记 B 细胞，以及掺入蛋白脂蛋白 139-151 （PLP） 的 FAA，PLP 是实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 的肽表位，多发性硬化症小鼠模型。我们采用这些疾病模型的目的是展示该平台的多功能性，无论是用于所用抗原的模块化替换，还是与肽表位 （PLP） 和全蛋白（胰岛素）一起使用的可行性。该方案的提出目的是可及性，无需广泛的生物偶联专业知识。这些试剂以及合成和纯化方法旨在实现多功能性，并且易于在大多数专注于化学、分子生物学或免疫学的研究实验室中实施。

研究方案

这项工作中介绍的所有动物程序均已获得堪萨斯大学机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 抗原阵列合成（4-6 天）

1. 用炔烃手柄 （1 h） 使未修饰的抗原功能化。将 1 当量胰岛素（100 mg，17.4 μmol）加入到带有搅拌棒的 20 mL 玻璃样品瓶中，溶于无水二甲基亚砜 （DMSO） （2 mL） 中，并使用热风枪或水浴轻轻加热至 40–50 °C。
   1. 在无水 DMSO（0.3 mL，5.3 mg，23.6 μmol）中加入 1,1,3,3-四甲基胍（40.2 mg，348.8 μmol）和 1.35 当量新鲜制备的 78.5 mM 炔丙基 N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS 酯）储备液。
   2. 在室温下搅拌 30 分钟，然后用 0.05% HCl （12 mL） 淬灭反应。
2. 通过反相液相色谱法（4 小时）纯化单一修饰的胰岛素 - 炔烃。使用制备型 C18 色谱柱（19 mm x 250 mm，孔径 300 A，粒径 5 μm），梯度为 10 分钟 30–40%（A，含 0.05% 三氟乙酸 （TFA） 的水;B，含 0.05% TFA 的乙腈）且流速为 14 mL/min。所需的产物在未改性的胰岛素后立即洗脱。
   1. 在减压 （650 Pascals） 下以 150 rpm 转速旋转，通过氮气流或旋转蒸发乙腈和 TFA。冷冻水溶液并冻干至干燥。将功能化胰岛素储存在 -20 °C 的干燥气氛中。
      注意：在这些储存条件下，功能化胰岛素可稳定长达一年。
3. 通过铜催化的叠氮化物-炔烃环加成反应 （CuAAC） 合成抗原阵列 （2.5 h）²²。将 6 当量的炔烃胰岛素（38 mg，6.3 μmol）加入到带有搅拌棒的 10 mL 玻璃样品瓶中，轻轻加热溶解在 DMSO （1.2 mL） 中。
   1. 加入 50 mM 磷酸钠缓冲液 （1.8 mL），pH 7.4,1 个当量 20 kDa 4 臂 PEG 叠氮化物（21 mg，1.05 μmol），硫酸铜 （II） 五水合物（3.15 mg，12.6 μmol），三（3-羟丙基三唑基甲基）胺（27.37 mg，63 μmol）和抗坏血酸钠（50.34 mg，254 μmol）。
   2. 在室温下搅拌 2 小时，然后加入 DMSO （3 mL） 以溶解任何沉淀物，并用 0.05% HCl （4 mL） 酸化溶液。
4. 通过反相液相色谱法（3 小时）纯化抗原阵列。使用制备型 C18 色谱柱（19 mm x 250 mm，孔径 300 A，粒径 5 μm），梯度为 10 min，B从 20%增加到 60%（A，含 0.05% TFA 的水;B，含 0.05% TFA 的乙腈）和 14 ml/min 的流速。所需产物在炔烃胰岛素后立即洗脱。
   1. 通过氮气流或减压旋转蒸发蒸发乙腈。冷冻水溶液并冻干至干燥。在 -20 °C 干燥气氛下储存。
      注：胰岛素抗原阵列具有高度吸湿性。冻干纤维在反复暴露在大气中后可能会聚结成致密的颗粒。FAA 特性可能因所使用的应用特异性抗原而异。在这些储存条件下，胰岛素抗原阵列可稳定数月。

2. 荧光基团偶联（1-2 天）

1. 将荧光团与抗原阵列偶联（2.5 小时）。将 1 个等效的四价胰岛素（21.7 mg，0.5 μmol）加入到带搅拌棒的 20 mL 玻璃瓶中，轻轻加热溶解在 DMSO （1.75 mL） 中。在新鲜制备的 10 mM DMSO 储备液（0.25 ml、0.97 mg、2.5 μmol）中加入新鲜制备的 100 mM 碳酸盐缓冲液 （8 mL） 和 5 当量的异硫氰酸荧光素。在室温下避光搅拌 2 小时。
2. 通过透析（24 小时）纯化产品。在搅拌的 5 L 桶中使用 3.5 kDa 截留分子量的截止透析管，并在室温下避光加入蒸馏水。透析 24 小时，每 6-12 小时更换一次透析液。
3. 冷冻透析溶液并冻干至干燥，得到 FAA。在 -20 °C 的干燥气氛下避光储存。
   注意：FAA 在这些储存条件下可稳定数月。

3. FAA 表征 （2–4 h）

1. 根据 Laemmli²⁵ （2 h） 通过十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析步骤 1 和 2 的产物。制备含有 5 μg 纯化的一价抗原、20 kDa 4 臂 PEG 叠氮化物、抗原阵列和 FAA 的样品。
   1. 通过在凝胶成像仪中进行荧光成像，可视化 FAA 样品中的荧光团标记。
   2. 进行考马斯蓝染色²⁶ 以可视化抗原。
   3. 进行碘染色²⁷ 以可视化 PEG 骨架。用蒸馏水冲洗凝胶（3 x 2 分钟），在 5% 氯化钡溶液 （20 mL） 中孵育 10 分钟，用蒸馏水冲洗（3 x 2 分钟），在 0.1 N 碘溶液 （20 mL） 中孵育 1 分钟，然后用蒸馏水冲洗（3 x 2 分钟）以去除背景染色，然后观察前。
      注：要制备 0.1 N 碘溶液，请将碘化钾（2.0 g，12 mmol）和碘（1.27 g，5 mmol）添加到 100 mL 蒸馏水中。
2. 通过紫外-可见光谱法（1 小时）计算染料标记的程度。以 0.1 mg/mL 的浓度溶解少量 FAA，并记录染料在 280 nm 处的吸光度和峰值吸收波长。获得抗原和染料的摩尔消光系数。
   注：某些染料对 pH 值敏感。在测量 FAA 吸光度时，请确保使用适当的缓冲溶液，如 pH 值为 8.3 的 100 mM 碳酸盐缓冲液，以确保报告的染料消光系数准确。
   1. 执行以下计算²⁸ ，其中 A_{染料，maxλ} 是染料在峰值吸收波长处的 FAA 吸光度，E_{染料，maxλ} 是染料在峰值吸收波长处的摩尔消光系数，E_{抗原，280 nm} 是单价抗原在 280 nm 处的摩尔消光系数。
      校正因子 （CF） = A_{染料，280 nm} / A_{染料，最大λ} 0.25 *（A_{染料，最大λ} / E_{染料，最大λ}）*（E_{抗原，280 nm} / （A_{280 nm} – （A_{染料，最大λ} * CF））） = 染料/FAA
3. 通过 RP-HPLC （1 h） 分析 FAA 中的游离染料或潜在降解产物。
   1. 以 1.0 mg/mL 的浓度溶解少量 FAA，并使用分析型 C18 色谱柱（4.6 mm x 150 mm，孔径为 300 A，粒径为 2.5 μm），以 10 min 的 5–95% B 梯度（A，含 0.05% 三氟乙酸的水：B，含 0.05% 三氟乙酸的乙腈）以 1 mL/min 的流速进行分析。设置 UV-Vis 检测器以监测染料的峰值吸光度波长（FITC 为 437 nm）。
      注：对于 pH 敏感染料，在酸化溶剂中进行 HPLC 分析可能需要在中性水性条件下将监测波长从染料的峰值吸收波长上移。在 0.05% TFA 中，pH 值约为 3，FITC 的最大吸收量已发生变化。

4. 通过 FAA 滴定 （3–5 h） 进行分析开发

注意：介绍了 FAA 用于流式细胞术，但可以修改相同的步骤以用于其他形式，例如免疫组织化学或荧光显微镜。当对新规格应用 FAA 时，必须完成新的优化分析。混合或分离的细胞群可通过血液或淋巴器官加工方法获得^23,29。不建议通过酶消化组织进行收获，因为细胞表面标志物可能会脱落。

1. 在 FACS 缓冲液（1x PBS + 5% 胎牛血清和 0.1% 叠氮化钠）中将 FAA 原液悬浮至 1 mg/mL。可掺入高达 10% 的 DMSO 以加速溶解。
2. 获得目标抗原特异性 B 细胞阳性的细胞，并分配到微量离心管中。大约需要 1 x 10⁷ 个总细胞。
   注意：根据堪萨斯大学 IACUC 批准的方案从 VH125 和 EAE 小鼠中收获脾细胞，用于本演示。研究人员可以采用本文描述的方法来处理特定于他们自己的应用和 FAA 制备的细胞样品。
   1. 分配 5 x 10⁵ 个细胞用于滴定标记重复（每次滴定至少 3 个重复）。
   2. 分液 1 x 10⁵ 个细胞，用于单染色对照以及未染色对照。
      注：抗体同种型和荧光减去一个对照也可用于完全验证测定。
3. 通过向每个试管中加入 1 mL FACS 缓冲液来洗涤细胞。以 200 x g 离心 5 分钟。
4. 吸出上清液并将细胞沉淀重悬于 50 μL FACS 缓冲液中。
5. 以制造商推荐的浓度向每个样品中添加 CD3 和 CD19 荧光抗体，并滴定 FAA 剂量。
   注：荧光抗体工作浓度可以独立滴定以确认批次完整性。适当的 FAA 剂量范围因应用而异，但一个好的起点是每个样品 50、25、10、5 和 1 μg。1 μL FAA 原液等于 1 μg 剂量。
6. 将每个样品充分混合，并在加光下在冰上孵育 30 分钟。
7. 孵育后，向每个试管中加入 1 mL FACS 缓冲液来洗涤细胞。将样品以 200 x g 离心 5 分钟。
8. 吸出上清液，并向每个试管中加入 1 mL FACS 缓冲液，重复洗涤。将样品以 200 x g 离心 5 分钟。
9. 吸出上清液并将样品重悬于 200 μL 新鲜 FACS 缓冲液中。将样品放在冰上并前往细胞仪。
10. 在细胞仪上运行样品并收集至少 50,000 个事件。

5. FAA 滴定分析和标记剂量优化 （1-2 h）

1. 使用流式细胞术分析软件，为单细胞设门。
2. 在单个细胞上，放置 CD19 + （B 细胞） 和 CD3 + （T 细胞） 的门。
3. 在 CD19 + 和 CD3 + 亲本群体中，相关荧光染料通道中 FAA + 事件的门控。
4. 记录 CD19 + 和 CD3 + 亲本群体中 FAA + 事件的百分比。
5. 通过将 CD19 + 群体中 FAA + 事件的比例（特异性）除以 CD3 + 群体中 FAA + 事件的比例（非特异性）来计算特异性比。为了成功使用 FAA，应最大限度地提高特异性比。
6. 在将来的实验中使用对应于最高特异性比的标记剂量。

结果

炔烃胰岛素的纯化产量（图 2，上图）由重量决定，通常在 50-65% 之间变化。产率低于 40% 可能是由无水 DMSO 中的水污染和/或炔丙基 NHS 酯的水解引起的。对于抗原多聚化（图 1B），胰岛素抗原阵列的纯化产量（图 2，中间面板）在 60-75% 之间变化，SDS-PAGE 分析证实主要产物是四价物质（图 3...

讨论

我们开发了一种方案（图 1）来构建用于识别抗原特异性 B 细胞的定制 FAA，从而简化了针对困难抗原靶标的 B 细胞探针的生成。我们选择了具有末端叠氮化物基团的 4 臂 PEG 聚合物作为构建 FAA 的简单底物，因为 PEG 赋予水溶性，而功能性叠氮化物手柄可实现简单的点击共轭反应³³。确定数量的功能手柄（4 个臂）有利于简化化学抗?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1,3,3-tetramethylguanidine	Alfa Aesar	AAA12314AC
12 M hydrochloric acid	Fisher Chemical	A508-4
12% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 30 ul	Bio-Rad	4561043
20 kDa 4-arm PEG azide	Jenkem USA	A7185-1
3.5 kDa MWCO dialysis tubing (regenerated cellulose)	Fisher Scientific	25-152-10
Acetonitrile, HPLC grade	Fisher Chemical	A998-4
Alexa Fluor 647 anti-mouse CD19 Antibody	BioLegend	115522
anhydrous dimethylsulfoxide	ACROS Organics	AC610420010
barium chloride	ACROS Organics	203135000
Brilliant Blue G-250 Dye	Fisher BioReagents	BP100-50
Cell Prime r-insulin	EMD Millipore	4512-01	Recombinant human insulin for insulin FAA synthesis
Copper (II) sulfate pentahydrate	ACROS Organics	AC197722500
dimethylsulfoxide	Fisher Chemical	S67496
fluorescein isothiocyanate (FITC) isomer 1	Sigma-Aldrich	F7250-1G
Glacial acetic acid	Fisher Chemical	A38-212
Glycerol	ACROS Organics	15892-0010
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
homopropargyl-PLP	Biomatik	NA	Custom synthesis (sequence: homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF; purity: 97.29%)
iodine	Sigma-Aldrich	207772-100G
Methanol, HPLC grade	Fisher Chemical	A452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tetramethyl-rhodamine succimidyl ester), mixed isomer	Thermo Scientific	46406	A commercially available analog of the Rhodamine-B NHS ester used in the paper
PE/Cyanine7 anti-mouse CD3 Antibody	BioLegend	100220
potassium iodide	Sigma-Aldrich	30315
propargyl N-hydroxysuccinimide ester	Sigma-Aldrich	764221
sodium ascorbate	Sigma-Aldrich	A7631
sodium biocarbonate	Sigma-Aldrich	S5761-1KG
sodium dodecyl sulfate	Fisher BioReagents	BP166-100
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Fisher Chemical	S468-500
trifluoroacetic acid	Sigma-Aldrich	302031-10x1mL
Tris base	Fisher BioReagents	BP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine	ClickChemTools	1010-1000
xBridge BEH C18 3.5 um, 4.6 x 150 mm column	Waters	186003034
xBridge BEH C18 5um OBD Prep Column, 19 x 250 mm	Waters	186004021