نموذج ثقافة الخلية Adipocyte لدراسة تأثير البروتين وتعديل الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة Adipocyte

Summary

يقدم هنا بروتوكول لتسليم أوليغونوكليوتيدات مثل الحمض النووي الريبي (siRNA) صغير التدخل ، أو محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (miRs) ، أو الحمض النووي الريبي المضاد للميكروبات (anti-miR) في الخلايا الدهنية الناضجة لتعديل البروتين والتعبير عن الحمض النووي الريبي الدقيق.

Abstract

تغيير وظيفة adipocyte يساهم في الإمراض من أمراض التمثيل الغذائي بما في ذلك مرض السكري من النوع 2 ومقاومة الأنسولين. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. تعديل التعبير عن البروتينات والرنانات الدقيقة في الخلايا الدهنية لا يزال تحديا كبيرا. تصف هذه الورقة بروتوكولا للتمييز بين الخلايا الليفية المورينية إلى خلايا شحمية ناضجة وتعديل التعبير عن البروتينات والحمى الريبية الدقيقة في الخلايا الدهنية الناضجة من خلال العدوى العكسية باستخدام الحمض النووي الريبي الصغير التدخل (siRNA) وتقليد الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد miR) أوليغونوكليوتيدات. يتضمن بروتوكول العدوى العكسي هذا احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مركب في لوحة زراعة الخلية التي تضاف إليها الخلايا الدهنية الناضجة. ثم يسمح للخلايا الشحمية بإعادة ربطها بسطح اللوحة الملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات /ترانسفيكتيون. يمكن إجراء التحليلات الوظيفية مثل دراسة إشارات الأنسولين ، امتصاص الجلوكوز ، تكوين الدهون ، وانحلال الدهون على الخلايا الدهنية الناضجة 3T3-L1 المتحولة لدراسة تأثير التلاعب بالبروتين أو الحمض النووي الريبي الدقيق على وظيفة الخلايا الدهنية.

Introduction

تعتبر السمنة عامل خطر رئيسي للعديد من أمراض التمثيل الغذائي، بما في ذلك مقاومة الأنسولين (IR)، داء السكري من النوع 2 (T2D)، وأمراض القلب والأوعية الدموية¹. وقد فشلت العلاجات الحالية في وقف الانتشار المتزايد باستمرار لهذه الأمراض ، وإدارة الأشعة تحت الحمراء لمرضى السمنة والسكري لا تزال قضية سريرية هامة. الأنسجة الدهنية تلعب دورا حاسما في السيطرة على التوازن الطاقة، وتوسعها المرضي خلال السمنة يساهم في تطوير الأشعة تحت الحمراء و T2D^2،3. وهذا يسلط الضوء على الحاجة إلى فهم أفضل للآلية الجزيئية المشاركة في خلل الخلايا الدهنية لتطوير علاجات جديدة ضد الأمراض المرتبطة بالسمنة. وقد بحثت العديد من الدراسات البحثية دور الحمض النووي الريبي ترميز البروتين في فسيولوجيا الخلايا الدهنية وارتباطها مع السمنة.

وفي الآونة الأخيرة، أدى اكتشاف الرناس غير الترميزي، ولا سيما الرنانات الصغرى، إلى صياغة مفاهيم جديدة تتعلق بآلية تنظيم برامج التعبير الجيني. وقد أظهرت الدراسات أن ncRNAs هي المنظمين المهمين لوظيفة adipocyte، وأن dysregulation بهم يلعب دورا هاما في أمراض التمثيل الغذائي⁴. وبالتالي ، فإن التلاعب بالبروتينات وnCRAS في الخلايا الدهنية أمر بالغ الأهمية لفك أدوارها في وظيفة الخلايا الدهنية وتأثيرها على الأمراض مثل T2D. ومع ذلك ، فإن التلاعب في التعبير عن البروتينات وnCRAS في الجسم الحي وكذلك في الخلايا الدهنية الأولية لا يزال صعبا للغاية ، ويفضل استخدام نماذج الخلايا الدهنية في المختبر.

مورين 3T3-L1 الخلايا الليفية تفرق بسهولة إلى الخلايا الدهنية ناضجة، وظيفية، واستجابة للأنسولين، والتي هي خط الخلية ذات الخصائص الجيدة المستخدمة لدراسة وظيفة adipocyte (على سبيل المثال، إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، انحلال الدهون وإفراز الدهون)⁵،^{6،7،8،9،10}. هذه الخصائص تجعل 3T3-L1 adipocytes نموذجا جذابا لتعديل التعبير عن البروتين الترميز وNNC-RNAs لفك دورها في وظيفة الدهون ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة. لسوء الحظ ، في حين أن الخلايا الليفية 3T3-L1 سهلة التحميب باستخدام الكواشف المتاحة تجاريا ، فإن الخلايا الدهنية 3T3-L1 المتمايزة هي واحدة من أصعب خطوط الخلايا للمتحولين. هذا هو السبب في أن العديد من الدراسات التي تتلاعب بالتعبير الجيني في خلايا 3T3-L1 ركزت على تمايز الخلايا الدهنية بدلا من التركيز على وظيفة الخلايا الدهنية.

لفترة طويلة ، كانت التقنية الفعالة الوحيدة لخلايا الدهون المتحولة هي الكهربورات⁵، وهي مملة ومكلفة ويمكن أن تسبب تلفا في الخلايا. تشير هذه الورقة إلى تقنية عكس العدوى باستخدام كاشف العدوى الشائع ، مما يقلل من الوقت العملي للإصابة ، وليس له أي تأثير على صلاحية الخلية ، وهو أقل تكلفة بكثير من الإلكتربو. هذا البروتوكول مناسب تماما لإصابة سيرنا وغيرها من أوليغونوكليوتيدات مثل محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق (تقليد مير) ومكافحة مير. مبدأ بروتوكول عكس العدوى هو احتضان كاشف العدوى والوليغونوكليوتيدات لتشكيل مجمع في لوحة ثقافة الخلية ومن ثم زرع الخلايا الدهنية الناضجة في الآبار. ثم، إعادة ربط الخلايا الشحمية إلى سطح لوحة ملتصقة في وجود مجمع كاشف أوليغونوكليوتيدات / العدوى. تسمح هذه المنهجية البسيطة والفعالة وغير المكلفة بدراسة دور الحمض النووي الريبي وترميز البروتين وmiRs في وظيفة الخلايا الدهنية ودورها المحتمل في الأمراض المرتبطة بالسمنة.

Protocol

ملاحظة: استخدام تقنيات عقيمة لتنفيذ كافة الخطوات من البروتوكول في غطاء محرك السيارة ثقافة الخلايا تدفق صفح. راجع جدول المواد للحصول على تفاصيل حول جميع الكواشف والمعدات.

1. التمايز من الخلايا الليفية مورين 3T3-L1 في الخلايا الدهنية

1. تنمو الخلايا الليفية 3T3-L1 في أطباق 100 ملم في الثقافة متوسطة-DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ مصل العجل حديثي الولادة، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1A). ضع الأطباق في حاضنة زراعة الأنسجة (7٪ CO₂ و 37 درجة مئوية).
2. بعد يومين من التقاء، تغيير المتوسطة الثقافة، والاستعاضة عن DMEM دون بيروفات، 25 مليون جلوكوز، 10٪ مصل عجل جنيني (FCS)، و1٪ بنسلين وستريبتومايسين مع تكملة 0.25 م 3-إيزابيل-1-ميثيل إكسانثين (IBMX)، 0.25 ميكرومتر ديكساميثازون، 5 ميكروغرام/مل الأنسولين، و10 ميكرومتر روزيجليتازون.
   ملاحظة: يستغرق 5 أيام للوصول إلى التقاء عندما يتم بذر الخلايا في 300،000 خلية لكل طبق 100 ملم.
3. بعد يومين، استبدل الوسط الثقافي ب DMEM بدون بيروفاتي، 25 مليون جلوكوز، 10٪ FCS، و1٪ البنسلين والستريبتوميسين المكمل ب 5 ميكروغرام/مل من الأنسولين و10 ميكرومتر روزيجليتازون واحتضان لمدة يومين. ثم، تغذية الخلايا كل يومين مع DMEM دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين (الشكل 1B).
4. ترانسفيكت الخلايا الدهنية 3T3-L1 7-8 أيام بعد بداية بروتوكول التمايز.
   ملاحظة: من المهم الوصول إلى مستوى عال من التمايز (>80٪) قبل العدوى لتجنب انتشار الخلايا الليفية المتبقية بعد العدوى، مما يؤدي إلى مجموعة مختلطة من الخلايا التي قد تحيز النتائج.

2. إعداد لوحات precoated

1. في اليوم السابق أو قبل ساعات قليلة من العدوى، قم بإعداد محلول من نوع الكولاجين الأول عند 100 ميكروغرام/مل في الإيثانول بنسبة 30٪ من محلول المخزون عند 1 ملغم/مل. أضف 250 ميكرولتر من الكولاجين لكل بئر من طبق من 12 بئرا و125 ميكرولتر لكل بئر من طبق من 24 بئرا ، ونشر المحلول على سطح البئر.
2. اترك الطبق بدون الغطاء تحت غطاء الثقافة حتى يجف الكولاجين. اغسل مرتين مع المالحة المخزنة بالفوسفات في دولبيكو (D-PBS).
   ملاحظة: تتوفر لوحات مسبقة المعطف للشراء.

3. إعداد مزيج العدوى

ملاحظة: التركيز النهائي للsiRNA بين 1 و 100 nM (1 إلى 100 pmol من siRNA لكل بئر من لوحة 12 جيدا). التركيز النهائي لتقليد مير هو 10 nM (10 pmol / جيدا). تحديد أفضل تركيز لكل سيرنا، تقليد مير، أو oligonucleotide أخرى قبل بدء التجربة لتجنب الآثار خارج الهدف. إجراء تجارب العدوى في ثلاثة نسخ لتسهيل التحليل الإحصائي للنتائج. إعداد جميع الكواشف الزائدة لحساب الخسارة العادية أثناء الأنابيب.

1. مزيج عن طريق pipetting (حجم / حجم) سيرنا (أو oligonucleotides أخرى) مع تحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية(الجدول 1). حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
2. إضافة كاشف transfection وتحسين الحد الأدنى من المتوسطة الأساسية إلى siRNA، وماصة لخلط (الجدول 1). حضانة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (خلال هذا الوقت، انتقل إلى القسم 4). أضف مزيج العدوى إلى كل بئر من الطبق المغلف بالكولاجين.

4. إعداد الخلايا الشحمية 3T3-L1

1. غسل الخلايا في طبق بيتري 100 ملم مرتين مع D-PBS. إضافة 5x تريبسين إلى الخلايا (1 مل لكل طبق 100 ملم)، مع التأكد من تغطية كل من السطح مع تريبسين. انتظر لمدة 30 ثانية وإزالة بعناية التريبسين.
2. احتضان طبق بيتري لمدة 5-10 دقائق عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. اضغط على طبق 100 مم لفصل الخلايا.
3. إضافة 10 مل من DMEM دون بيروفاتي, 25 mM الجلوكوز, 10٪ FCS, و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين لتحييد تريبسين. pipet بعناية المتوسط صعودا وهبوطا لفصل الخلايا وتجانس تعليق الخلية.
4. عد الخلايا باستخدام غرفة العد Malassez أو عداد الخلية الآلي، وضبط تركيز الخلايا إلى 6.25 × 10⁵ خلايا / مل من المتوسطة. البذور 800 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 12 جيدا (5 × 10⁵ خلايا) أو 400 ميكرولتر من تعليق الخلية / بئر من لوحة 24 جيدا (2.5 × 10⁵ خلايا) التي تحتوي على مزيج العدوى.
   ملاحظة: طبق بيتري واحد 100 ملم من الخلايا الدهنية سيسمح بإعداد لوحة واحدة من 12 بئرا أو لوحة واحدة من 24 بئرا. طبق 100 ملم يحتوي عادة على 6-7 × 10⁶ adipocytes، والتي تتوافق مع 5 × 10⁵ الخلايا الدهنية لكل بئر من لوحة 12 جيدا.
5. احتضان لوحات في حاضنة ثقافة الخلية (7٪ CO₂ و 37 درجة مئوية)، وعدم إزعاج الخلايا لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي، استبدال بعناية supernatant مع DMEM الطازجة دون بيروفاتي، 25 mM الجلوكوز، 10٪ FCS، و 1٪ البنسلين والستريبتوميسين.
   ملاحظة: من الممكن أيضا زرع الخلايا في لوحات 48-و96-well المطلية بالكولاجين ولكن اتخاذ المزيد من الاحتياطات عند استبدال الوسائط لتجنب انفصال الخلايا الدهنية.

5. التحليل الوظيفي للخلايا الشحمية 3T3-L1 المصابة

1. دراسة الهدف ضربة قاضية 24-48 ساعة و 48-96 ساعة بعد siRNA أو مير تقليد التسليم لرنا والبروتين، على التوالي.
2. إجراء تحليلات وظيفية من الخلايا الدهنية المصابة لدراسة إشارات الأنسولين، امتصاص الجلوكوز، إفراز أديبوكيني، انحلال الدهون، وتولد الدهون.

النتائج

باستخدام إجراء عكس transfection وصفها هنا لتعديل التعبير عن البروتينات أو الحمض النووي الريبي الدقيق في 3T3-L1 adipocytes، وقد ثبت أن الخلايا الدهنية للحفاظ على مورفولوجيا بهم بعد العدوى(الشكل 1B،C). في الواقع ، بعد يومين من العدوى ، كانت الخلايا الدهنية منتشر?...

Discussion

تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا للتمايز وإعادة العدوى بالخلايا الدهنية الناضجة. طريقة العدوى العكسية هذه هي طريقة بسيطة واقتصادية وفعالة للغاية لمضادات الميكروبات مثل ، على سبيل المثال لا الحصر ، siRNAs ، محاكاة الحمض النووي الريبي الدقيق ، ومضادات الحمض النووي الريبي الدقيق إلى خلايا 3T3-L1 ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL