Um modelo de cultura celular adipócito para estudar o impacto da modulação de proteína e micro-RNA na função adipócito

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para fornecer oligonucleotídeos como RNA de pequena interferência (siRNA), imitações de micro-RNA (miRs) ou anti-micro-RNA (anti-miR) em adipócitos maduros para modular proteína e expressão micro-RNA.

Resumo

A alteração da função adipócito contribui para a patogênese de doenças metabólicas, incluindo diabetes tipo 2 e resistência à insulina. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. A modulação da expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos continua sendo altamente desafiadora. Este artigo descreve um protocolo para diferenciar os fibroblastos murinos em adipócitos maduros e modular a expressão de proteínas e micro-RNAs em adipócitos maduros através de transfecção reversa usando RNA de pequena interferência (siRNA) e micro-RNA imitando (miR imitar) oligonucleotídeos. Este protocolo de transfecção reversa envolve a incubação do reagente transfeccionado e dos oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular à qual os adipócitos maduros são adicionados. Os adipócitos são então autorizados a recolocar à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Análises funcionais como o estudo da sinalização de insulina, captação de glicose, lipogênese e lipólise podem ser realizadas nos adipócitos maduros 3T3-L1 transfetípidos para estudar o impacto da manipulação de proteínas ou micro-RNA na função adipócito.

Introdução

A obesidade é considerada um dos principais fatores de risco para inúmeras doenças metabólicas, incluindo resistência à insulina (IR), Diabetes Tipo 2 (T2D) e doenças cardiovasculares¹. As terapias atuais não conseguiram parar o constante aumento da prevalência dessas doenças, e o manejo do IR de pacientes obesos e diabéticos continua sendo uma questão clínica importante. O tecido adiposo desempenha um papel crucial no controle da homeostase energética, e sua expansão patológica durante a obesidade contribui para o desenvolvimento de IR e T2D^2,3. Isso destaca a necessidade de entender melhor o mecanismo molecular envolvido na disfunção adipócito para desenvolver novas terapias contra doenças relacionadas à obesidade. Muitos estudos têm investigado o papel das RNAs de codificação de proteínas na fisiologia adipócito e sua associação com a obesidade.

Mais recentemente, a descoberta de RNAs não codificadas (NCRNAs), especialmente micro-RNAs (miRs), forjou novos conceitos relacionados ao mecanismo de regulação de programas de expressão genética. Estudos têm demonstrado que as NCRNAs são importantes reguladores da função adipócito, e que sua desregulação desempenha um papel importante nas doenças metabólicas⁴. Assim, a manipulação de proteínas e ncRNAs em adipócitos é crucial para decifrar seus papéis na função adipócito e seu impacto em patologias como o T2D. No entanto, manipular a expressão de proteínas e ncRNAs in vivo, bem como em adipócitos primários permanece altamente desafiador, favorecendo o uso de modelos in vitro adipócitos.

Os fibroblastos murine 3T3-L1 se diferenciam facilmente em adipócitos maduros, funcionais e responsivos à insulina, que são uma linha celular bem caracterizada usada para estudar a função adipócito (por exemplo, sinalização de insulina, captação de glicose, lipólise e secreção de adipokines)^5,6,7,8,9,10. Essas propriedades tornam os adipócitos 3T3-L1 um modelo atraente para modular a expressão de codificação de proteínas e nc-RNAs para decifrar seu papel na função adipócite e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade. Infelizmente, enquanto os fibroblastos 3T3-L1 são fáceis de transfetar usando reagentes disponíveis comercialmente, adipócitos 3T3-L1 diferenciados são uma das linhas celulares mais difíceis de transfectar. É por isso que inúmeros estudos que manipulam a expressão genética em células 3T3-L1 têm focado na diferenciação de adipócitos em vez da função adipócito.

Por muito tempo, a única técnica eficiente para transfetálces foi a eletroporação⁵, que é tediosa, cara, e pode causar danos celulares. Este artigo relata uma técnica de transfecção reversa usando um reagente de transfecção comum, que reduz o tempo prático para transfecção, não tem efeito sobre a viabilidade celular, e é muito menos caro do que a eletroporação. Este protocolo é perfeitamente adequado para a transfecção de siRNA e outros oligonucleotídeos, como mímicas micro-RNA (miR mimics) e anti-miRs. O princípio do protocolo de transfecção reversa é incubar o reagente de transfecção e os oligonucleotídeos para formar um complexo na placa de cultura celular e, em seguida, semear os adipócitos maduros nos poços. Em seguida, os adipócitos se recolocarão à superfície da placa aderente na presença do complexo de reagentes oligonucleotídeos/transfecção. Essa metodologia simples, eficiente e barata permite o estudo do papel das RNAs e miRs de codificação proteica na função adipócito e seu potencial papel em doenças relacionadas à obesidade.

Protocolo

NOTA: Use técnicas estéreis para executar todas as etapas do protocolo em uma capa de cultura de célula de fluxo laminar. Consulte Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os reagentes e equipamentos.

1. Diferenciação de fibroblastos murine 3T3-L1 em adipócitos

1. Cresça os fibroblastos 3T3-L1 em pratos de 100 mm em cultura média-DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro 10% recém-nascido e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1A). Coloque os pratos em uma incubadora de cultura de tecidos (7% CO₂ e 37 °C).
2. Dois dias após a confluência, mude o meio de cultura, substituindo-o por DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, soro de bezerro fetal de 10% (FCS) e 1% de penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 0,25 mM 3-Isobutil-1-metilxanthine (IBMX), 0,25 μM dexametasona, 5 μg/mL de insulina e 10 μM rosiglitazone.
   NOTA: Leva 5 dias para atingir a confluência quando as células são semeadas a 300.000 células por prato de 100 mm.
3. Dois dias depois, substitua o meio de cultura por DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina suplementadas com insulina 5 μg/mL e rosiglitazone de 10 μM e incubar por 2 dias. Em seguida, alimente as células a cada 2 dias com DMEM sem piruvato, glicose de 25 mM, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina(Figura 1B).
4. Transfeito os adipócitos 3T3-L1 7-8 dias após o início do protocolo de diferenciação.
   NOTA: É importante atingir um alto nível de diferenciação (>80%) antes da transfecção para evitar a proliferação dos fibroblastos restantes após a transfecção, o que levaria a uma população mista de células que poderiam influenciar os resultados.

2. Preparação de placas pré-revestidas

1. No dia anterior ou poucas horas antes da transfecção, prepare uma solução de colágeno tipo I a 100 μg/mL em 30% de etanol a partir de uma solução de estoque a 1 mg/mL. Adicione 250 μL de colágeno por poço de uma placa de 12 poços e 125 μL por poço de uma placa de 24 poços, e espalhe a solução sobre a superfície do poço.
2. Deixe a placa sem a tampa sob o capô da cultura até que o colágeno seque. Lave duas vezes com o soro fisco tamponado de Fosfato de Dulbecco (D-PBS).
   NOTA: As placas pré-revestidas estão disponíveis para compra.

3. Preparação da mistura de transfecção

NOTA: A concentração final de siRNA é entre 1 e 100 nM (1 a 100 pmol de siRNA por poço de uma placa de 12 poços). A concentração final da mímica miR é de 10 nM (10 pmol/bem). Determine a melhor concentração de cada siRNA, miR mimic ou outro oligonucleotídeo antes de iniciar o experimento para evitar efeitos fora do alvo. Realizar experimentos de transfesão em triplicado para facilitar a análise estatística dos resultados. Prepare todos os reagentes em excesso para explicar a perda normal durante a pipetação.

1. Misture por pipetação (volume/volume) o siRNA (ou outros oligonucleotídeos) com um meio essencial mínimo melhorado(Tabela 1). Incubar por 5 minutos em temperatura ambiente.
2. Adicione o reagente de transfecção e o meio mínimo essencial melhorado ao siRNA e a pipeta para misturar(Tabela 1). Incubar por 20 min em temperatura ambiente (durante este tempo, proceda à seção 4). Adicione a mistura de transfecção a cada poço da placa revestida de colágeno.

4. Preparação dos adipócitos 3T3-L1

1. Lave as células na placa de Petri de 100 mm duas vezes com D-PBS. Adicione 5x trypsin às células (1 mL por prato de 100 mm), certificando-se de cobrir toda a superfície com o trypsin. Aguarde por 30 s e remova cuidadosamente o trippsin.
2. Incubar a placa de Petri por 5-10 min a 37 °C na incubadora. Toque na antena de 100 mm para desprender as células.
3. Adicione 10 ml de DMEM sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% DE FCS e 1% penicilina e estreptomicina para neutralizar a trippsina. Tubo cuidadosamente o meio para cima e para baixo para desacopr as células e homogeneizar a suspensão celular.
4. Conte as células usando uma câmara de contagem de Malassez ou um contador celular automatizado, e ajuste a concentração das células para 6,25 x 10⁵ células/mL de médio. Semente 800 μL da suspensão/poço da célula de uma placa de 12 poços (5 x 10⁵ células) ou 400 μl da suspensão/poço da célula de uma placa de 24 poços (2,5 x 10⁵ células) contendo a mistura de transfecção.
   NOTA: Uma placa de Petri de 100 mm de adipócitos permitirá a preparação de uma placa de 12 poços ou uma placa de 24 poços. Um prato de 100 mm geralmente contém 6-7 x 10⁶ adipócitos, que correspondem a 5 x 10⁵ adipócitos por poço de uma placa de 12 poços.
5. Incubar as placas em uma incubadora de cultura celular (7% CO₂ e 37 °C), e não perturbe as células por 24 h. No dia seguinte, substitua cuidadosamente o supernaente por DMEM fresco sem piruvato, 25 mM de glicose, 10% FCS e 1% penicilina e estreptomicina.
   NOTA: Também é possível semear as células em placas de 48 e 96 poços revestidas de colágeno, mas tomar mais precauções ao substituir a mídia para evitar o descolamento dos adipócitos.

5. Análise funcional de adipócitos 3T3-L1 transfeinados

1. Meta de estudo knockdown 24-48 h e 48-96 h após siRNA ou miR imitam a entrega para mRNA e proteína, respectivamente.
2. Realizar análises funcionais de adipócitos transfectados para estudar sinalização de insulina, captação de glicose, secreção de adipokine, lipólise e lipogênese.

Resultados

Utilizando-se o procedimento de transfecção reversa descrito aqui para modular a expressão de proteínas ou micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, os adipócitos têm mostrado preservar sua morfologia após a transfecção (Figura 1B,C). De fato, 2 dias após a transfecção, os adipócitos foram bem espalhados e ligados à placa e apresentaram gotículas lipídicas multiloculares que são uma característica de adipócitos 3T3-L1 maduros. O te...

Discussão

Este artigo apresenta um protocolo detalhado para a diferenciação e transfecção de adipócitos maduros. Este método de transfecção reversa é um método simples, econômico e altamente eficiente para transfetar oligonucleotídeos como, mas não se limitando a, siRNAs, imitações de micro-RNA e anti-micro-RNAs em adipócitos 3T3-L1, que é uma das linhas celulares mais difíceis de transfeito. Este método tem algumas limitações que precisam ser consideradas. Este protocolo não é eficiente para transfecção c...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well Tissue Culture Plate	Dutscher	353043
2.5% Trypsin (10x)	Gibco	15090-046	diluted to 5x with D-PBS
2-Propanol	Sigma	I9516
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich	D5879
Accell Non-targeting Pool	Horizon Discovery	D-001910-10-05
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A7030
Collagen type I from calf skin	Sigma-Aldrich	C8919
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D1756
D-PBS	Gibco	14190144
Dulbecco's  Modified Eagles's Medium (DMEM)	Gibco	41965062	4.5 g/L D-Glucose; L-Glutamine; no Pyruvate
Ethanol	Sigma	51976
FAM-labeled Negative Control si-RNA	Invitrogen	AM4620
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
Free Glycerol Reagent	Sigma-Aldrich	F6428
Glycerol Standard Solution	Sigma-Aldrich	G7793
HSP90 antibody	Santa Cruz	sc-131119	Dilution : 0.5 µg/mL
Improved Minimal Essential Medium (Opti-MEM)	Gibco	31985-047
Insulin, Human Recombinant	Gibco	12585-014
miRIDIAN micro-RNA mimics	Horizon Discovery
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004
miScript II RT Kit	Qiagen	218161
miScript Primer Assays Hs_RNU6-2_11	Qiagen	MS00033740
miScript Primer Assays Mm_miR-34a_1	Qiagen	MS00001428
miScript SYBR Green PCR Kit	Qiagen	219073
Newborn Calf Serum	Gibco	16010-159
Oil Red O	Sigma	O0625
ON-TARGETplus Mouse Plin1 si-RNA SMARTpool	Horizon Discovery	L-056623-01-0005
Penicillin and Streptomycin	Gibco	15140-122
Perilipin-1 antibody	Cell Signaling	3470	Dilution : 1/1000
Petri dish 100 mm x 20 mm	Dutscher	353003
PKB antibody	Cell Signaling	9272	Dilution : 1/1000
PKB Phospho Thr308 antibody	Cell Signaling	9275	Dilution : 1/1000
Rosiglitazone	Sigma-Aldrich	R2408
Transfection reagent (INTERFERin)	Polyplus	409-10
α-tubulin antibody	Sigma aldrich	T6199	Dilution : 0.5 µg/mL
Vamp2 antibody	R&D Systems	MAB5136	Dilution : 0.1 µg/mL